INTRODUCCIÓN A LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS Control de Calidad de Medicamentos Facultad de Ciencias Exactas – UNLP
Validar es establecer, establecer, mediante estudios de laboratorio , que la capacidad de un procedimiento (producción, limpieza) o de un método (analítico) satisface los requisitos para las aplicaciones deseadas. Es decir, decir, es demostrar que el mismo es apropiado para el uso propuesto.
Un sistema validado es un sistema estable, capaz y robusto y es así como nos interesa mantenerlo, dado que estas características son esenciales para mantener altos niveles de calidad
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¿Qué se debe validar? #
(no codificados en farmacopeas o modificados) Métodos de control de materias primas (MP)
#
Métodos de limpieza
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Máquinas de producción
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Equipos analíticos
#
Personal
Métodos para estudios de estabilidad
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Procesos
Métodos bioanalíticos
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Computadoras, Programas y Sistemas
Métodos de control de proceso Métodos de control de producto intermedio Métodos de control de producto terminado
Validación - Bibliografía »
USP 34 (2011) - <1225> Validación Validación de Procedimientos Farmacopeicos Farmacopeicos
»
FA 7 Ed. – <1130> Validación Validación de Métodos Métod os Analíticos http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/fna_pdfs.asp
» »
Disposiciones ANMAT 1930/92, 853/99, 2819/04 FDA (2013) – Bioanalytical Bioanalytical Method Validation alidation
http://www.fda.gov/dow http://www.fda.gov/downloads/drugs/guid nloads/drugs/guidancecompliancer ancecomplianceregulatoryinformation/gui egulatoryinformation/guidances/ucm368107 dances/ucm368107.pdf .pdf »
FDA (2014) – Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics http://www.fda.gov/do http://www.fda.gov/downloads/drugs/guid wnloads/drugs/guidancecompliancer ancecomplianceregulatoryinformation/gu egulatoryinformation/guidances/ucm3863 idances/ucm386366.pdf 66.pdf
»
ICH (2005) – Validation of Analytical Procedures: Procedures: Text Text and Methodology (Q2 – R1) http://www.ich.org/pr http://www.ich.org/products/guidelines/quality oducts/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html /article/quality-guidelines.html
»
EMA (2011) – Guidel Guideline ine on Bioanal Bioanalytic ytical al Method Method Validat alidation ion
http://www.ema.europa http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB .eu/docs/en_GB/document_libra /document_library/Scientific_guideline/2011/08/W ry/Scientific_guideline/2011/08/WC50010968 C500109686.pdf 6.pdf
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Validación de Métodos Analíticos Antes de comenzar... »
Equipos calificados
»
Materiales y reactivos adecuados
»
Sustancias de referencia (SR) adecuadas
»
Personal capacitado y entrenado
»
Conocimiento previo del análisis estadístico a realizar
La importancia de confiar en la SR Muestra
Método Analítico
RESULTADO
Cuando se APLICA un método analítico sobre una muestra, se obtiene un resultado que, como se confía en el método empleado, se atribuye a las características del producto
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La importancia de confiar en la SR Sust. referencia Muestra
Método Analítico
RESULTADO
Cuando se VALIDA un método analítico, se obtiene un resultado que, como se confía en la sustancia de referencia sobre la cual se aplica (título conocido, exactamente pesada y totalmente disuelta), se adjudica al desempeño del método analítico que se está evaluando
Parámetros de Validación » » » » » » »
Especificidad ¿Determinamos siempre Linealidad y rango todos estos parámetros? Precisión Exactitud Límite de Detección (LD) y de Cuantificación (LC) Estabilidad de muestras y soluciones Robustez Estos parámetros se pueden determinar de varias maneras (según el método analítico, el objetivo y/o alcance, las condiciones operativas) pero siempre empleando del analito
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notar que si bien la robustez no se encuentra incluida en la tabla anterior, la misma debe ser considerada en el momento oportuno durante el desarrollo de todo método analítico”. “… Es de
Validation of Analytical Procedures – Text and Methodology (ICH 2005)
Especificidad La especificidad de un método es su capacidad para evaluar inequívocamente al analito en presencia de otros componentes que pueden estar presentes: Impurezas # Productos de degradación # Componentes de la matriz # Excipientes #
¿Buscamos siempre todos esos componentes?
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Especificidad de los componentes que forman la matriz que acompaña al pa (prod. degradación, excipientes, fluido biológico), se debe demostrar que no interfieren mediante la comparación de los resultados obtenidos con muestras de [SR + matriz] respecto a muestras de la [matriz sin SR]. de dichos componentes, se pueden comparar los resultados que el método arroja para las muestras (que contienen dichos componentes, conocidos o no) con los obtenidos por otro método (oficial o previamente validado) cuya especificidad esté demostrada. En el caso de métodos analíticos para estudios de estabilidad, los componentes que acompañan al activo se pueden generar por degradación forzada: termólisis, hidrólisis acuosa, alcalina y ácida, fotólisis, oxidación
Especificidad Alternativa para métodos por HPLC (GC) Establecer la especificidad evaluando la “pureza de pico”: si el detector es UV con arreglo de diodos (HPLC-DAD) o un espectrómetro de masas (HPLC-MS)
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Especificidad por cociente a dos λ Se debe medir la absorbancia de una solución de SR del pa 2 longitudes de onda (λ1 y λ2). Luego:
Luego se mide la abs de la muestra a las mismas λ1 y λ2:
ASR (λ1) = A11 (λ1)*b*CSR
Am (λ1) = A11 (λ1)*b*Cm
ASR (λ2) = A11 (λ2)*b*CSR
Am (λ2) = A11 (λ2)*b*Cm
El cociente de las expresiones anteriores será: ASR (λ1) = A11 (λ1) ASR (λ2) A11 (λ2)
Y el cociente: Am (λ1) = A11 (λ1) Am (λ2) A11 (λ2)
Como la sustancia es la misma y también lo son las condiciones de operación (solvente, temperatura), los valores de A 11 a ambas λ, tanto para la muestra como para el SR, deben ser iguales (< 1%) en ASR (λ1) = Am (λ1) ausencia de interferencias. Es decir:
ASR (λ2)
Am (λ2)
Especificidad (resumen) cuando se conoce la matriz (excipientes declarados, matriz biológica reproducible) Se aplica el método Posibles analítico (peso, disuelvo, interferencias sonico, centrifugo, diluyo, SR del analito (peso, título) etc.) sobre alícuotas de Posibles ambas muestras interferencias Se puede procesar una MUESTRA que contenga dicha matriz por el método que estoy validando y por otro ya validado o farmacopeico (apto para matrices desconocidas)
OTRAS OPCIONES
Si el detector es DAD o MS ⇒ se puede evaluar la “pureza de pico”
Si es por UV (o HPLC-UV) ⇒ se puede aplicar el método del “cociente a dos λ”
Importante: se debe re-determinar la especificidad del método cada vez que cambia la matriz (ej. distintas marcas)
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Linealidad y Rango #
#
#
La linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados directamente proporcionales a la concentración de analito, dentro de un intervalo o rango de concentraciones.
Se demuestra mediante la construcción de una “curva de calibración” (respuesta vs. concentración). Dicha curva se construye alrededor de la concentración de trabajo, y sus extremos determinan el “rango” de aplicabilidad del método. Se debe preferir siempre el modelo más simple, si bien las reglamentaciones contemplan situaciones donde pueda ser necesario realizar una transformación previa de los datos, o aplicar modelos alternativos al lineal (ej. inmunoensayos).
Linealidad La curva de calibración se puede hacer con o sin replicados – Ejemplos: Cinco niveles de concentración, 3 réplicas independientes a cada nivel (N=15) Cinco niveles de concentración, a partir de 2 SC madre por diluciones cruzadas (N=5)
* * *
* * *
* * *
* * *
Con replicados (m=5, N=15)
* * *
Al trabajar sin replicados, nunca conviene obtener todas las soluciones de una misma solución madre
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Linealidad Ŷ
0,1
19,97
b*0,1+a
1,0
201,54
b*1,0+a
….
…
…
2005,3
b*10+a
r ≥ 0.99 y r2 ≥ 0.98 (o superior) 10 Análisis de Residuales Residuos ≈ 0 Significancia de la correlación: ANAVA/lack of fit – Test de Student
IC de la ordenada al origen debe incluir al 0
Una vez encontrada la ecuación y = bx + a, se introducen los valores experimentales de y (ej. area, abs), y se obtienen las concentraciones predichas, las que deben estar dentro del ± 15% del valor nominal (teórico).
Linealidad - Tratamiento estadístico Con o sin replicados, siempre se puede hacer: 1) Test de Student H0 = No hay correlación entre x e y (r 2=0) Si tcalc > t crít ⟹ Se rechaza H0 t calculado
2) ANAVA
GL
Cuadrados Medios
Fcalculado
p-1
SR/p-1
CMreg /CMerror
Error
SE = ( yi yi ) N-p
SE/N-p
Total
ST = ( yi y ) 2
Regresión SR = ( yi y )
2
ˆ
r (n 2)
Suma de cuadrados 2
ˆ
N-1
2
(1 r )
H0 = No hay correlación entre x e y (r 2=0) Si Fcalc > Fcrít ⟹ Se rechaza H0 ⟹ Hay correlación
3) Residuos de la regresión: suma, distribución
Para rechazar esa H0, el test de Student y el ANAVA son equivalentes (si hicieron bien las cuentas, Fcalc = (tcalc)2). Sin embargo, del ANAVA obtenemos más información, sobre todo el CMerror necesario para el cálculo de IC.
Sólo si tenemos replicados, se puede hacer: 4) Lack of fit 5) Análisis de residuales: Cochran, transformaciones
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Linealidad (resumen) ¿es la respuesta directamente proporcional a la concentración? Etapa de análisis estadístico de los datos
0,8
y = 0,0409x + 0,008 R² = 0,997
0,7 0,6 0,5
0,4 0,3
0,2 0,1
0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Para materias primas o especialidades, no hace falta incluir la matriz de excipientes en las muestras
IC de la ordenada al origen debe incluir al cero r ≥ 0.99 y r2 ≥ 0.98 (o superior) La correlación sea significativa (rechazar la H0 de no correlación mediante un test t o ANAVA) Análisis de Residuales Residuos ≈ 0
Esquema de una curva a 5 niveles, sin replicados (etapa experimental)
Linealidad (resumen) ¿es la respuesta directamente proporcional a la concentración? Etapa de análisis estadístico de los datos
100,00
y = 4,1167x - 0,9416 R² = 0,9832
90,00 80,00
IC de la ordenada al origen debe
70,00 60,00
r
50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0
Para métodos bioanalíticos, es recomendable preparar las muestras en la misma matriz biológica (ej. plasma blanco)
4
8
12
diluciones
16
20
incluir al cero
r2 ≥
≥ 0.99 y 0.98 (o superior) La correlación sea significativa (rechazar H0 de no correlación mediante un test t o ANAVA) Análisis de Residuales Residuos ≈ 0 Opcional (x tener replicados) • Puedo ver el ajuste al modelo lineal (ensayo de lack of fit o falta de ajuste) • Puedo plantear una transformación de los datos si tengo problemas de dispersión
Esquema de una curva a 6 niveles, tres réplicas a cada nivel (etapa experimental)
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Precisión La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los resultados cuando el método se aplica en forma repetitiva
Interpreta los errores aleatorios del método Da idea de la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central ⟹ se expresa como desviación estándar o coeficiente de variación (CV)
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sn1
yi y n 1
CV %
sn
y
1
Y
100
Precisión - Niveles »
»
»
»
se calcula como el CV% de varias determinaciones de una solución de SR. Puede hacerse a un nivel (100% o concentración de trabajo) o a varios niveles (ej. 80, 100 y 120%) de concentración. No tiene especificación CV% de N muestras ⟹ evalúa el , desde la preparación de la muestra hasta la medición instrumental. Implica mismas condiciones operativas en un intervalo de tiempo cor to (mismo analista, equipo, día). Se puede hacer de diversas maneras: 9 muestras que cubran el rango (ej. 3 réplicas a 3 niveles), 6 muestras al 100%, o muchas más. Criterio de Aceptación : distintas condiciones en distintos días, dentro del mismo laboratorio (diferentes analistas, equipos, etc). Se recomienda emplear diseños factoriales, se contemplan todos los factores que pueden variar. : expresa la precisión entre laboratorios. Se realiza sólo para estudios colaborativos, protocolos estandarizados, monografías de farmacopeas
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Precisión - Niveles P. del sistema
Precisión del método Precisión intermedia Reproducibilidad o fortaleza
Precisión (resumen) ¿hay concordancia entre medidas repetidas? Opcional
+
+
Peso SR (título)
+
Matriz
Sonicación
Si se replica todo el experimento, variando todos los factores (analista, día, equipo) PRECISIÓN INTERMEDIA O INTER-DÍA Ejemplo: El día 1, el analista 1 y el analista 2 preparan cada uno tres muestras a la concentración de trabajo (100%). El día 2, hacen lo mismo.
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Precisión (resumen) ¿hay concordancia entre medidas repetidas? Opcional
+
+
Peso SR (título)
+
Matriz
Sonicación
Si se replica solamente la etapa analítica del método, desde la pesada hasta la l ectura (demás factores ctes., un analista, mismo día, etc.) REPETIBILIDAD, PRECISIÓN INTRA -ENSAYO o DEL MÉTODO (Debe ser < 2%) Ej. 1: Un analista prepara, el mismo día, 3 réplicas al 80%, 3 al 100% y 3 al 120% de la concentración de trabajo Ej. 2: Un analista prepara, el mismo día, seis réplicas al 100% Ej. 3: se preparan cuatro réplicas a los mismos niveles de concentración que se usaron para construir la curva de calibración
Precisión (resumen) ¿hay concordancia entre medidas repetidas? Opcional
+
+
Peso SR (título)
+
Matriz
Sonicación
Si sólo se replica la lectura o medida analítica PRECISIÓN DEL SISTEMA Ejemplo: En el ej. 2 anterior, una de las soluciones se lee seis veces (o más)
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Exactitud Interpreta los errores sistemáticos o tendencia del método analítico, es decir que expresa la proximidad entre el resultado y “el valor real”. Generalmente se expresa como %Recuperado, Error Absoluto o Relativo Se determina empleando soluciones de SR, de título conocido, replicadas, comprendidas o abarcando el rango de linealidad, a las que se agregan los excipientes del producto o la matriz de trabajo y se someten a todas las etapas del método
Ensayo de Recuperación
Exactitud (resumen) ¿se parece el valor medido al valor real o teórico? V2
Peso SR (título)
Matriz
V1
V3
Sonicación
Con esos datos calculo el valor esperado: por ej. si peso 22 mg de una SR 98% sdtc = 21,56 mg teóricos
AMta Con esos datos calculo el valor medido o hallado
necesito una SR para transformar un valor de señal en un valor de masa o concentración hallada!!! Criterio: si el ensayo mide el efecto que las diferentes etapas del método pueden tener sobre el resultado, puedo usar como SR para los cálculos a una solución que NO haya pasado por dichas etapas
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Exactitud (resumen) ¿se parece el valor medido al valor real o teórico? V2
Peso SR (título)
Matriz
V3
V1
Sonicación
Con esos datos calculo el valor esperado: por ej. si peso 22 mg de una SR 98% sdtc = 21,56 mg teóricos
AMta Si ASR ……... CSR AMta…….. X: CMta
Entonces…. Recuperación = mg hallados.100 mg teóricos Es decir, Recuperación = 19,87.100 = 92,16% 21,56
Con esos datos calculo el valor medido o hallado
Mg hallados: CMta.V3.V2 V1
CSR ASR
Evaluamos la exactitud mediante un ensayo de recuperación
Exactitud - Tratamiento de datos - Presentación de los datos Se informan los valores obtenidos, y se calculan los errores y/o la recuperación (próxima al 100% y con una dispersión aceptable) Error Absoluto
Error Relativo
Y ˆ
Y
Y
Y ˆ
Y ˆ
Recup
100
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Y 100
30.1 30.7 30.5 30.4 31.2 29.8 Ŷ=30.45
30.0 31.0 30.0 29.7 30.8 30.0 Y =30.42
99.67 100.98 98.36 97.70 98.72 100.67
Y ˆ
- Realizar un test de hipótesis {ensayo t -Student-} H0 = No hay Errores Sistemáticos (%R = 100) Si tobs < ttabla No tenenemos evidencia de que existan errores sistemáticos
t ob
100
%R
CV n
15
Exactitud - Tratamiento de datos - Graficar concentración (o mg) hallada vs. agregada a d a l l a h
C
* * *
* * *
* * *
* * *
* * *
r ≥ 0.99 y r2 ≥ 0.98 (o superior) Significancia de la regresión: ANAVA – Student Análisis de Residuales
Cagregada
IC de la ordenada debe incluir al 0 IC de la pendiente debe incluir al 1
Método recomendado por la USP 34
Exactitud (resumen) Finalizado el ensayo de recuperación, se llega a tablas como estas: Ej. Seis replicas al 100% M1 M2 M3 M4 M5 M6
30.1 30.7 30.5 30.4 31.2 29.8
30.0 31.0 30.0 29.7 30.8 30.0
99.67 100.98 98.36 97.70 98.72 100.67
Precisión del método al 100 % Conclusión: es exacto? i. Mg teóricos vs. Hallados ii. Test t (entre %Recup. Media y 100%)
16
Exactitud (resumen) Finalizado el ensayo de recuperación, se llega a tablas como estas: Ej. Tres replicas al 80, 100 y 120 % Conclusión: es exacto? i. Mg teóricos vs. Hallados ii. Test t (entre %Recup. Media y 100%)
Cuando se evalúa exactitud mediante un ensayo de recuperación, también se evalúa la precisión En este caso, podemos conocer la precisión del método al 80, 100 y 120% y la total.
M1 80% M2 M3 M4 100% M5 M6 M7 120% M8 M9
24.0 24.2 23.9 30.4 31.2 29.8 36.1 36.5 35.9
23.8 24.2 23.7 29.7 30.8 30.0 36.2 36.2 35.7
99.17 100.0 99,16 97.70 98.72 100.67 100.28 99.18 99.44
Recup. Media al 80% = 99,44% - CV = 0,48% Recup. Media al 100% = 99,03% - CV = 1,52% Recup. Media al 120% = 99,63% - CV = 0,58%
Exactitud y Recuperación... ¿son lo mismo? La EXACTITUD se puede determinar mediante un ensayo de RECUPERACIÓN, y en ese caso pueden tomarse como sinónimos, aunque no siempre. Ejemplo: métodos bioanalíticos, cuando se usa estándar interno (SI)
Además, la EXACTITUD se puede determinar de otras formas, por ejemplo, por comparación contra otro método (farmacopeico o previamente validado) En estos casos, EXACTITUD y RECUPERACIÓN son parámetros diferentes, que brindan información diferente
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Límites de Detección y de Cuantificación El límite de detección (LD) es la concentración más baja de analito que puede detectarse (no necesariamente cuantificarse) en una muestra, bajo las condiciones experimentales establecidas. El límite de cuantificación (LC o LLOQ, lowest limit of quantification) es la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud en la muestra, bajo las condiciones experimentales establecidas. Existen diversas formas de determinarlos, según se trate de métodos instrumentales o no. Sin embargo, en ciertas situaciones (por ej., métodos analíticos para el ingrediente mayoritario en una MP y/o PT), se puede reemplazar la DETERMINACIÓN del LC “real” por su ESTABLECIMIENTO en un valor dado
Límites de Detección y de Cuantificación En aquellos casos donde es necesario conocer estos límites, se pueden aplicar tres métodos:
Aplicable principalmente a métodos no instrumentales (ej. TLC), consiste en analizar muestras de concentración conocida del analito para establecer el nivel mínimo al cual el mismo puede ser confiablemente.
Aplicable sólo a métodos con “ruido” en la línea de base. Se considera aceptable una relación S/R=3 para el LD y S/R=10 para el LC S/R= señal/ruido
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Límites de Detección y de Cuantificación Consiste en LD
#
#
3.3 s
b
los límites de acuerdo a las siguientes expresiones: LC
10 s b
s = SD de la respuesta b = pendiente de la curva de calibración (sensibilidad)
A partir de la SD del blanco: se preparan y analizan varias muestras blanco para calcular la SD de sus respuestas. A partir de una curva de calibración cercana al LD/LC: se preparan muestras conteniendo el analito en concentraciones cercanas al LD/LQ y con ellas se construye una cur va de calibración. Tanto la SD de la regresión ( s ( y ) ) como la SD de la ordenada ( s ( a ) ) pueden ser usadas como “SD de la respuesta” en las expresiones anteriores. A partir de la curva de calibración del método: la SD de la regresión ( s ( y ) ) puede ser usada como estima (más grosera) de la “SD de la respuesta” en las expresiones anteriores. ˆ
#
ˆ
Límites de Detección y de Cuantificación Consiste en LD
3.3 s
b
los límites de acuerdo a las siguientes expresiones: LC
10 s
b
s = SD de la respuesta b = pendiente de la curva de calibración (sensibilidad)
Cuando el LC se obtiene por este método, el valor estimado debe ser luego validado (incluido en linealidad, exactitud y precisión) mediante el análisis independiente de un número adecuado de muestras de s ( y ) s ( a ) concentración = LC ˆ
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Límites de Detección y de Cuantificación La sensibilidad de calibrado corresponde a la pendiente de la curva de calibración Un método es sensible cuando frente a una pequeña variación en la concentración se obtiene una significativa variación en la señal La sensibilidad analítica corresponde al cociente entre la sensibilidad de calibrado y la desviación estándar de la medida (SD de la respuesta) Mayor sensibilidad analítica a menor LD y LC
Estabilidad Determinación de la estabilidad de muestras y/o soluciones bajo diferentes condiciones. Muy importante para métodos bioanalíticos »
se somete a las muestras a tres ciclos (24 hs. a la Tº de almacenamiento, luego se deja descongelar solo, y se repite el ciclo) de al menos tres alícuotas, tanto a las bajas como a las altas concentraciones.
»
las muestras (y concentraciones, tres alícuotas de c/u) se dejan descongelar a Tº ambiente y se conservan así el tiempo esperado de análisis (entre 4 y 24 hs).
»
en las condiciones normales de conservación (freezer, por ejemplo) durante el período de tiempo máximo, desde la recolección de las muestras hasta el momento de análisis de la última muestra. También se realiza sobre las soluciones madre (o sc stock) si éstas se re-utilizan.
»
se determina la estabilidad tanto del principio activo como del estándar interno frente a las condiciones normales de procesamiento, durante el tiempo que dura el análisis (preparación de la muestra, tiempo en el inyector, tiempo de corrida, etc.)
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Robustez La robustez de un método analítico es la medida de su capacidad de por variaciones (pequeñas, pero deliberadas) en alguno de sus parámetros. Ejemplos de variaciones que pueden estudiarse: Diferentes tiempo de extracción # Diferentes lotes/marcas de reactivos # Diferentes tiempos de valoración # Efecto de la temperatura # Diferentes analistas # Diferentes instrumentos, lotes/marcas de columnas cromatográficas # Influencia del pH, composición de la fase móvil, flujo #
¿Se debe hacer siempre, para todas las variables posibles?
Robustez Si bien para el caso de uno o dos factores se podrían aplicar diseños sencillos (mono o bifactoriales) para estudiar su influencia y/o interacción, no es lo más común ya que sólo interesa identificar aquellos factores que podrían influenciar los resultados. Es por ello que se estudian sólo dos niveles de cada factor, varios factores a la vez
Más completo: diseño 2k Brinda la máxima información pero requiere 2k ensayos (ej. 32 experimentos para 5 factores)
A dos niveles: Nivel nominal o bajo y nivel extremo o alto
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¿Qué sucede si queremos evaluar, por ejemplo, 7 factores?
Robustez
Con un diseño 2 k clásico, serían necesarios al menos 27 = 128 experimentos!!
A B
Analista pH fase móvil
Juan 4.00
Pedro 4.10
C D E F G
Flujo fase móvil Columna Temp. Horno Equipo Calidad del SV
1.00 Col. A 40 °C HPLC A Marca A
1.10 Col. B 40.5 °C HPLC B Marca B
1 2 3 …
+ -
+
-
-
-
-
-
50 …
-
-
+
-
-
-
-
80 81 … 100 101 102 … 128
+
+ +
+ +
-
-
-
-
+ + +
+ +
+ +
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Robustez - Diseños Fraccionales Consisten en realizar sólo una “fracción” del total de experimentos, de manera de perder la mínima información posible. (n) variables
(n + 1) ensayos
Condición: que el n° de ensayos sea múltiplo de 4, es decir, 4(n+1) ensayos
4 8 12 16
3 7 11 15
DESVENTAJAs DE LOS DISEÑOS FRACCIONALES - Debido a la reducción en el n° de experimentos, aparece cierto grado de CONFUSIÓN (mayor cuanto mayor sea la relación factores/experimentos) - Estimación del error y GL del error
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Robustez - Matrices de Placket-Burman En la figura, cada factor es una columna, y cada fila un experimento
Extraído de: Armstrong, N. A. (2006). Pharmaceutical experimental design and interpretation . Boca Raton, FL: CRC/Taylor & Francis.
Robustez - Matrices de Placket-Burman En un análisis de varianza, un factor (A , por ejemplo) tiene efecto si F calc=CMA > Fcrít CMerror En este caso, SCA=DP2 y GLA=1 Donde DP = Dif. o Efecto Prom de A = (Promedio A +) – (Promedio de A-) Como no nos quedan GL para el error (diseño muy reducido), se lo estima con el valor de la precisión del método determinada anteriormente Finalmente, En el ensayo de robustez, se consideran factores robustos aquellos para los cuales Se usa un Fcrít = 2 (criterio conservador!!)
Se considera que el método es robusto respecto al factor A si:
|DPA| < SD √2 SD : Desviación Standard de Repetibilidad
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Siguiendo con el ejemplo anterior de 7 factores...
Robustez
acá vemos las cuentas a un solo nivel de concentración de las muestras. Se repite todo a tres niveles, ejemplo 80, 100 y 120 % (ver ejemplo en la guía)
A B
Analista pH fase móvil
Juan 4.00
Pedro 4.10
C D E F G
Flujo fase móvil Columna Temp. Horno Equipo Calidad del SV
1.00 Col. A 40 °C HPLC A Marca A
1.10 Col. B 40.5 °C HPLC B Marca B
|DPA|=|(2,1+3,2+1,8+3,0)-(2,5+4,0+3,3+1,2)| = 0,225 4 4 |DPD|=|(2,1+1,8+4,0+1,2)-(3,2+3,0+2,5+3,3)| = 0,725 4 4 Si, por ejemplo SDmétodo= 0,25 ⇒ SD √2 = 0,354
1 2 3 4
+ + +
+ + -
+ +
+ +
+ -
+ -
+ + -
+
-
-
-
+
+
-
2,1 3,2 1,8 3,0
5 6
-
+
+
-
+
-
-
-
+
-
+
-
+
-
2,5 4,0
7 8
-
-
+ -
+
+
+ -
+ +
3,3 1,2
El método es robusto en relación al analista, pero no en relación a la columna
Otras consideraciones
importante en métodos instrumentales, consiste en determinar si existe algún tipo de efecto de “arrastre” por analizar muestras en orden aleatorio de concentración. Si existiera (≥ 20% del LLOQ en una muestra blanco) no se deben aleatorizar los ensayos, e incluso se puede planificar el análisis de muestras blanco luego de muestras concentradas.
se hace necesario re-validar cuando se producen cambios, tales como el método de síntesis de la droga, la composición del producto terminado, algún parámetro del método analítico, etc. El “grado” de revalidación necesario como así también otras situaciones no enumeradas aquí que pudieran requerir revalidación
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Otras consideraciones
consiste en evaluar los parámetros característicos de un método farmacopeico para verificar que los mismos se encuentren dentro de límites aceptables. Ejemplo: Donde tR son los tiempos de retención y W i son los anchos de pico en la base Donde W5% es el ancho de pico al 5% de la altura y f es la distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico, también medida al 5% de la altura
Rs
2 t R 2
W
1
As
t R1
W
2
W 5% 2 f
deben ser establecidos estadísticamente (Test de Dixon, Test de Grubbs).
Resumiendo... La
Validación de un Método Analítico debe ser verificada únicamente por estudios de laboratorio. Debe estar adecuadamente documentada. Cada parámetro de validación debe determinarse con un patrón o sustancia de referencia (SR). La exigencia de uno u otro parámetro dependerá del uso del método, es decir, del destino del método. Los métodos farmacopeicos no deben ser validados, excepto los destinados a estudios de estabilidad o validación de limpieza. Únicamente se les aplicará el test de Aptitud del Sistema (o de adecuabilidad) Los métodos se deben revalidar cuando se introduce algún cambio en el mismo o cuando la matriz y/o la concentración del analito en un producto se ha modificado.
Un Método Validado es un Método Confiable
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