Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Biotecnología microbiana y microbiología industrial
Vitamina B12 Grupo:9QV1 Integrantes: De la Cruz Franco Brenda Lesly Resendiz Rojas Rosa Bibiana Uribe Pérez Kendra Denisse Morales Moreno R. Josafat Equipo:6
Introducción La vitamina B12 también conocida como cobalamina es un compuesto hidrosoluble y termolábil que pertenece a la familia de corrinoides, estos contienen un grupo de corrina el cual está constituido por 4 anillos pirrólicos formando un grupo macrocíclico casi planar en torno a un átomo central de cobalto, este último se encuentra unido a un nitrógeno de cada anillo pirrólico. Perpendicular al núcleo de corrina se encuentra unido un núcleo benzimidazólico por un enlace covalente a través de una fosforribosa con uno de los restos propiónicos de uno de los pirroles. Por último, en la parte superior del núcleo de corrina pueden estar unidos ligandos dando origen a las distintas formas de cobalamina: un ión cianuro (cianocobalamina), un grupo hidroxilo (hidroxicobalamina), un grupo metilo (metilcobalamina) o bien un resto de 5-desoxiadenosilo (desoxiadenosil cobalamina) (Figura 1).1,2
La cianocobalamina hidroxicobalamina son formas fisiológicas de la cobalamina, es el organismo donde pasan a forma activa (metil y desoxiadenosilcobalamina).1
e no en su 5-
Esta vitamina tiene diversas funciones en el organismo por ejemplo, interviene en la síntesis de Figura 1. Estructura química de la DNA, RNA y proteínas en conjunto vitamina B12. con el ácido fólico, formación de glóbulos rojos, síntesis de mielina, síntesis de neurotransmisores, obtención de energía a partir de ácidos grasos e inducció n de síntesis de ácidos grasos. 1
Antecedentes Esta vitamina fue la última en ser descubierta, tuvo gran importancia y auge en la ciencia a partir de 1920 debido a las investigaciones de George Hoyt Whipple, George Richards Minot y W. Murphy ya que descubrieron que la ingesta diaria de hígado crudo restablecía el número de eritrocitos en pacientes con anemia perniciosa, sin embargo el consumir el hígado de esta manera resultaba desagradable para algunos pacientes por lo que E.Cohn y G.Minot obtuvieron un “preparado G” , un concentrado de hígado que era más cómodo de ingerir
poSteriormente las industrias farmacéuticas como Bayer eliminaron proteínas, lípidos , etc del extracto para poder administrarlo vía parenteral. 3
En 1929 el Dr.W. Castle demostró que los pacientes con anemia perniciosa al consumir carne con el contenido gástrico de un sujeto sano se aliviaba los síntomas que presentaban, esto sugirió que en la dieta había un factor extrínseco que interaccionaba con un factor intrínseco presente en el estómago para dar un factor hematopoyético. Las investigaciones de Karl Folkers y Lester Smith tuvieron como resultado la obtención de cristales rojos de vitamina B12. Dorothy Crowfoot público la estructura de la vitamina siendo esta descubierta a través de difracción de rayos X y finalmente en 1972 se llevó a cabo la síntesis química por Robert Burns Woodward y Albert Eschenmoser, sin embargo su producción por este método es complejo ya que requiere de 70 etapas de reacción por lo que se volvió más factible su obtención por biosintesis cuando en estudios anteriores (en 1948) Karl Folkers describió que cepas de Streptomyces eran capaces de producir a la vitamina B12 por lo que esto implicó una ventaja en su obtención. 3,4
Fuentes de obtención En general la cantidad de vitamina B12 presente en alimentos es poca, siendo la principal fuente natural aquellos de origen animal, aunque están en concentraciones demasiado bajas para su uso en la producción industrial. Por otro lado los vegetales son alimentos que no contienen vitamina B12 aunque en algunos pueden presentarse en pequeñas cantidades de la misma como consecuencia de la producción de algunos microorganismos que se encuentran en simbiosis con las raíces de las plantas o por bacterias intestinales que pueden contaminar el alimento. Las bacterias intestinales pueden producir Vitamina B12 pero la mayoría se encuentran en el colon, por lo tanto distales al íleon , lugar donde se absorbe por lo que la cantidad producida de la vitamina no puede ser absorbida. 5,6 Con base a lo que se mencionó anteriormente, las bacterias y arqueas son los organismos productores de vitamina B12 mientras que los animales y plantas son incapaces de producirla. 7
Microorganismos productores de Vitamina B12 Después de diversas investigaciones fue posible la síntesis química de la vitamina B12 por Woodward y Eschenmoser en 1973, la cual no era conveniente para la industria debido a la dificultad que representaba el que hecho de requerir 70
reacciones para obtener la vitamina lo que implicaba un mayor costo. Hoy en dia se produce la vitamina por fermentación usando diversos microorganismos. 3 Actualmente se conoce que los microorganismos que se encuentran en suelo, agua, plantas o bien, colonizando el intestino de animales pueden tener la capacidad de producir vitamina B12 y pertenecen a los siguientes géneros: Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas,Rhizobium, Salmonella, Serratia, Streptomyces, Streptococcus, Xanthomonas y Klebsiella.8,9
La producción industrial de vitamina B12 se realiza a través de la fermentación por por bacterias principalmente Pseudomonas dinitrificans , Propionibacterium shermanii , Propionibacterium freudenreichii o Sinorhizobium meliloti .8 Para mejorar los rendimientos en la producción de vitamina B12 se ha realizado la mutación aleatoria a través de diferentes agentes mutagénicos como la luz UV, etilemina, nitrosometiluretano, etc, posteriormente la elección de las cepas es con base a la productividad de las mismas, estabilidad genética, tasas de crecimiento razonables y resistencia a altas concentraciones de intermediarios tóxicos presentes en el medio.8 Otros microorganismos descritos como productores de esta vitamina son los metanógenos como Methanosarcina ya que los microorganismos que se utilizan actualmente presentan algunas desventajas, por ejemplo Propionibacterium es productor intracelular de la vitamina, excreta ácido acético y propiónico lo cual causa inhibición en la producción, en cambio Methanosarcina es capaz de excretar la vitamina al medio, es fácil de mantener en metanol, el metano no inhibe el crecimiento y el metanol es relativamente barato lo cual lo hace atractivo para los procesos industriales, sin embargo el crecimiento de estos microorganismos es más lento.10
Condiciones de fermentación Las condiciones fermentativas dependen del microorganismo seleccionado para la producción de vitamina B12, como consecuencia los requerimientos en cuanto a temperatura,pH y concentración de oxígeno varía en cada uno. Se ha reportado que el medio de cultivo debe contener oligoelementos esenciales para la producción de cobalaminas, el cobalto es uno de ellos y se requiere a una concentración de 5-100 mg/L, también puede ser adicionado el 5,6dimetilbenzimidazol (DBI) a una concentración que varía entre 10-30 mg/L para incrementar la producción de esta vitamina ya que es considerado el principal precursor de la vitamina además de aumentar la permeabilidad celular del microorganismo durante la fermentación.
Commented [1]: La síntesis de novo o «desde cero»
hace referencia a la creación de moléculas complejas a partir de moléculas simples en vez de su reciclaje.
También adicionar precursores potenciales como gl icina, treonina, δ aminolevulínico solutos ácidos o compatibles como betaína (encontrado en alto contenido en melaza de remolacha azucarera) y prueba de colina ser beneficioso. Los sustratos más utilizados son la glucosa, sacarosa, levadura de cerveza, agua de cocimiento de maíz, harina de soya, metanol, parafinas, melazas de remolacha y caña y suero de leche, siendo estas dos últimas las más utilizadas y reportadas en la bibliografía.11
Bioquímica del proceso Dado que la síntesis química de la vitamina B12 requiere más de 70 pasos su producción industrial es difícil, por lo que, se a optado por la biosíntesis a partir de microorganismos como Bacillus megaterium, Pseudomonas denitrificans y Propionibacterium siendo este último el empleado con mayor escala gracias a sus propiedades llamadas GRAS (Generalmente Reconocidos como Seguros por sus siglas en ingles) reconocido por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos)[9,12] La biosíntesis microbiana microorganismo a utilizar:
se
da
mediante
dos
vías
dependiendo
Pseudomonas Vía aeróbica: donde participan Propionibacterium shermanii o Shinorhizobium meliloti.
el
denitrificans
Vía anaeróbica: Salmonella entérica serotipo Typhimurium, Bacillus megaterium Propionibacterium shermanii. Además de ventajas existen desventajas de la producción fermentativa de vitamina B 12 como lo son los tiempos de fermentación altos (desde 6 horas hasta 2-3 dias ) requerimientos nutricionales exigentes y costosos. [9] En el caso de la obtención por Propiobacterium , se propone la adición del precursor dimetilbenzimidazol (DMBI) y la incubación aeróbica en la ultima fase de la fermentación con el fin de incrementar la producción de B12 ya que se a observado que las especies de Propionibacterium presentan ambas fermentaciones teniendo una fase anaeróbica inicial de 72h para posteriormente necesitar de oxigenación para llevar a cabo la biosíntesis del metabolito [13]
Metabolismo de la biosíntesis de vitamina B12 Como se puede observar en la figura 1 el primer precursor en intervenir en las vías es el ácido aminolevulinico (ALA) el cual puede ser sintetizado mediante dos rutas: C4 en la cual a partir de glicina y succinil CoA se cataliza la formación de ALA, mientras que la ruta de C5 se sintetiza a partir del glutamato a través de 3 reacciones enzimáticas. Posteriormente dos moléculas de ALA se condensan para formar porfobilinogeno monopirrol para después polimerizarse y ciclar cuatro moléculas de porfobilinogeno formando Uroporfirinogeno III. Después se produce
un metilación en C-2 y C.7, dando como resultado la síntesis de Precorrin-2 (precursor común de la cobalamina). A partir del Precorrin-2 la vía se divide en anaeróbica y aerobica, teniendo 8 reacciones hasta llegar al ácido cobironico y ácido hidrogenobirinico respectivamente para después volver a converger en el ácido cobironico II a, c diamida el cual pasa a ácido cobironico I, el cual se adenosila formando ácido adenosil coberinico a, c diamida, este se somete a 4 reacciones de amidacion por etapas en grupos carboxilo en las posiciones b,d, e y g para producir ácido adenosil-cobirico. Nuevamente existen dos métodos separados para la unión de ( R)1- amino-2 propanol o de ( R)1- amino-2 -propanol fosfato en la posición F del grupo carboxilo del ácido adenosilcobarico, para la ruta anaerobia el enlazador entre el anillo corrinoide y el ligando axial inferior se fosforila antes de la unión del anillo corrinoide. La enzima PduX es una L-Treonina quinasa usada en la síntesis de novo de la coenzima B12 pero no esta involucrada en la vía de rescate. La LTreonina se descarboxila para reducir al (R )-1-amino-2-propanol A través de CobD, sin embargo en la vía aeróbica lo más probable es que (R )-1amino2propanol este directamente unido al anillo corrinoide a través de la proteína alfa y beta (complejo CobC D) . Posteriormente es fosforilada por CobP Formando adenosilcobinamida fosfato y después adenosilcobidamida GDP (AdoCbi-GDP). Dos reacciones adicionales transfieren ligandos axiales inferiores AdoCbi-GDP produciendo adenosilcobalamina, una de las hipótesis es que hay adición α -ribazol catalizado a través de la cobalamina sintasa. [1]
Figura 2. Vías biosintéticas de compuestos de tetrapirrol.
Cinética del proceso.
Figura 3. Curva de peso seco Ln X Vs Tiempo (horas) para la producción de vitamina B12
Figura 4. Concentración de Vitamina B12 (mg/100ml) Vs Tiempo (horas)
Figura 5. Curva de Velocidad Volumétrica de Biomasa (g/Lh) Vrs Tiempo (horas) para la producción de vitamina B12
Figura 6. Curva de Velocidad Volumétrica Producción de Vitamina (g/Lh) Vrs Tiempo (horas) para la producción de vitamina B12
Figura 7. Curva de Velocidad Específica de Biomasa (g/Lh) Vrs Tiempo (horas) para la producción de vitamina B12
Figura 8. Curva de Velocidad Específica de Producción de Vitamina (g/Lh) Vrs Tiempo (horas) para la producción de vitamina B12 Dada la información obtenida de Castillo-Rodriguez y Rodas-Mejia (2007) se observa en la figura 4 y 5 la similitud entre el aumento de biomasa y la obtencion de productos, ambas velocidades volumentricas presentan dos picos uno a las 24h y otro a las 120h. Con las figuras 6 y 7 observamos las velocidades especificas de biomasa y producción de vitamina B12 en la cual la tendencia es muy similar en ambos casos, presentando un pico en las 24h y una tendencia en decaimiento. Por lo que podemos concluir que la producción de vitamina B12 es una cinetica tipo I de Gaden, en la cual los productos son asociados al crecimiento. Recuperación del producto
Frecuentemente en la industria es necesario separar los componentes de una mezcla en fracciones individuales. Las fracciones pueden diferenciarse entre sí por el tamaño de las partículas, por su estado, o por su composición química. La bioseparación es necesaria ya que al obtener el producto en bruto se debe: ü Enriquecer el producto objetivo ü Reducir el volumen ü Remover impurezas específicas ü Mejorar la estabilidad del producto ü Alcanzar las especificaciones del producto En cuanto a la extracción de vitaminas se utilizan métodos como: ü Precipitación ü Filtración ü Adsorción ü Extracción con solventes Por lo general, para la obtención del producto todo el caldo o una suspensión acuosa de las células cosechadas del proceso de fermentación se calientan a 80120 °C durante 10-30 min a pH 6.5-8.5 para extraer la vitamina B12. La conversión a la cianocobalamina se obtiene tratando el caldo calentado o suspensión celular con cianuro o tiocianato14Después de aclarar toda la solución, por filtración o tratamiento con hidróxido de zinc, la vitamina B12 se precipita mediante la adición de auxiliares como ácido tánico o cresol. Este procedimiento conduce a un producto de aproximadamente 80% de pureza, que se utiliza como aditivo. La purificación adicional se realiza a través de diferentes pasos de extracción usando solventes orgánicos como cresol, tetracloruro de carbono y agua / butanol, a menudo es complementa con adsorción a intercambiadores de iones o carbón activado. Finalmente, la vitamina B12 es cristalizada mediante la adición de disolventes orgánicos, lo que lleva a un producto de calidad recomendada para alimentos y productos farmacéuticos 15 Una buena separación asegura la pureza adecuada del producto, su estabilidad, mantiene costos bajos, es reproducible, escalable y cumple con las regulaciones establecidas.
Catálogo Empresa
Presentación
Cantidad
Precio M.N
Greenery Healthy
Spray
58 ml
$300.00
eating Farmacia San Pablo
Comprimido
48 comprimidos de 200 mg
$199.00
Biovea
Pastillas sublinguales
500 mcg 100 tabletas
$169.60
Evitamins
Pastillas sublinguales
90 tabletas
$166.70
Naturallya
Polvo
5000 mcg
$510.00
AVANFARM
Materia Prima
Pedido
-
AMFHER FOODS
Materia Prima
Pedido
-
Interquim
Materia Prima
Pedido
-
Alsak
Materia Prima
Pedido
-
Tianjin Wanhua
Materia Prima
Pedido
-
Prinova México
Materia Prima
Pedido
-
Hierbas Medicinales
Materia Prima
Pedido
-
Materias Materia Prima Especializadas del Norte
Pedido
-
GyG Mex Trade
Materia Prima
Pedido
-
Merck Colombia
Materia Prima
Pedido
-
KG International
Materia Prima
Pedido
-
NATURAL TEC
Materia Prima
Pedido
-
Oufu Trade
Materia Prima
Pedido
-
Fark Corp
Materia Prima
Pedido
-
Grupo Unipharm
Materia Prima
Pedido
-
Referencias
1. Forellat, M., Gómis, H.I., Gautier, H.,(1999). Vitamina B12: Metabolismo y aspectos clínicos de su deficiencia. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter ,15(3),159-74. 2. Aranceta, J., et al.(2000).Las vitaminas en la alimentación de los españoles.Madrid,España. Editorial Medica Panamericana. 3. Raviña, R. E., (2008). Medicamentos. Santiago de Compostela, España. Universidad de Santiago de Compostela. 4. Benfey, O. y Morris, T.,(2008).Robert Burns Woodward. Philadelfia, EUA.Chemical Heritage Foundation. 5. Gil, A., (2010). Tratado de nutrición. Madrid, España. Editorial Medica Panamericana. 6. Ziegler, E., Filer,J.,(1996).Conocimientos actuales sobre nutrición.Washington, U.S.A. , ILSI. 7. González, O., (2011). Nutrición inconsciente. Valencia , España.Ediciones i. 8. Martens, JH., Barg, H., Warren, M. et al.(2002).Microbial production of vitamin B12. Appl Microbiol Biotechnol .58: 275. 9. Fang, H., Kang, J., & Zhang, D. (2017). Microbial production of vitamin B12: a review and future perspectives. Microbial Cell Factories, 16, 15. 10. Márquez Rocha, Facundo J.. (2000). Producción de vitamina B12 por Methanosarcina sp. utilizando metanol y acetato como fuente de carbono. Revista de la Sociedad Química de México, 44(3), 209-214. 11. Bronztein,E., (1984). Selección de cep as del genero Pseudomonas para la producción de vitamina B12. Universidad Autónoma de México. 12. Piao, Y., Yamashita, M., Kawaraichi, N., Asegawa, R., Ono, H. and Murooka, Y. (2004). Production of vitamin B12 in genetically engineered Propionibacterium freudenreichii. Journal of Bioscience and Bioengineering, 98(3), pp.167-173. 13. Castillo Rodriguez, W. and Rodas Mejia, E. (2007). Propuesta de evaluación de la cinética de fermentación para la obtención de vitamina b12 utilizando la cepa del genero Propionibacterium freuderenchii. Licenciatura.
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR 14. Spalla C, Grein A, Garofano L, Ferni G (1989) Microbial production of vitamin B12. In: Vandamme E J (ed) Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors. Elseviewer, London pp 257 –284 15. Eggersdorfer M (1996) Vitamins. In: Elvers B, Hawkinds S (eds) Ullmann’s encyclopedia of industrial chemistry, vol 27A, 5th edn. VCH, Weinheim, pp 443 –613.
