ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA Inoculación de virus en huevos embrionados ASIGNATURA
:
Virología DOCENTE
:
Dra. Graciela Albino Cornejo. ALUMNO
:
Rómulo Aycachi Aycachi Inga.
CICLO
:
2007 - I
Lambayeque, Agosto del 2007.
Inoculación de Virus en Huevos Embrionados I.
Introducción:
Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante más de 15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de incuba incubació ción n aproxi aproxima madam dament ente e (a veces veces se usa huevos huevos de mas mas tiempo tiempo de incubación). Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar inyectar en la región apropiada, P. P. ej. los mixovirus crec crecen en bien bien en la memb membra rana na cori corioa oala lant ntoi oide dea, a, en tant tanto o que que el viru virus s de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus. El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directame directamente nte el virus en el embrión embrión en desarrollo desarrollo,, recurriend recurriendo o a la inoculaci inoculación ón intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con la dilucion viral inoculada. 2
Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego Luego los huevo huevos s con con embri embrione ones s muert muertos, os, cuand cuando o esto esto ocurra ocurra,, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el líquido alan alanto toid ideo eo se cheq cheque uea a con con la prue prueba ba de hema hemagl glut utin inac ació ión. n. Si se dete detect cta a actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos. Entre los lugares de inoculación tenemos: Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfe enferm rmed edad ad de Beye Beyerr (Pse (Pseud udor orra rabi bia) a);; que que prov provoc ocan an foco focos s o púst pústul ulas as fácilmente visibles. Cavidad Cavidad Alantoidea: Alantoidea: Se empl emplea ean n embr embrio ione nes s de 9 – 12 días días y la cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endode endodermo rmo alanto alantoide ideo o tenem tenemos: os: peste, peste, New Castle Castle,, virus virus de la bronqu bronquitis itis infecc infeccios iosa, a, encefa encefaliti litis s equina equina occide occidenta ntall y orient oriental al Venezue enezuela, la, paroti parotidit ditis. is. Ventaja: Ventaja: simplicidad de la inoculación y toma de muestra Cavidad Amniótica: Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza. Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2 – 1 ml. Vía es sumamente adecuada para el aislam aislamien iento to y cultiv cultivo o de los virus virus de enfer enfermed medade ades s venére venéreas, as, neumo neumonía nía y ricket rickettsi tsias. as. El vitelo vitelo es emple empleado ado para para la prepar preparaci ación ón de vacuna vacunas s y como como antígeno para reacciones serológicas de los virus ya mencionados. Vía Intravenosa: La membrana corialantoidea está irrigada por vasos sanguíneos, es susceptible de inoculación para casos especiales, virus que ocasionan ocasionan cambios cambios hematoló hematológicos gicos;; por ejemplo, ejemplo, virus de la Leucemia. Leucemia. Son empleado empleados s embriones embriones de 10 - 15 días y la cantidad cantidad de inóculo es de 0.02 0.02 0.05 ml. Vía Intracerebral (embrión): Se emplea embriones de 8 – 14 días, específic específicament amente e para virus que producen producen alteracion alteraciones es cerebrales: cerebrales: la rabia, rabia, herpes, etc; 0.01 – 0.02 ml.
II . •
Objetivo: Conocer Conocer y aplicar aplicar correctam correctamente ente los métodos métodos adecuado adecuados s para realizar inoculaciones de virus en embriones aviares.
III. Materiales: Material Biológico: • •
Virus de New Castle cepa “La Sota” a virus vivo. Huevos embrionados de gallina de 9 a 11. 3
Material de Laboratorio: Ovoscopio. Tijera Quirúrgica. Agua Destilada. Azul de Metileno. Agujas Hipodérmicas. Placas Petri amplias.
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IV. Procedimiento: A. • • • • • •
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Inoculación: Observar en el ovoscopio si el huevo es fértil o infértil. Determinar la edad del embrión. Localizar la cámara de aire y marcarla. Marcar el embrión. Colocar los huevos fértiles en un porta huevos Limpiar la cáscara (con una torunda de alcohol yodado, todo, sobre todo, la parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol). Agujerear el cascarón con un taladro (dependiendo de donde se vaya a inocular). Inoculamos el virus. Tapamos el agujero con parafina (o cera de vela). Luego llevamos a estufa (controlar temperatura y humedad adecuada) Controlar, observar dos veces al día, para percatarse si están vivos o muertos.
B. Otras Formas Formas De Inoculació Inoculación: n: Inoculación en el Saco Vitelino: El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión. Obse Observ rvar ar al Ov Ovos osco copi pio o y marc marcar ar el lím límite ite de la cáma cámara ra de aire aire,, marcando con un aspa la posición del embrión. La cámara de aire debe estar en el polo. Realizar un agujero en el límite de las ¾ partes del huevo. Tomar el inoculo con aguja de inoculación N° 22 con una jeringa de tuberculina. Inocular en el agujero hecho en posición directa al embrión con ángulo de 90°.
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Inoculación en la Cavidad Alantoidea: Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un orificio en posición directa del embrión. Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el borde (en relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½ pulgadas. •
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Otra forma es marcar la cámara de aire a 0.5 cm. de la cámara de aire hacer un agujero e inocular 0.3 ml. de inóculo con aguja 26 ó 27 de tuberculina. Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición contraria al embrión e inocular.
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Inoculación en la Cavidad Amniótica: Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22 de 1½ pulgadas. Inocular directamente al embrión, introduciendo toda la aguja. Pode Podemo mos s tamb tambié ién n abri abrirr toda toda la cáma cámara ra,, añad añadir ir 1 gota gota de suer suero o fisio fisioló lógi gico co ó agua agua dest destil ilad ada, a, para para que que la memb membra rana na fárfa fárfara ra;; que que inicia inicialme lmente nte es blanca blanca se haga haga transpa transparen rente, te, introd introduci uciend endo o pinza pinza y levantar la membrana de la cavidad amniótica, observar al embrión e inocular (la membrana es el amnios). •
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Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea: Se practica un agujero en el polo más ensanchado del huevo para inocular : •
Utilizando la cámara natural, inoculando por debajo de fárfara que cubre, depositando el líquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de tuberculina y aguja 26 ó 27. o Fabricando una cámara de aire artificial, practicar dos agujeros; uno en el polo más ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posición contraria al embrión. Colocar un torniquete en su boquilla y obtener el aire del polo más ensanchado (cuando sale el aire). La membrana membrana cono alantoidea baja; es decir decir este se separa separa más de la cáscara. Evitar abrir demasiado para que no se contamine. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 ó 27 x 1 ó ½ pulgada. Para inocular se introduce el basal de la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculación se puede girar la jeringa para que el líquido, quede quede depos deposita itado do en la memb membran rana, a, los agujer agujeros os son cubier cubiertos tos con parafina o cera (después de haber realizado las inoculaciones o
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IV. Resultados: -
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En la práctica, con la inoculación de los virus New Castle se debio haber realizado una ensayo de Dosis letal 50%, pero por problemas de mala manipulación, los resultados obtenidos no fueron suficientes para poder calcularlos. Como trabajo, se nos pidió realizar un ejemplo de DL50 y su breve explicación.
La dosis letal 50 es la cantidad de una sustancia expresada en gr o mgr capaz de matar al 50 % de los animales inoculados. La DL50 es una medida de uso común en Toxicología Toxicología y en Farmacología, también se aplica para el cálculo de título de un virus que en ese caso sería la cantidad de virus necesaria para matar al 50% de la población. En algunos casos suele usarse la DL25 o la DL75. 5
Esto Estos s son son ensa ensayo yos s dond donde e no se cuen cuenta ta el núme número ro de part partíc ícul ulas as infecciosas presentes en el inóculo, pero en su lugar se obtiene un valor para el título de ese virus donde la medida está basada en el principio de todo o nada (hay efecto citopático o no?, está el animal vivo o muerto?). Además esta se utiliza en virus que sean capaces de matar el 50% de la población de animales. El título viral es definido como aquella dilución de virus que infecta (o mata) el 50% de la población inoculada. En estos análisis para determinar el título viral, se utiliza el método de Reed y Muench, el cual es relativamente simple, la fórmula que se utiliza es la siguiente: (% infectividad en la dil. Inmediata superior a 50%) - 50% (% infec. En dil. Inmed. Sup. a 50%) – (% infec. En dil. Inmed. Inf. A 50%)
-
Distancia proporcional
Ahora, para calcular la dosis letal 50 se utiliza la sgte. fórmula: CDL50
-
=
=
- Log (dil. más cercana y por encima de 50% )
+
DPfd
Ahora tomenos el sgte. ejemplo:
Al realizarse una prueba de punto límite con el virus Vaccinia, se inoculó a 6 pericotes por cada dilución al medio, realizándose 6 diluciones (empezando por la dilución 1/10), la cantidad inoculada fue 0.3 ml. si por “acumulación de valores” se obtuvieron los sgtes. resultados: Dilución
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Nº animales
6 6 6 6 6 6
Muertos
Vivos
5 5 4 3 1 0
1 1 2 3 5 6
Total
Total
muertos
vivos
18 13 8 4 1 0
1 2 4 7 12 18
Relación
%
18/19 13/15 8/12 4/11 1/13 0/18
95% 87% 67% 36% 8% 0%
Entonces el cálculo de la dosis letal 50 sería:
1) Primero, Primero, ya que que tenemos tenemos las relacion relaciones es de animale animales s vivos y muert muertos os y los porcen porcentaj tajes es de morta mortalid lidad ad respec respectivo tivos, s, ahora hallamos la distancia proporcional: Los números más próximos y que estén por encima y por debajo del 50% son: 67% y 36%, entonces, aplicamos fórmula: •
67 – 50 67 - 36
=
17 31
=
0.55
6
2) Ahor Ahora a hace hacemo mos s el cálc cálcul ulo o de la dosi dosis s leta letall 50 (CDL (CDL50), entonces aplicamos fórmula:
- Log (10-3)
CDL50
=
+
0.55
CDL50
= - (-3) Log10 +
0.55
CDL50
=
3 + 0.55
CDL50
=
3.55
3) Entonc Entonces, es, como como el cálcul cálculo o de la dosis letal letal 50 es 3.55, 3.55, el logaritmo del título de la dilución será: Log DL50
V. •
•
VI.
=
10-3.55
Conclusiones: Debido a la mala manipulación no se pudo realizar el cálculo de la dosis letal 50. A trav través és de la inoc inocul ulac ació ión n seria seriada da de los los huev huevos os embr embrio iona nado dos s y controlando cuantos mueren por cada dilución se puede formar una tabla que nos serviría para poder hallar la dosis letal 50.
Referencias:
-
ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F.
-
MADI MADIGA GAN, N, M. y J. PARKER RKER (199 (1997) 7) Broc Brock k Micr Microb obio iolo logí gía a de los los Microorganismos. 8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F. D.F.
-
PRESCO PRESCOTT TT L., J. HARLEY HARLEY, D. KLEIN KLEIN (1999) (1999).. Microb Microbiol iologi ogia. a. 4º edic. edic. Edit. Mc Graw Hill Mexico D.F.
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