Uji Kualitatif Protein
Maulana Malik1, Rizky Aprizal1, Eka Syafiqa1, Hushila Alfi Bahalwan1, Amelia Rakhmaniar1, Sukma Chintya Cahyarani1 1
Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta Jl. Ir. H. Juanda No. 95 Ciputat, Jakarta 15412 Telp : (021) 7401925
Abstrak Uji kualitatif protein dilakukan untuk mengetahui kadar atau perhitungan secara kuantitatif protein pada suatu bahan menggunakan metode-metode kualitatif protein. Uji yang dilakukan adalah uji adanya unsur C,H,O, uji adanya unsur N dan S, uji kelarutan protein dengan garamgaram anorganik, logam. Selain itu uji yang dilakukan untuk mengetahui kadar protein dalam bahan adalah uji biuret, uji ninhidrin, uji xantoproteat, dan uji titik isoelektrik. Bahan yang digunakan adalah albumin, BSA, kasein, glisin, gelatin. Hasil yang ditunjukan pada praktikum menunjukan beberapa bahan positif terhadap uji-uji tersebut. Beberapa reaksi menunjukan hasil positif dengan timbulnya endapan, adanya perubahan warna, ada unsur bau khas seperti belerang. Kata kunci: Kualitatif protein, BSA
1. PENDAHULUAN Protein merupakan komponen utama dalam semua sel hidup, baik tumbuhan maupun hewan. Pada sebagian besar jaringan tubuh, protein merupakan komopunen utama terbesar selain air. Lebih dari 50 % berat kering sel terdiri atas protein. Protein adalah senyawa organik yang tersusun dari monomer-monomer asam amino yang saling berinteraksi melalui ikatan peptida. (Sumarlin, 2013) Berdasarkan fungsi protein dibedakan menjadi:
biologisnya,
a. Enzim ( Biokatalisator dalam proses metabolisme)
b. Protein pengangkut (hemoglobin) c. Antibodi (immunoglobulin) d. Protein pengatur /hormon (insulin) e. Protein struktural (Keratin, kolagen) f. Protein kontraktil (myosin) g. Protein nutrient ( ovalbumin) Sedangkan berdasarkan strukturnya, protein digolongkan menjadi : a. Protein fiber/serat: Protein yang tidak larut dalam air, fleksibel dan lentur. Contohnya keratin pada rambut, kolagen pada
tulang rawan dan fibroin pada benang sutra. b. Protein globular: Protein yang mudah larut dalam air dan bersifat tidak stabil (mudah terdenaturasi oleh pengaruh suhu, pH, atau garam anorganik.)
menurut struktur kimianya (alifatik, aromatic, heterosiklik) atau menurut gugus R-nya. Secara biokimia pembagian menurut gugus R lebih memberi arti sebab menunjukan polaritas gugus R yang sangat penting dalam menentukan fungsi asama amino dalam protein. (Raymond, 2008)
Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. (poedjiadi, 1994)
Protein adalah senyawa organik yang tersusun dari monomer-monomer asam amino yang saling berinteraksi melalui ikatan peptida. Untuk mengidentifikasi keberadaan ikatan-ikatan dalam molekul dapat digunakan pereaksi biuret, diama ion Cu2+ dalam suasana basa akan bereaksi dengan ikatan-ikatan peptida membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Reaksi biuret positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas dab dipeptida. (Hermantu, 2013)
Berat molekul protein sangat besar (ribuan sampai jutaan Dalton) sehingga merupakan senyawa makromolekuler. Protein akan dihidrolisis oleh penambahan asam, basa, atau oleh kerja enzim protease yang akan memecah molekul protein menjadi asam-asam amino. (Poedjiadi, 1994) Molekul protein mempunyai gugus amina (-NH2) dan gugus karboksil (-COOH) pada salah satu ujung rantainya. Hal ini menyebabkan protein bersifat amfoter sehingga dapat bereaksi dengan asam maupun basa. Dalam pH rendah, gugus amino pada protein akan bereaksi dan ion H+ menjadi –NH3+ sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya dalam suasana basa, gugus karboksilnya akan bereaksi dengan ion OH- sehingga protein bermuatan negatif. (Bintang, 2010) Pada akhir tahun 1880, telah diidentifikasi bahwa unit protein yang terkecil adalam asam-α-amino. Asam amino yang terdapat di alam ada berates-ratus jumlahnya, namun yang diketahui ikut membangun protein hanya sekitar 20-21 macam. Asam amino ini dapat dibagi
Semua asam amino atau peptide yang mengandung asam-α-amino bebas akan bereaksi degan ninhidrin membentuk senyawa kompleks berwarna biru. Namun demikian, prolin dan hidroksi prolin akan menghasilkan senyawa berwarna kuning.
Jika protein mengandung asam-asam amino aromatic yang memiliki cincin seperti tirosin, fenilalanin, dan triptofan ditambahkan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk endapan putih yang akan berubah menjadi kuning jika dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan teroksidasi dan selanjutnya berubah menjadi jingga.
2. METODE PRAKTIKUM 1. Uji Kualitatif protein 1 Material Material atau bahan yang digunakan adalah larutan BSA 1%, putih telur (albumin 5:50), gelatin, larutan NaOH 10%, larutan 40%, HCL 10%, HCL pekat, Alkohol 96%, Kloroform, Pb asetat 5%, larutan (NH4)2 SO4 jenuh, larutan NaCl 5%, larutan BaCl 5%, larutan CaCl2 5%, larutan MgSO4 5%, larutan HgCl2 5%, larutan CuSO4 5%, larutan CuSO4 0,2%. Instrumentasi Praktikum ini menggunakan tabung reaksi, penjepit tabung, alat pemanas listrik, can porselen, dan gelas objek. Prosedur Praktikum a. Uji adanya unsur C,H,O Sebanyak 1 ml larutan albumin telur dimasukkan ke dalam cawan porselen. Kemudian pada bagian atasnya ditaruh kaca objek dan dipanskan. Lalu perhatikan adanya pegembunan pada gelas objek, yang menunjukan adanya hydrogen (H) dan oksigen (O). kemudian diamati sisa pemanasan pada cawan porselen /kaca objek, bila terjadi pengarangan, berarti terdapat unsur karbon (C). Percobaan diualangi menggunakan serbuk gelatin. b. Uji adanya unsur N
Sebanyak 1 ml larutan albumin dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sebanyak 1 ml NaOH 10% ditambahkan dan dipanaskan. Kemudian perhatikan bau amoniak yang teradi dan kemudian diujilah uapnya dengan kertas lakmus merah yang telah dibasahi aquades. Kemudian jika kertas lakmus merah menjadi biru dan tercium ammonia maka menandakan adanya unsur nitrogen (N). Setelah itu percobaan diulangi menggunakan serbuk gelatin. c. Uji adanya unsur S Sebanyak 1 ml larutan albumin dimasukkan kedalam tabung reaksi. Lalu sebanyak 1 ml NaOH ditambahkan dan dipanaskan. Lalu sebanyak 4 tetes larutan Pb-asetat 5% ditambahkan. Jika larutan menghitam, berarti PbS terbentuk. Lalu sebanyak 4 tetes HCL pekat ditambah dengan hati-hati. Lalu diperhatikan bau khas belerang dari belerang yang teroksidasi. Percobaan diulangi menggunakan serbuk gelatin. d. Uji kelarutan protein Sebanyak 5 tabung reaksi yang kering dan bersih disiapkan. Lalu HCL 10%, air suling, NaOH 40%, alkhol 96% dan kloroform dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi. Lalu sebanyak 2 ml larutan albumin ditambahkan ke setiap tabung. Kemudian dikocok dengan kuat dan diamati sifat kelarutannya. Percobaan diulang dengan menggunakan serbuk gelatin. e. Uji pengendapan protein dengan garam Sebanyak 5 tabung reaksi yang bersih dan kering disiapkan dan masing-masing diberi 2 ml larutan albumin. Lalu pada masingmasing tabung ditambahkan secara berturutturut larutan NaCl 5%, BaCl 5%, CaCl2 5%, MgSO4 5%, dan (NH4)2SO4 jenuh setetes demi setetes sampai timbul endapan. Selanjutnya larutan garam secara berlebih
ditambahkan. Lalu tabung dikocok dan perubahan yang terjadi diamati. f. Uji pengendapan protein dengan logam Sebanyak 3 tabung reaksi yang kering dan bersih disiapkan dan diisi masing-masing 2 ml larutan albumin. Selanjutnya secara berturut-turut larutan CuSO4 5%, HgCl 5%, Pb-asetat 5% ditambahkan pada masingmasing tabung. Lalu tabung dikocok dan perubahan yang terjadi diamati. 2. Uji kualitatif Protein 2 Material Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum uji kualitatif protein II adalah larutan BSA 2%, glisin 2%, gelatin 2%, kasein 0.5%, larutan NaOH 10%, larutan CuSO4 0,2%, larutan HNO3 pekat, dan buffer asetat dengan pH: 3.8, 4.7, 5.0, 5.3, 5.9
2. Uji Ninhidrin Sebanyak 4 tabung reaksi yang bersih dan kering disiapkan. Lalu sebanyak 2 ml larutan BSA, gelatin, dan glisin dimasukkan. pada masing-masing tabung. Kemudian pada setiap tabung ditambahakan 5 tetes pereaksi ninhidrin. Lalu larutan dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit. Perubahan warna yang terjadi diamati dan dicatat pada lembar pengamatan. 3. Uji Xantoproteat Sebanyak 4 tabung reaksi yang kering dan bersih disiapkan. Lalu sebanyak 2 ml larutan BSA, gelatin, dan glisin dimasukkan ke dalam tabung. Pada setiap tabung ditambahkan 1 ml HNO3 pekat. Lalu diamati terbentuknya endapan putih. Kemudian larutan dipanaskan selama 1 menit dan warna endapan yang terbentuk diamati. Lalu larutan didinginkan dibawah air kran,
Instrumentasi Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, penjepit tabung, pemanas listrik, beaker glass 500 ml, pipet ukur, dan pipet tetes. Prosedur praktikum 1. Uji Biuret Sebanyak 4 tabung reaksi yang kering dan bersih disiapkan. Lalu sebanyak 2 ml larutan BSA, kasein, gelatin dan glisin dimasukkan ke dalam masing-masing tabung. Kemudian pada setiap tabung ditambahkan 1 ml NaOH 10% dan 3 tetes CuSO4 0,2%. lalu dikocok dengan baik dan diamkan beberapa saat. Diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat di lembar pengamatan.
kemudian ditambahkan NaOH 10% setets demi setetes memlalui dinding tabung hingga terbentuk 2 lapisan. Perubahan warna yang terjadi diperhatikan. 4. Uji Penentuan Titik Isoelektrik Sebanyak 5 tabung reaksi yang kering dan bersih disiapkan. Lalu pada setiap tabung
ditambahakan 1 ml larutan kasein. Setelah itu pada setiap tabung ditambahkan larutan buffer asetat dari 3.8, 4.7, 5.0, 5.3, dan 5.9. larutan dicampur dengan baik dan dicatat kekeruhannya setelah 0, 10, hingga 30 menit. Lalu diperhatikan pada tabung mana yang terbentuk endapan paling maksimal. Lalu semua tabung dipanaskan di penagas air. Kemudian diamati hasilnya. (pembentukan endapan yang tercepat dan terbanyak menunjukan pH isoelektrik. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Uji kualitatif protein 1 1. Uji adanya unsur C,H,O Proses pemanasan pada albumin dan gelatin menunjukan adanya unsur H dan O yang diamati dengan timbulnya uap air pada kaca objek. Selain itu, pemanasan albumin dan gelatin akan menimbulkan pengarangan yang menandakan adanya unsur C pada albumin dan gelatin. Proses pengarangan tersebut menimmbulkan adanya kerak berwarna kehitaman.
2. Uji adanya unsur N Unsur N berikatan dengan dengan NaOH dan menghasilkan ammonia dengan bau yang khas ketika dipanakan. Oleh karena unsur N berikatan dengan NaOH, larutan akan bersifat basa dan dapat membirukan kertas lakmus merah. 3. Uji adanya unsur S
Selanjutnya adalah albumin menunjukan hasil positif belerang yang ditandai dengan adanya endapan Pb dan timbul bau khas belerang. Hal ini dikarenakan albumin memiliki gugus sistin dan metioni dimana keduanya merupakan asam amino yang mengandung gugus belerang. Penambahan NaOH berfungsi untuk memtus ikatan S, sehingga S dapat berikatan dengan Pb asetat membentuk endaoan PbS. Adanya gugus S yang terpecah menghasilkan bau khas belerang. Pada gelatin, protein oenyusunnya adalah glisin dan prolin sehingga tidak memiliki gugus S dan negative terhadapa uji unsur S.
4. Uji kelarutan protein Albumin dan gelatin larut dala pelarut polar dikarenakan albumin dan gelatin bersifat polar. Keduanya tidak dapat larut di dalam kloroform dikarenakan kloroform termasuk kedalam senyawa non polar. Seperti yang telah dijelaskan pada teori like dissolve like, bahwa pelarut polar hanya bisa melarutkan larutan ionic dan larutan polar, sementara pelarut nonpolar hanya bisa melarutkan larutan non polar. Selain itu asam amino mempunyai gugus asam dan basa sehingga asam amino mempunyai sifat amfoter, yanitu dapat bereaksi dengan asam dan basa. Bila asam amino dalam suasana basa ditempatkan dalam medan listrik, maka asam amino aka n bergerak kearah anoda (elektroda positif). Sebaliknya jika dalam suasana asam, asam amino aka mergerak kearah katoda(elektroda negatif).
5. Uji pengendapan dengan garam Albumin yang direksikan dengan garam, maka akan menimbulkan adanya endapan. Perbedaan kuantitas endapan yang terjadi disebabkan oleh intensitas garam yang direksikan dan jenis garamnya. Semakin banyak yang direaksikan, maka endapan yang dihasilkan akan semakin banyak. Peristiwa ini sesuai dengan metode salting in dimana metode ini dilakukan dengan menambahkan garam yang tidak jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan penigkatan konsentrasi garam. Apabila konsentrasi garam ditingkatkan terus, maka kelarutan
protein akan turun, pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, protein akan mengendap. Pengendapan ini disebut salting out karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Ion garam yang memiliki tingkat densitas lebih tinggi dibandingkan dengan protein. Kadar albumin yang direasikan juga. mempengaruhi proses pengendapan protein 6. Uji pengendapan protein dengan logam Protein juga dapat diendapkan oleh logam. Pengendapan ini terjadi karena ion-ion logam berat membentuk garam proteinat yang tidak larut dalam air. Pengendapan ini terjadi karena adanya reaksi oenetralan muatan antara ion logam berat dengan anion dari protein. Albumin dan gelatin masingmasing ditambahkan larutan CuSO4, HgCl2, dan Pb-asetat. Larutan protein pada titik isoelektriknya memiliki kutub negative dan positf dengan perbandingan yang sama. Endapan putih yang dihasilkan dari HgCl2 dan Pb-asetat serta warna biru muda dari CuSO4 merupakan hasil dari reaksi penetralan muatan antara ion logam berat sebagai kation dengan molekul protein sebagai anion. Suasan pada larutan menjadi lebih asam, sehingga protein akan mengkondisikan diri sebagai basa dan sebagian terdapat sebagai anion. Anion dari protein inilah yang bereaksi dengan ion logam yang berekasi dengan ion logam berat membentuk gara proteinat. Berdasarkan sifat albumin yang bereaksi dengan ion logam, tubuh manusia dapat menggunakan sifat ini untuk melakukakn proses detoksifikasi. 2. Uji kualitatif protein 2 1. Uji Biuret NO
Zat Uji
1 2
BSA Kasein
Hasil Uji (+/-) warna simpulan Ungu + Ungu +
3 4
Gelatin Glisin
Ungu Biru
2. Uji Ninhidrin
+ -
Berdasarkan pengamatan di atas, reaksi yang menunjukan hasil positif adalah BSA 2%, kasein 0.5%, dan gelatin 2%. Sementara pada glisin 2% menunjukan hasil negative. Pereaksi biuret mengandung ion-ion Cu2+ yang akan berikatan bila bertemu dengan protein yang mempunyai 2 ikatan peptide atau lebih. Reaksinya adalah :
Ketika dtambahakan larutan CuSO4 0,2%, maka ion-ion Cu2+ akan berikatan dengan proein yang memiliki dua ikatan atau lebih peptide dan menghasilkna kondisi basa. Pada saat penambahan NaOH, larutan berubah menjadi alkalis. Warna ungu yang dihasilkan berasal dari Cu2+ yang beraksi dengan NH dari ikatan peptoda serta O dari air. Hasil negative pada glisin dikarenakan glisin merupaka asam amino esensial tunggal dengan rumus bangun NH2-CO2H. Sementara albumin, kasein dan gelatin menmpunyai dua atau lebih asam amino esensial sehingga terbentuk ikatan peptide. Pada dipeptide, hasil negative juga ditunjukan karena N mengikat dua unsur sehingga sulit untuk bereaksi dengan Cu2+.
NO
Zat Uji
1 2 3 4
BSA Kasein Gelatin Glisin
Hasil Uji (+/-) warna Simpulan Biru tua + Biru + Biru tua + Biru tua +
Semua sampel menunjukan hasil positif uji ninhidrin dengan menunjukan warna biru pada larutan. Hal ini menunjukan adanya asam-α-amino bebas. Asam amino bebas adalah asam amino dimana gugus aminonya tidak terikat. Semua asam amino bereaksi dengan triketonhidrindena (ninhidrin) untuk membentuk aldehida yang lebih kecil dengan membebaskan karbon dioksida, ammonia, dan menghasilkan warna biru violet (untuk prolin dan hidroksiprolin dihasilkan warna kuning). Senyawa – senyawa ammonium kuat, senyawa amin, sebagian besar peptide, dan protein bereaksi dengan jalur yang sama, walaupun tidak menghasilkan karbon dioksida dan ammonia. Reaksi asam amino dengan ninhidrin :
Semakin pekat warna dari larutan, maka jumlah asam amino bebas pada protein tersebut semakin banyak. 3. Uji Xantoproteat NO
Zat Uji
Hasil Uji (+/-) warna Simpulan
1 2 3 4
BSA Kasein Gelatin Glisin
Kuning Kuning Kuning Kuning
+ + + -
Reaksi yang menunjukan positif pada BSA 2%, kasein 0,5%, dan gelatin 3% dengan menunjukan warna kuning. Sementara untuk glisin 2% tidak menunjuka hasil positif. Pada reaksi xantoproteat reaksi menghasilkna nitrasi dan inti benzena dalam molekul protein. Tirosin, fenilalanin, dan triptofan memberi hasil positif terhadap reaksi ini karena memiliki cincin aromatic yang bereaksi dengan asam nitrat pekat bia dipanaskan. Senyawa nitro yang yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga. Salah satu reaksi pada uji xantoproteat adalah:
Fungsi HNO3 pada uji xantoproteat adalah untuk memecah protein menjadi gugus benzene. Penambahan NaOH mendukung suasana basa yang memudahkan proses ionisasi senyawa nitro. Adanya pemanasan pada larutan mempercepat proses uji untuk menghasilkan warna kuning. 4. Uji penentuan titik isoelektrik Sebelum dipanaskan Tabung
pH buffer
Hasil ( +/-) endapan Simpulan
1 3,8 Menit 10 2 4,7 Menit 31 3 5,0 Menit 24 4 5,3 Menit 10 5 5,9 Menit 27 Sesudah dipanaskan Tabung 1 2 3 4 5
pH buffer 3,8 4,7 5,0 5,3 5,9
++++ ++ ++ +++ +
Hasil ( +/-) endapan simpulan Menit 2 ++++ Menit 2 ++++ Menit 5 +++ Menit 8 + Menit 7 +
Pada pH 3.8 terjadi endapan yang paling banyak ketika sebelum dipanaskan. Pada saat dipanaskan atau setelah dipanaskan, pada Ph 3.8 dan 4.7 menghasilkan endapan yang paling banyak. Ketika jumlah muatan positif dan negative jumlahnya sama atau netral, maka protein akan mengalami koagulasi. Pada titik isoelektrik terdapat keseimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion dan kation. Tetapi sebagian besar molekul asam amino terdapat dalam bentuk ion amfoter dan hanya sedikit sekali yang terdapat dalam bentuk kation dan anion dalam jumlah yang sama. (Raymond, 2008) Ketika jumlah muatan sama dengan nol, maka protein akan mengalami koagulasi sehingga protein akan mengendap. Hal ini sering dilakukan untuk memisahkan atau menghitung kadar protein dari suatu bahan.
Pemanasan pada beberapa uji sangat penting untuk dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik penelitian. Jakarta. Erlangga 4. SIMPULAN 1. Uji kualitatif protein 1 Unsur penyusun protein adalah C,H,O,N dan S. Protein dapat larut dalam air karena keduanya sama-sama bersifat polar. Protein juga dapat larut dalam larutan asam dan basa karena protein bersifat amfoter. Protein tidak larut dalam pelarut nonpolar. Protein dapat mengendap melalui penambahan garamgaram anorganik dengan metode sating in dan salting out. Penambahan ion-ion logam pada protein menyebabkan protein mengendap dengan membentuk garam proteinat. Pengaru parameter fisik seperti pH, suhu, dan konsentrasi sangat berpengaruh terhadap uji kualiatit protein. 2. Uji kualitatif protein 2 BSA 2%, kasein 0,5%, gelatin 2% menunjukan hasil positif uji biuret karena larutan tersebut memiliki 2 ikatan peptida atau lebih dengan menunjukan warna ungu. Pada uji ninhidrin, semua sampel menunjukan hasil positif. Ini menandakan adanya asam α amino bebas pada semua sampel dengan menunjukan warna biru violet pada larutan. Pada uji xantoproteat, larutan BSA, kasein, gelatin menunjukan hasil positif dan glisin menunjukan hasil negative. Hasil positif menunjukan warna kuning. Titik isoelektrik yang menghasilkan endapan paling banyak berada di pH 3,8 dan 4,7. (Bintang, 2010)
Chang, Raymond. 2008. Kimia Dasar 2. Jakarta: Erlangga Hermanto. 2013. Penuntuk Praktikum Biokima 1. Laboratorium Kimia UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Poedjiadi. 1994. Dasar-dasar Biokima. UI press Riswiyanto. 2009. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga Sumarlin. 2013. Biokimia. Dasar-dasar biomolekul dan konsep metabolisme. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
