Validacion de potencia de antibiotico

UNIVERSIDAD SALVADOREÑA “ALBERTO MASFERRER” FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

TRABAJO DE GRADUACIÓN PARA OPTAR AL GRADO DE: LICENCIATURA EN QUÍMICA Y FARMACIA

“VALIDACIÓN DE POTENCIA DE ANTIBIOTICO EN GENTAMICINA SOLUCION

INYECTABLE POR EL MÉTODO DE CILINDRO-PLACA”.

PRESENTADO POR: NELSON SALOMÓN ZAMORA DÍAZ RICARDO JOSE AGUILUZ MORENO ASESORAS: LICDA. GRACIA MAGAÑA LICDA. MARTHA RUTH MARROQUIN

JULIO 2016 SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTROAMERICA

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UNIVERSIDAD SALVADOREÑA “ALBERTO MASFERRER”

FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

AUTORIDADES

DR. CÉSAR AUGUSTO CALDERÓN RECTOR

LICDA. DAYSI CAROLINA MARQUINA DE GÓMEZ VICERRECTORA

LIC. JULIO ALFREDO RIVAS HERNÁNDEZ SECRETARIO GENERAL

LIC. THELMO PATRICIO ALFARO RUGLIANCICH FISCAL

LICDA. RAQUEL ARAYA DE CORNEJO DECANO

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UNIVERSIDAD SALVADOREÑA “ALBERTO MASFERRER”

FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

AUTORIDADES

DR. CÉSAR AUGUSTO CALDERÓN RECTOR

LICDA. DAYSI CAROLINA MARQUINA DE GÓMEZ VICERRECTORA

LIC. JULIO ALFREDO RIVAS HERNÁNDEZ SECRETARIO GENERAL

LIC. THELMO PATRICIO ALFARO RUGLIANCICH FISCAL

LICDA. RAQUEL ARAYA DE CORNEJO DECANO

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INDICE INDICE ............................................................................................................................................... iii INDICE DE TABLAS ........................................................................................................................ vi ÍNDICE DE ANEXOS ........................................................................................................................ vi RESUMEN ......................................................................................................................................... vii ABSTRACT ...................................................................................................................................... viii INTRODUCCION .............................................................................................................................. ix CAPITULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 10 1.1.

PLANTEAMIENTO PLANTEAMIENT O DEL PROBLEMA .................................. ................. ................................... ................................... ........................... .......... 11

1.2. ANTECEDENTES ...................................................................................................................... 12 1.3. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................................... .................. ................................... ................................... ..................... .... 14 1.4 LIMITACIONES ......................................................................................................................... 15 1.5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 16 1.5.1. Objetivo general ................................................................................................................... 16 1.5.2. Objetivos específicos ............................................................................................................ 16 CAPITULO II. MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 17 2.1. MARCO TEORICO .................................................................................................................... 18 2.1.1 ANTIBIÓTICOS ....................................................................................................................... 18 2.1.1.1. Definición .......................................................................................................................... 18 2.1.2. GENTAMICINA ...................................................................................................................... 18 2.1.2.1. Farmacocinética ................................................................................................................ 19 2.1.2.2. Posología y administración ............................................................................................... 20 2.1.2.3. Esquemas posológicos específicos .................................................................................... 21 2.1.2.4. Contraindicaciones ............................................................................................................ 21 2.1.2.5. Precauciones Precauci ones y advertencias adverte ncias .................................. ................ ................................... ................................... .................................... ........................ ...... 21 Página I iii

2.1.2.6. Reacciones adversas .......................................................................................................... 22 2.1.3. Staphylococcus epidermidis. ................................................................................................... 22 2.1.3.1. Generalidades .................................................................................................................... 22 2.1.3.2. Taxonomía ......................................................................................................................... 23 2.1.3.3. Morfología microscópica .................................................................................................. 23 2.1.3.4. Hábitat ............................................................................................................................... 23 2.1.3.5. Metabolismo ...................................................................................................................... 23 2.1.3.6. Resistencia a agentes físicos y químicos ........................................................................... 24 2.1.3.7. Resistencia antibiótica ....................................................................................................... 24 2.1.4. VALIDACION ......................................................................................................................... 25 2.1.4.1. Definiciones ...................................................................................................................... 25 2.1.4.2. Métodos Susceptibles a ser Validados .............................................................................. 25 2.1.4.3. Datos requeridos para la validación de una determinación ............................................... 25 2.1.4.4. PARAMETROS DE DESEMPEÑO ..................................................................................... 26 2.1.5. MÉTODO DIFUSIÓN EN PLACA O CILINDRO PLACA ................................................... 28 2.1.5.1. Fundamento ....................................................................................................................... 28 2.1.5.1. Metodología general para el ensayo según USP38 ........................................................... 28 2.1.5.2. Especificaciones de USP 38 para el método difusión en placa o cilindro placa ............... 29 2.1.5.2.2. ......................................................................................................................................... 29 CAPITULO III. HIPOTESIS ................................................................................................................ 30 3.1. HIPOTESIS ................................................................................................................................. 31 3.1.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO: ............................................................................................... 31 3.1.2. HIPÓTESIS NULA: ............................................................................................................. 31 CAPITULO IV. MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 32 4.1. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 33 4.1.1. MATERIALES..................................................................................................................... 33 4.1.1.1. Siembra de Staphylococcus epidermidis y obtención de suspensión madre ..................... 33 Página I iv

4.1.1.2. Estandarización de la suspensión de microorganismos ..................................................... 33 4.1.1.3. Preparación de las placas de prueba .................................................................................. 33 4.1.1.4. Preparación de las soluciones ............................................................................................ 34 4.2. METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 36 4.2.1. Tipo de estudio ..................................................................................................................... 36 4.2.2. Tiempo y lugar ..................................................................................................................... 36 4.2.3. Universo y muestra ............................................................................................................... 36 4.2.4. Recolección y Análisis de los datos ..................................................................................... 36 CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 37 5.1. RESULTADOS ............................................................................................................................. 38 5.1.1. PROTOCOLO DE VALIDACION DEL METODO ANALITICO ............................................ 39 5.1.2. INFORME FINAL DE VALIDACION ....................................................................................... 50 5.1.3. RESULTADOS DE PARAMETROS DE DESEMPEÑO ...................................................... 57 5.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS ...................................................................................... 58 CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 59 RECOMENDACIONES .................................................................................................................... 60 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 61 GLOSARIO ........................................................................................................................................ 62

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INDICE DE TABLAS Tabla 1: Parámetros de desempeño de procedimientos analíticos físico-químico y potencia microbiológica. ....................................................................................................................... 26 Tabla 2. Resultados de parámetros de desempeño ................................................................. 57

ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO I: CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES........................................................... 65 ANEXO II. IMÁGENES PARTE EXPERIMENTAL ...................................................... 66

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RESUMEN Los parámetros de desempeño, para validar un método de análisis, son características del funcionamiento que debe de presentar una garantía y una confiabilidad de los datos. El método de potencia de antibiótico de Gentamicina, se adaptó a las condiciones del laboratorio de microbiología dentro del laboratorio de control de calidad de la USAM. El cual dentro de este trabajo se detalla el procedimiento que se debe realizar para el desarrollo exitoso del ensayo de potencia de Gentamicina. El objetivo principal de esta investigación fue la implementación de los parámetros de desempeño: especificidad, exactitud, repetibilidad y precisión intermedia del método cilindro placa para la determinación de potencia de Gentamicina Solución Inyectable. La parte práctica fue realizada en el Laboratorio de Control de Calidad de la USAM, en el área física química y microbiología, en el periodo de tiempo necesario para dicha validación. Al finalizar esta investigación se puede expresar que la metodología analítica desarrollada tuvo un comportamiento preciso ya que los resultados que se obtuvieron avalan esta metodología pues estos proporcionan resultados satisfactorios con una precisión, exactitud y linealidad comprobada, es decir que se comprobó que el método cumple con los parámetros establecidos, por lo tanto, se podrá repetir esta prueba cada vez que el laboratorio lo requiera en nuevos análisis.

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ABSTRACT

Performance parameters to validate a method of analysis, are performance features that should provide security and reliability of the data. The power method of antibiotic Gentamicin, adapted to the conditions of the microbiology laboratory inside the quality control laboratory of USAM. Which in this work the procedure should be performed for the successful development of the power of Gentamicin assay is detailed. The main objective of this research was the implementation of performance parameters: accuracy, precision, and specificity of the cylinder plate method for determining power of Gentamicin Injection solution. The practical part, was conducted at the Laboratory of Quality Control of USAM, in the area of microbiology and physical chemistry, in a period of time required for such validation. Upon completion of this investigation, it can be expressed that, the analytical methodology developed had a precise behavior since the results obtained support this methodology because these provide satisfactory results with precision, accuracy and proven linearity, is it was found that the method meets established parameters, therefore this test can be repeated whenever the laboratory requires a new analysis that requires it.

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INTRODUCCION El presente trabajo de investigación, se realizó con el fin de validar el método de cuantificación de la potencia de Gentamicina solución inyectable, por el método de cilindro placa. La valoración microbiológica de antibióticos es un método analítico que permite bajo las condiciones adecuadas demostrar la actividad (potencia) de los antibióticos por medio de su efecto inhibidor sobre los microorganismos. La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas, mediante estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos, de que un método de análisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto dentro de intervalos definidos. El proceso de validación permite el conocimiento de las características de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo.1 Es necesario realizar la validación bajo las condiciones del laboratorio donde se llevará dicho estudio para valer los parámetros de desempeño de una metodología nueva. Mediante la validación de este método analítico, se pretendió la implementación de un nuevo análisis de verificación de calidad por lo cual el método que se validó pretendía establecer que las características de desempeño analítico cumplían con los requisitos para la aplicación analítica propuesta para lograr así que los resultados obtenidos fueran confiables para ser utilizados en la comprobación de las especificaciones de calidad. Para la validación se contó con los materiales e insumos necesarios para que pudiera ser implementada con toda seguridad y seriedad en el laboratorio de control de calidad de la USAM, y debido al respaldo analítico del laboratorio, este método de validación pretendía demostrar que es conciso y eficaz. Con este trabajo de tesis, se vio beneficiado el laboratorio de control de calidad de la USAM, debido a que contará con un método validado para estimar la potencia de Gentamicina soluciones inyectables y con esto podrá tener resultados repetibles y confiables en futuros análisis

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Velandia Castellanos JC, Validación del método bacitracina, Colombia

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CAPITULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La aplicación de los métodos oficiales debe ser demostrados dentro de las condiciones de trabajo de los laboratorios dedicados al análisis de productos farmacéuticos, si no se demuestra que es adecuado para el uso propuesto mediante la realización de la validación del método, se corre el riesgo de dar interpretaciones de resultados no confiables esto se traslada al usuario final de un producto farmacéutico, como por ejemplo un antibiótico, el cual podría no estar cumpliendo con especificaciones de calidad. ¿Será posible demostrar que el Método de Potencia de Antibiótico de Gentamicina Solución Inyectable por el procedimiento Cilindro-Placa: Cumple con los parámetros de desempeño establecidos en una Validación analítica?

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1.2. ANTECEDENTES Con el fin de conocer documentos relacionados al tema, se realizó una búsqueda de trabajos (tesis) que involucren validación de métodos, encontrándose: 

Aguilar Chavarría MA. Control de Calidad de tres antibióticos de mayor consumo en El Salvador. [Tesis para optar al grado de Licenciatura en Química y farmacia]. El Salvador: Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer. Facultad de Química y Farmacia; 1989. El Control de Calidad se determinó en los antibióticos siguientes: ampicilina, tetraciclina y eritromicina en la forma farmacéutica de tabletas y capsulas, para estimar la potencia de antibióticos de ampicilina y eritromicina se utilizó el método de cilindro-placa utilizando como microorganismo de prueba C. sarcina lutra, los resultados del análisis para ampicilina se consideran satisfactorios ya que de las nueve muestras tomadas solo una estaba por debajo del límite inferior (90%) del principio activo, de igual manera los resultados de eritromicina, evaluados bajo el mismo método se consideran buenos ya que de las cuatro muestras tomadas, una de estas con un mes antes de vencimiento según fecha de expiración, su potencia se considera baja del límite inferior. La potencia del antibiótico tetraciclina se evaluó según el método de turbimetría, encontrándose todas las muestras analizadas (tres) entre los límites establecidos según monografía. Otras pruebas realizadas a los productos fueron: Disolución para ampicilina y tetraciclina, Determinaciones físicas: pruebas de Perdida por secado y Contenido de agua, así como Análisis de Material de Empaque, concluyendo que de 19 muestras analizada entre los tres antibióticos se rechaza el 21% de los productos.



Barrientos Cuellar AM, Bertrand Rodríguez FR. Validación del Método de Análisis por HPLC para Cremas de Hidrocortisona distribuidas en el país. [Tesis para optar al grado de Licenciatura en Química y farmacia]. El Salvador: Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer. Facultad de Química y Farmacia; 2000. En la Validación del Método Analítico por HPLC, se evaluaron los siguientes parámetros al método: Selectividad, Repetibilidad, Exactitud, Robustez, las cuales cumplieron, por lo que se estima que las modificaciones realizadas al método oficial, no interfieren en la confiabilidad del

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método, es decir que el método propuesto llena los requerimientos para las aplicaciones analíticas pretendidas.



Corado Hernández GM, Silhy Zacarías VM. Validación de un Método Analítico por Espectrofotometría UV-Visible para la cuantificación del contenido de Ácido Glutámico en Jarabes. [Tesis para optar al grado de Licenciatura en Química y farmacia]. El Salvador: Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer. Facultad de Química y Farmacia; 2008. Para la Validación del Método No oficial se evalúan parámetros: Sobre el Sistema, la Linealidad; Sobre el Método, Linealidad, Exactitud, Precisión, Especificidad, por lo que el Método de espectrofotometría UV-Visible para cuantificación de Acido glutámico en jarabes, cumple con todos los parámetros requeridos en la validación categoría I, por lo cual ha sido validado y puede ser utilizado como método alterno.



Morales Meza JD. Implementación y Desarrollo de la Técnica de Potencia Microbiológica de Antibióticos y su Impacto Económico en la empresa Calox de Costa Rica, S.A. [Proyecto para optar por el título de Ingeniería en Biotecnología con el grado académico de Bachillerato Universitario]. Costa Rica: Instituto Tecnológico de Costa Rica. Escuela de Biología, 2007. Se establece y estandariza el protocolo para llevar a cabo la prueba de potencia o actividad de antibióticos basándose en la metodología USP (U. S. Pharmacopeia) y según los recursos con que cuenta la empresa para la cuantificación de la potencia bacteria de Neomicina y Gentamicina ambos crema por medio del método de cilindro-placa, utilizando como microorganismo de prueba S epidermidis, en el presente estudio todos los ensayos realizados a productos con Neomicina dentro de su composición presentaron en los datos obtenidos de la curva estándar un porcentaje de correlación superior a 98 de modo que la prueba puede aceptarse como válida y proceder a la determinación del porcentaje de potencia microbiológica.

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1.3. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN La exigencia de demostrar el desempeño en la aplicación de métodos de análisis y la necesidad de respaldar con evidencias objetivas el cumplimiento de parámetros, hizo necesario realizar esta validación del método analíticos para productos farmacéuticos establecido, que son una herramienta que brinda información sobre la calidad de los resultados que se obtienen, así como también en el control de calidad de un antibiótico se requieren de análisis específicos por medio de la valoraciones microbiológicas, que sometidas a un proceso de validación garanticen de forma consistente y permanente la confiabilidad y validez de los datos obtenidos y así juzgar la calidad del producto exigidos por: el Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA 11.03.39:06) de productos farmacéuticos, titulada “Validación de métodos analíticos para la evaluación de la calidad de los medicamentos”.

Al validar el método analítico, se crea evidencia documentada de un alto grado de confianza, que el procedimiento descrito suministrará una serie de direcciones precisas y definitivas del método analítico que deben seguirse al realizarse y efectuarse en el laboratorio para garantizar y cumplir los requerimientos de la aplicación analítica propuesta.

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1.4 LIMITACIONES 1. No se contó con un estándar primario de Gentamicina USP, por lo que se trabajó con un estándar secundario caracterizado contra un estándar primario USP. 2. No se contó con un llenado automatizado para los cilindros de placa, por esto se realizó un llenado manual utilizando micropipetas calificadas.

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1.5. OBJETIVOS 1.5.1. Objetivo general Validar el Método de Potencia de Antibiótico de Gentamicina Solución Inyectable, por el Método de Cilindro Placa

1.5.2. Objetivos específicos 1.5.2.1. Elaborar un Protocolo de Validación donde se definan los criterios de los parámetros de desempeño a validar. 1.5.2.2. Ejecutar la Validación del Método de Potencia de Antibiótico de Gentamicina solución inyectable por el Método de Cilindro-Placa. 1.5.2.3. Crear evidencia documentada para la declaración de validez, mediante el procesamiento de datos para la elaboración de un Dictamen de Validación.

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CAPITULO II. MARCO TEÓRICO

2.1. MARCO TEORICO 2.1.1 ANTIBIÓTICOS 2.1.1.1. Definición Un antibiótico es, por definición, aquel que se opone a la vida. Los antibióticos son sustancias utilizadas para impedir el desarrollo de microorganismos en el cuerpo humano. Algunos antibióticos, como la penicilina, el primer antibiótico descubierto por Fleming en 1929, son históricamente naturales, pero ahora la mayoría son antibióticos sintéticos. El antibiótico actúa por mecanismos diferentes en función de su naturaleza y su objetivo es bloquear la proliferación de los microorganismos inhibiendo alguno de los pasos de su desarrollo. Los antibióticos se prescriben en caso de infecciones bacterianas únicamente, y pueden utilizarse más de uno para tratar algunas infecciones severas. Los antibióticos se deben prescribir de forma correcta, ya que las bacterias desarrollan mecanismos de resistencia a los antibióticos que reducen su e ficacia. Un antibiótico es una sustancia químicamente definida, producida en el metabolismo de células vivas y aislada de ellas por primera vez, o uno de sus derivados producidos por métodos sintéticos o biocinéticos, el cual ejerce su acción bacteriostática o bactericida en pequeña concentración contra microorganismos vegetales y animales. Bacteriostático: Inhibición o interrupción de la multiplicación microbiana tras un periodo variable de latencia, en general reversible Estos antimicrobianos inhiben la multiplicación, no destruyen, son antibióticos bacteriostáticos de tal manera que cuando el microorganismo desaparece puede volver a crecer, el fin es que el sistema inmune acabe con ellos después de haber tomado el antibiótico. (Thrum y Bocker, 1971) Bactericida: Eliminación irreversible de los gérmenes en periodo de reproducción o reposo sin daño para el microorganismo. Las condiciones previas son: dosificación óptima, necesaria duración terapéutica, concentración suficiente donde esté localizada la infección.

2.1.2. GENTAMICINA Es un medicamento Antibiótico, Amino glucósido de administración parenteral, tópica y uso oftálmico. Tiene efecto concentración dependiente, efecto post-antibiótico prolongado y acción sinérgica con antibióticos Betalactámicos. Posee un espectro antimicrobiano principalmente frente a bacterias Gram Página | 18

negativas (Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Proteus, Serratia) y tiene actividad frente a ciertas bacterias Gram positivas (S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes). En combinación con antibióticos Betalactámicos es eficaz en infecciones producidas por E. fecalis y Streptococccus Sp. No es capaz de

atravesar la pared intestinal y su administración sólo se puede hacer

por vía intravenosa o intramuscular. Se utiliza para el tratamiento de las infecciones articulares, cutáneas, otorrinolaringólogas, pulmonares, urinarias, meníngeas o, incluso, para luchar contra las septicemias. La gentamicina también puede ser aplicada localmente, sobretodo en oftalmología en caso de conjuntivitis, keratitis de origen bacteriano o en casos de úlcera de la córnea.

2.1.2.1. Farmacocinética Con posterioridad a la administración intramuscular de Gentamicina inyectable, las concentraciones séricas pico usualmente se producen entre los 30 y 60 minutos, y los niveles séricos son medibles durante 6 a 8 horas. Cuando la gentamicina se administra por infusión intravenosa en un periodo de 2 horas, las concentraciones séricas son similares a las obtenidas con la administración intramuscular. En los pacientes con función renal normal las concentraciones séricas máximas de gentamicina (mcg/ml) usualmente alcanzan hasta cuatro veces el valor de la dosis intramuscular (mg/kg) administrada en cada aplicación. Si bien se esperan algunas variaciones debidas a un número de variables tales como edad, temperatura corporal, superficie corporal y diferencias fisiológicas, el paciente individual que recibe la misma dosis tiende a presentar concentraciones similares en repetidas determinaciones. La gentamicina administrada a la dosis de 1 mg/kg cada 8 horas, durante el periodo usual de tratamiento de 7-10 días, a pacientes con función renal normal no se acumula en el suero. Al igual que todos los aminoglucósidos, la droga puede acumularse en el suero y los tejidos de pacientes tratados con dosis más altas y/o durante periodos prolongados, particularmente en presencia de insuficiencia de la función renal. En pacientes adultos, el tratamiento con dosis de Gentamicina de 4 mg/kg/día o mayores, durante 7-10 días puede determinar un incremento leve y progresivo de las concentraciones máximas y mínimas. En los enfermos con insuficiencia renal la gentamicina se depura más lentamente del organismo que en los pacientes con función renal normal. Cuanto mayor es el grado de insuficiencia, más lenta es la depuración plasmática. (Se debe ajustar la dosis). La transformación metabólica es escasa o nula; la droga se excreta principalmente por filtración glomerular. Después de varios días de tratamiento, la cantidad de Gentamicina excretada en orina se aproxima a la dosis diaria administrada. Como ocurre con otros Aminoglucósido, una pequeña cantidad de la dosis de Gentamicina puede retenerse en los tejidos, especialmente en los riñones. Página | 19

Se han detectado pequeñas cantidades de Amino-glucósidos en la orina semanas después de haberse interrumpido la administración de la droga. La depuración renal de la Gentamicina es similar a la de la creatinina endógena. En los pacientes con marcada insuficiencia de la función renal, se observa una disminución de la concentración de amino-glucósidos en orina y de su penetración en el parénquima renal defectuoso. Este descenso en la excreción de la droga, junto con la potencial nefrotoxicidad de los aminoglucósidos, debe tenerse en cuenta cuando se tratan pacientes de este tipo con infecciones del tracto urinario. La Gentamicina atraviesa las membranas peritoneales y la placentaria. Dado que los Aminoglucósido difunden pobremente en el espacio subaracnoideo después de la administración parenteral, las concentraciones de Gentamicina en el líquido cefalorraquídeo usualmente son bajas y dependen de la dosis, la velocidad de penetración y el grado de inflamación meníngea

2.1.2.2. Posología y administración Las dosis recomendadas para la administración intramuscular y endovenosa son idénticas. Gentamicina inyectable también puede administrarse por vía subcapsular (cápsula de Tenon). Antes del tratamiento se debe determinar el peso del paciente para calcular la dosis correcta. Gentamicina inyectable no debe mezclarse físicamente con otros medicamentos, sino que debe administrarse por separado de acuerdo con la vía de administración y el esquema de dosificación recomendados. Es aconsejable determinar las concentraciones séricas máximas y mínimas de Gentamicina para asegurar niveles adecuados, pero no excesivos. Después de la administración intravenosa o intramuscular de Gentamicina inyectable dos o tres veces por día, es esperable hallar una concentración máxima de 4 a 6 mcg/ml, medida 30 minutos a una hora luego de la administración. La duración usual del tratamiento para todos los enfermos es de siete a diez días. En las infecciones complicadas puede ser necesario un curso más largo de tratamiento. En dichos casos se recomienda la observación estrecha de la función renal auditiva y vestibular, ya que es más probable que ocurra toxicidad cuando el tratamiento se extiende por más de diez días. La dosificación deberá reducirse si esta clínicamente indicado.

2.1.2.2.1. Administración intramuscular Pacientes con función renal normal Adultos: La dosis recomendada de Gentamicina inyectable para enfermos con infecciones graves y función renal normal es de 3 mg/kg/día, administrados en tres dosis iguales cada ocho horas o dos dosis iguales cada 12 horas o una única dosis diaria.

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2.1.2.2.2. Administración intravenosa La administración intravenosa de gentamicina puede ser particularmente útil en el tratamiento de enfermos con septicemia o de aquellos en estado de shock. Esta puede ser también la vía de administración preferida para algunos enfermos con insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos hematológicos, quemaduras graves o aquellos con reducción de la masa muscular. Para la administración intravenosa en adultos, una dosis única de gentamicina inyectable puede diluirse en 50 a 200 ml de solución salina normal estéril o en una solución estéril de dextrosa en agua al 5%; en lactantes y niños, el volumen de diluyente debe ser menor. La solución puede administrarse por infusión durante un periodo de media hora a dos horas. En ciertas circunstancias una dosis única de gentamicina inyectable sin diluir también puede administrarse directamente en una vena o en la tubuladura de infusión, lentamente, en un periodo de 2 a 3 minutos.

2.1.2.2.3. Administración subconjuntival y administración subcapsular (capsula de tenon) La administración de Gentamicina inyectable por vía subconjuntival ha resultado efectiva y segura en el tratamiento de infecciones bacterianas oculares profundos y graves producidas por microorganismos sensibles. También se ha empleado eficazmente en asociación con la penicilina, antes y después de la cirugía ocular, siempre que se halle presente o se sospeche una infección bacteriana. Las inyecciones subconjuntivales y subcapsulares (cápsula de Tenon) deben ser efectuadas únicamente por quienes posean experiencia en este tipo de aplicación. La dosis usual de Gentamicina inyectable varía de 10 a 20 mg, dependiendo de la gravedad de la infección ocular.

2.1.2.3. Esquemas posológicos específicos Infecciones del tracto urinario (ITU): Los pacientes con infecciones urinarias, especialmente si son crónicas y recurrentes, y sin evidencia de insuficiencia renal, pueden tratarse con una dosis diaria única de 160 mg de Gentamicina administrada por vía intramuscular durante 7 a 10 días.

2.1.2.4. Contraindicaciones Pacientes con antecedentes de hipersensibilidad o reacciones tóxicas graves a la Gentamicina o a otros Aminoglucósidos.

2.1.2.5.

Precauciones y advertencias Los enfermos tratados con Aminoglucósidos deben

permanecer bajo estricta vigilancia médica debido a la potencial toxicidad asociada con su uso. Se recomienda el monitoreo de la función renal y del octavo nervio craneano durante el tratamiento, particularmente en los pacientes con función renal disminuida, conocida o sospechada. La orina debe examinarse para establecer si hay disminución de la gravedad específica, aumento en la excreción de Página | 21

proteínas, o presencia de células o cilindros. Periódicamente debe determinarse el nitrógeno ureico en sangre, la creatinina sérica o la depuración de creatinina.

2.1.2.6. Reacciones adversas Nefrotoxicidad: Se han comunicado efectos adversos renales, como lo demuestra la presencia de cilindros, células o proteínas en la orina, o el incremento de la uremia, nitrógeno no proteico, creatinina sérica y oliguria. Los efectos adversos renales ocurren más frecuentemente en los pacientes con antecedentes de insuficiencia renal y en aquéllos tratados durante períodos más prolongados o con dosis más altas que las recomendadas.

2.1.3. Staphylococcus epidermidis. 2.1.3.1. Generalidades Staphylococcus epidermidis es una especie bacteriana perfectamente redonda del género

Staphylococcus

y familia Staphylococcaceae. Crece en grupos y vive generalmente en la piel humana. Fue originalmente llamada Staphylococcus albus. La bacteria Staphylococcus epidermidis no mantiene el tinte violáceo cuando se tiñe con el método de Gram (bacterias gram-negativo) y casi todas las cepas de Staphylococcus epidermidis no producen la enzima coagulasa que induce la coagulación. La bacteria Staphylococcus epidermidis crece por respiración aeróbica (convierte el oxígeno en dióxido de carbono) o por fermentación (divide compuestos orgánicos complejos en sustancias simples). Staphylococcus aureus se destaca como un importante patógeno humano, produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. En la comunidad, las infecciones por S. aureus son a menudo agudas, piogénicas y superficiales, aunque también puede producir, con menor frecuencia, infecciones profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial, S. aureus es un importante agente de infecciones de herida quirúrgica, de prótesis y otras. También S. aureus es causa de una serie de infecciones producidas por toxinas como el síndrome del shock tóxico, la intoxicación alimentaria y el síndrome de piel escaldada. Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de piel, pero produce infecciones crecientes de piel.

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2.1.3.2. Taxonomía Los miembros del género Staphylococcus son catalasa positivos y hasta hace poco formaban parte de la familia Micrococacceae junto a los géneros Planococcus y Stomacoccus. Estudios genéticos han demostrado que Staphylococcus y Micrococcus no están relacionados. Los estafilococos son cocos Gram positivos, catalasa positiva y el diamino ácido en el peptidoglicano es la L-lisina. El género Staphylococcus posee alrededor de 30 especies, de las cuales destacaremos S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis.

2.1.3.3. Morfología microscópica Gram positivos que poseen tendencia a agruparse en racimos. Tienen una forma esférica y un diámetro de alrededor de una micra.

2.1.3.4. Hábitat Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de la superficie corporal donde sobrevive gracias a sus lipasas, mientras S. aureus se encuentra habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas húmedas como pliegues inguinales y axilas. A nivel del vestíbulo nasal anterior la adherencia parece estar mediada por el contenido en ácidos teicoicos. Se estima que el índice de portación nasal en los adultos es de alrededor del 20-30%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30% de la población puede ser portador permanente, el 50% portador intermitente y el 20% no es colonizado. Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonización mayor como el personal de salud, los pacientes en hemodiálisis, diabéticos, adictos a drogas intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de virulencia, puede convivir con el huésped humano formando parte de su flora normal sin causar ningún daño

2.1.3.5. Metabolismo En cuanto a la forma de obtener su energía a través de la fermentación y de la respiración. En cuanto a los requerimientos de cultivo, son no exigentes desde el punto de vista nutricional, creciendo en medios pobres y simples. En su relación con el oxígeno son aerobios-anaerobios facultativos.

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2.1.3.6. Resistencia a agentes físicos y químicos Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir hasta tres meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a temperaturas mayores de 60 °C por una hora. En cuanto a los agentes químicos, es sensible a la mayoría de los desinfectantes y antisépticos, que lo matan en pocos minutos.

2.1.3.7. Resistencia antibiótica S. aureus puede poseer resistencia para diferentes antimicrobianos. En general los estafilococos aislados de infecciones comunitarias, hasta hace poco tiempo, no poseían muchos genes de resistencia salvo por la producción de penicilinasa. Sin embargo, actualmente asistimos a la emergencia de cepas comunitarias resistentes a meticilina u oxacilina (ver más adelante). En cuanto a los aislamientos de origen nosocomial, un elevado porcentaje de los mismos tienen varios determinantes de resistencia y fundamentalmente resistencia a meticilina, asociada a resistencia a aminoglucósidos, macrólidos y quinolonas.

2.1.3.7.1. Resistencia a β-lactámicos Existen variados mecanismos que median resistencia a β-lactámicos. La producción de β- lactamasa inactiva ciertos β-lactámicos por medio de hidrólisis del anillo β-lactámico. Estas enzimas atacan a la penicilina G, ampicilinas, carboxipenicilinas y ureidopenicilinas. El producto de hidrólisis carece de actividad antibacteriana. Más del 90% de los aislamientos de S. aureus produce este tipo de enzimas, también llamadas penicilinasas. Parte de la enzima que se produce es excretada al medio externo y parte permanece adherida a la membrana celular. Se han reconocido cuatro variantes de β-lactamasa llamadas A, B, C y D. En la mayoría de los aislamientos esta enzima es codificada por plásmidos, pero también se puede encontrar a nivel cromosómico como parte de un elemento transponible. Por otro lado, tenemos la resistencia a meticilina u oxacilina. Ésta consiste en la producción de una nueva proteína fijadora de penicilina (penicillin-binding protein) PBP, llamada PBP2a o PBP2, no presente en las cepas sensibles. Esta nueva PBP tiene una afinidad disminuida por la mayoría de los β-lactámicos y cefalosporinas.

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2.1.4. VALIDACION 2.1.4.1. Definiciones 

Acción documentada que demuestra que un procedimiento, proceso, equipo, material, actividad o sistema conducen a los resultados previstos. (RTCA BPM 11.03.42:07).



La validación de un procedimiento analítico es un proceso que establece, mediante estudios en el laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas prevista (USP 38).

2.1.4.2. Métodos Susceptibles a ser Validados Son validables los métodos analíticos clasificados en la siguiente forma: a. Ensayos de identificación b. Ensayos para la identificación del analito de interés de una materia prima o de una especificidad farmacéutica. c. Ensayos para la determinación de características inherentes. d. Ensayos de límite de impurezas y de cuantificación de impurezas. e. Ensayos para la determinación de analitos en líquidos biológicos y en productos naturales. f. Ensayos microbiológicos. No es recomendable considerar ningún método oficial o de farmacopea totalmente validado para una especificación, puesto que difícilmente tendrá los mismos componentes ni la misma proporción de estos.

2.1.4.3. Datos requeridos para la validación de una determinación Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde valoraciones analíticas muy rigurosas hasta evaluaciones de tributos subjetivos. Considerando esta amplia variedad, es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de validación. A continuación, se indican las categorías de pruebas más habituales para las que se exigen datos de validación:

Categoría I: los procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes, en productos farmacéuticos terminados.

Categoría II: los procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel o de productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. En estos análisis incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite. Página | 25

Categoría III: los procedimientos analíticos para la determinación de las características de desempeño (por ejemplo, disolución, liberación del fármaco).

Categoría IV: pruebas de identificación De acuerdo al Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA 11.03.39.06) de Productos Farmacéuticos, titulada “ VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA LA EVALUACIÒN DE LA CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS” Tabla 1: Parámetros de desempeño de procedimientos analíticos físico-químico y potencia microbiológica. Categoría de Categoría Categoría tipo II Categoría Categoría prueba I tipo II tipo IV Prueba de limite Cuantitativa

Prueba de limite Cualitativa

Principio Parámetro de activo (s) desempeño Si Si * Exactitud Si Si No Precisión Si Si Si Especificidad No No Si Límite de detección No Si No Límite de cuantificación Si Si No Linealidad Si Si * Intervalo * Puede requerirse dependiendo de la naturaleza del ensayo.

Físico químico desempeño

Identificación

* Si * *

No No Si No

*

No

* *

No No

2.1.4.4. PARAMETROS DE DESEMPEÑO 2.1.4.4.1. Exactitud. es la proximidad de los resultados de pruebas obtenidas por ese método para un valor verdadero, es decir, que expresa la contigüidad de un resultado al valor verdadero, y la capacidad del método analítico para dar los resultados lo más próximo posibles a dicho valor. Sí la diferencia entre el valor encontrado y el valor verdadero es pequeña, la exactitud es buena

2.1.4.4.2. Precisión . Es el grado de concordancia entre resultados de pruebas individuales cuando el método es aplicado repetidamente a múltiples muestras de una muestra homogénea. También indica el Página | 26

grado de reproducibilidad del método analítico bajo condiciones normales de trabajo, es decir la capacidad del método para dar resultados semejantes cuando se aplica repetidamente a una muestra. La precisión de un método analítico es usualmente expresada por una desviación estándar o una desviación estándar relativa.

2.1.4.4.3. Repetibilidad. Se refiere a la precisión del método efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos aparatos y reactivos, en el curso de la misma serie de análisis efectuados Puede necesitarse utilizar dos concentraciones del analito (alta y baja) o más (alta, media y baja).

2.1.4.4.4. Reproducibilidad . Es la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre la misma muestra, pero en condiciones diferentes. Su ensayo debe estudiar las principales condiciones de variabilidad del método analítico: tiempo (diferentes días), analista e instrumentos. La reproducibilidad global se determina por el coeficiente de variación. Si se desea estudiar el efecto de cada una de las tres variables por separado (tiempo, analista e instrumentos), deberá realizarse un análisis de varianza.

2.1.4.4.5. Robustez. Evalúa los efectos de pequeños cambios en las condiciones operacionales del análisis sobre la fiabilidad del método analítico. Detecta factores que originan variaciones menores y los que necesitan de una atención especial debido a que dan origen a variaciones significativas.

2.1.4.4.6. Especificidad. Es la habilidad de fijar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puedan creer presentes como impurezas, productos de degradación o componentes matriciales.

2.1.4.4.7. Límite de detección. Se considera como la cantidad de analito más baja presente en una muestra, que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada bajo las condiciones experimentales. El límite de detección es usualmente expresado como la concentración del analito en la muestra (ppm, %,).

2.1.4.4.8. Límite de cuantificación. La cantidad más baja o mínima de analito en una muestra que ha sido determinada con precisión y exactitud aceptable bajo condiciones experimentales establecidas. El límite de cuantificación se expresa como la concentración del analito en la muestra.

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2.1.4.4.9. Linealidad y rango . Es la habilidad de obtener resultados de las pruebas de forma directa o por una transformación matemática bien definida, proporcional a la concentración del analito en muestras dentro de un rango dado. Dentro del término linealidad se encuentra implícita la proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta.

2.1.5. MÉTODO DIFUSIÓN EN PLACA O CILINDRO PLACA 2.1.5.1. Fundamento Se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a través de una capa de agar solidificada en una placa de Petri hasta inhibir totalmente el crecimiento del microorganismo añadido, en un área circular o zona de inhibición en torno del cilindro que contiene una solución del antibiótico.

2.1.5.1. Metodología general para el ensayo según USP38 Se colocan cantidades medidas de sustancias a ensayar en placas con medio de cultivo sólido inoculado con un microorganismo adecuado. Las placas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. Durante la incubación el agente antimicrobiano difunde hacia la zona que lo rodea y establece un gradiente de concentración, alcanzándose la 36 concentración inhibitoria mínima a cierta distancia. Conforme el microorganismo crece se forma un halo turbio, excepto en la región donde la concentración de la sustancia es por arriba de la concentración inhibitoria mínima; allí es donde se observa una zona de inhibición. El tamaño de dicha zona queda determinado por la sensibilidad del microorganismo, el tipo de medio de cultivo, las condiciones de incubación, la velocidad de difusión de la sustancia y su concentración. La zona obtenida es una zona clara (halo) de inhibición del crecimiento en torno a los reservorios. La base cuantitativa del ensayo es la relación entre el diámetro de las zonas de inhibición y la concentración de antibiótico.

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2.1.5.2. Especificaciones de USP 38 para el método difusión en placa o cilindro placa 2.1.5.2.1. Medios, microorganismos y estándar Seleccionar para cada antibiótico el medio y diluente adecuado y microorganismo a utilizar. Preparar el medio agar que en forma líquida e inoculado y homogenizado con una suspensión de microorganismos testigo y se coloca la cantidad de medio especificado para cada antibiótico. En el día del ensayo, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones, por lo general, con una diferencia de concentración entre diluciones sucesivas en una proporción de 1:1.25.

2.1.5.2.2. Material y cristalería - Utilizar cajas de Petri de 100 x 20 mm con una capa de agar llamada capa base del medio adecuado. - Utilizar cilindros de acero inoxidable con un diámetro externo de 8mm, diámetro interno de 6mm y 10mm de largo, a intervalos de 60º en un radio de 2.8 cm.

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CAPITULO III. HIPOTESIS

3.1. HIPOTESIS 3.1.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO: El método analítico de potencia de antibiótico para Gentamicina solución inyectable, cumple con los parámetros de validación establecidos.

3.1.2. HIPÓTESIS NULA: El método analítico de potencia de antibiótico de Gentamicina solución inyectable no cumple con los parámetros de validación establecidos.

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CAPITULO IV. MATERIALES Y METODOS

4.1. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1.1. MATERIALES 4.1.1.1. Siembra de Staphylococcus epidermidis y obtención de suspensión madre 1 placa de Petri 90 x 15 mm con agar antibiótico Nº 1 2 tubos de 22x200 mm con agar inclinado de medio antibiótico Nº 1 1 botella de Roux con agar antibiótico Nº 1 o 2 Placas de Petri 90 x 15 mm con agar antibiótico Nº 1 Perlas de ebullición estériles 1 asa de platino 1 mechero 1tubo de ensayo 22 x 200 mm con 15 mL de solución salina estéril 1 balanza analítica

4.1.1.2. Estandarización de la suspensión de microorganismos 3 tubos de ensayo estériles de 22 x 200 mm 1 tubo de 9 mL de solución estéril para Blanco 1 Erlenmeyer de 50 mL estéril 1 espectrofotómetro UV/Vis 2 pipetas morh de 5 mL estériles 1 frasco lavador 2 pipetas morh de 1 mL estériles (o micropipetas y puntas estériles) 6 tubos de ensayo de 15 x 200 mm con 9 mL de solución salina estéril

4.1.1.3. Preparación de las placas de prueba Placas de Petri 100 x 20 mm estériles 1 Erlenmeyer de 500 mL con 450 mL de Medio Antibiótico Nº 11 1 balanza semianalítica Baño maría a 45 º C Página | 33

1 Erlenmeyer de 125 mL con 100 mL de Medio Antibiótico Nº 11 1 pipeta monocanal de 100 a 1000 microlitros con puntas 2 pipetas Morh de 25 mL despuntadas estériles 2 pipetas Morh de 5 mL despuntadas estériles

4.1.1.4. Preparación de las soluciones 4.1.1.4.1. Estándares 4.1.1.4.1.1. Preparación de solución stock Estándar Gentamicina Sulfato (con Certificado con instrucciones de preparación o con potencia asignada). Micro-espátula Pipeta volumétrica Balones volumétricos Porta muestra estéril Balanza analítica Beaker de 250 mL estéril 250 mL de buffer fosfato pH 8.0 (B3) estéril

4.1.1.4.1.2. Preparación del estándar “S1”, “S2”, “S3”, “S4” y “S5”. Micro-bureta Balones volumétricos Beakers Pipeta Pasteur 1 litro de buffer fosfato pH 8.0 (B3) estéril

4.1.1.4.2. Muestras Mínimo 15 viales de Gentamicina de 80 mg/2 mL Jeringa de 3 mL para extraer contenido de los viales. Erlenmeyer de 50 mL con rosca estéril Beaker de 100 o 250 mL Página | 34

Pipeta Pasteur Agitador de vidrio estéril Pipetas volumétricas Balones volumétricos 1.5 litros de buffer fosfato pH 8.0 (B3) estéril

4.1.1.5. Colocación y llenado de cilindros. Baño de agua ajustado a 47.5 º C Cilindros de acero inoxidable Micropipetas con capacidad para medir 200 microlitros Pinzas estériles (o aparato colocador de cilindros) y molde para colocar cilindros Puntas descartables estériles adecuadas para medir 200 microlitros 12 copitas medidoras Incubadora a 36-37.5 º C.

4.1.1.6. Lectura de Halos de inhibición Lector de halos de inhibición (pie de rey, vernier, etc).

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4.2. METODOLOGÍA 4.2.1. Tipo de estudio - Experimental: se basa a la realización de ensayos dentro de un laboratorio de control de calidad. - Prospectiva: se desarrolla la investigación según la obtención los resultados en un lapso de tiempo determinado.

4.2.2. Tiempo y lugar El desarrollo experimental se realizó en las áreas fisicoquímicas y microbiológicas del Laboratorio de Control de Calidad USAM, donde se proporcionarán los estándares, reactivos, materiales y equipos calificados para la validación.

4.2.3. Universo y muestra Las muestras son obtenidas comercialmente de farmacias provenientes de un laboratorio nacional, utilizando de 15-20 viales de un mismo lote de fabricación.

4.2.4. Recolección y Análisis de los datos La recolección de investigación bibliográfica se realiza en bibliotecas de Universidades nacionales y bibliotecas virtuales de artículos científicos relacionados con Validación de Potencia de Antibióticos con otros principios que no son de interés de este estudio, para la recolección de lecturas en los procedimientos se utilizarán hojas diseñadas para el uso previsto, luego serán introducidos en hojas de cálculos validadas predeterminados por el laboratorio.

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CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. RESULTADOS

5.1.1. PROTOCOLO DE VALIDACION DEL METODO ANALITICO

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PROTOCOLO DE VALIDACIÓN Página: 1 de 10 LABORATORIO CONTROL USAM PROTOCOLO Nº: 30 Revisión: 0 Código: PVGI30 Título: VALIDACIÓN DE POTENCIA DE ANTIBIOTICO EN GENTAMICINA SOLUCION INYECTABLE 80 mg/2mL POR EL MÉTODO DE CILINDRO-PLACA Elaborado por: Revisado por: Eg. Ricardo José Aguiluz Moreno Lic. Gracia Magaña Eg. Nelson Salomón Zamora Díaz Lic. Martha Ruth Marroquín Elaboración: 07-06-2016 Aprobación: 21-06-2016

1.

OBJETIVO.

Demostrar que el Método Analítico de la valoración de Gentamicina Sulfato Inyección por Potencia de Antibióticos es confiable, y proporcionará resultados consistentes y repetitivos que cumplen con los parámetros de desempeño establecidos.

1.1.

ALCANCE:

Gentamicina Sulfato Inyección

1.2.

Formula Cuali-Cuantitativa:

Contenido declarado: 80 mg / 2 mL

2.

RESPONSABLES:

Ricardo José Aguiluz Moreno Nelson Salomón Zamora

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2.1.

PARAMETROS A ESTUDIAR:

DEL MÉTODO: Especificidad. Exactitud. Recobro. Linealidad. Precisión. Repetibilidad. Precisión Intermedia.

3.

3.1.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO. Reactivos: Solución Amortiguadora B.3 Agar Antibiótico N 11 Agar Antibiótico N1

3.2.

Estándares:

-

Gentamicina Sulfato

-

Staphylococcus epidermidis ATCC

12228

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3.3.

Material a Utilizar:

-

Balones volumétricos de 100.0mL

-

Placas Petri de vidrio 20X100 mm

-

Cilindros de acero inoxidable de 8mm de diámetro externo y 6mm de diámetro interno, 10mm de altura.

4.

EQUIPOS:

-

Incubadora

-

Medidor de halos

-

Micro-pipeta

4.1.

Preparación de reactivos.

Solución amortiguadora B.3 Pesar 16.73g de fosfato bibásico de potasio y 0.523g de fosfato monobásico de potasio para 1 litro de agua, pH después de la esterilización e sterilización 8.0 + 0.1 Agar antibiótico N11 Agar Antibiótico N1

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5.

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DE GENTAMICINA SULFATO

5.1 Condiciones generales para el ensayo Método de ensayo: cilindro placa Medio de cultivo capa base: (Tabla 4) Medio antibiótico N° 11, 21 mL. Medio de cultivo capa de siembra: (Tabla 3 inóculo) Medio N° 11, 4 mL (Tabla 5) Microorganismo Microorganismo de prueba: (Tabla 3) Staphylococcus epidermidis epidermidis ATCC 12228 Medio de preparación de suspensión inóculo: (Tabla 3) Medio antibiótico N° 1 Absorbancia de inóculo a 580 nm: 25%T Concentración de inóculo en el medio de cultivo: (Tabla 3) 0.03 mL por cada 100 mL de medio Concentraciones de estándar: (Tabla 2) 1.92, 2.4, 3, 3.75 y 4.68 µ g/mL Volumen de estándar o muestra a inocular en cada cilindro: 200 µL. Diluyentes de la prueba: (Tabla 2) B3 (Buffer ( Buffer fosfato pH 8, Tabla 12)

5.2 Técnica 5.2.1 Estandarización del microorganismo de prueba Tratar la cepa tipo KWIK-STIK pase 2, en presentación de hisopos con el microorganismo de prueba de la siguiente manera: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, proceder a hisopar en todas las direcciones sobre palcas conteniendo agar antibiótico Nº1, incubar 24 horas de 32-35ºC al cabo de las cuales se evidencia crecimiento; realizar lavados con SSN para colectar las colonias en tubos de ensayo; leer en el espectrofotómetro espectrofotómetro hasta obtener una transmitancia del 25% a 580nm

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5.2.2 Preparación de la curva Solución Madre: Pesar exactamente una cantidad de estándar equivalente a 100 mg de Gentamicina Sulfato Estándar Colocar en matraz volumétrico de 100 mL, disolver en B3 (1000 mcg/mL). Curva de calibración -

De la solución stock tomar una alícuota de 192 mcL, colocarla en un matraz volumétrico de 100 mL y llevar hasta el volumen con B3. Concentración final: 1.92 µg/mL

-


-


-


-


Página | 44


5.2.3 Preparación de la muestra Hacer un pool con 5 productos, seguir las instrucciones de la farmacopea para la preparación previa y hacer por triplicado las diluciones necesarias para llevar a una concentración de 3 µg/m. 80 mg

2 mL 0.1 mL

250.0 mL 1.9 mL

10.0 mL

5.3 Esquema Colocar en cada placa Petri 6 cilindros, preparando las repeticiones según el siguiente esquema

Una vez cargadas las placas de bioensayo se incubarán durante 16-18 h a 36-37.5 °C (Tabla 6). El antibiótico presente en el medio difundirá e inhibirá el crecimiento del microorganismo inoculado, dando lugar a halos de inhibición de crecimiento. Los tamaños de los halos de inhibición obtenidos se encuentran entre los 11 y 19 mm. Página | 45


6.

PROCEDIMIENTO PARA VALIDAR CADA PARÁMETRO:

6.1.

Precisión, Linealidad, Exactitud del Método.

LINEALIDAD DEL METODO ( EXACTITUD, PRECISION, RECOBRO Y ESPECIFICIDAD) Slc peso est mg V1 mL Stockug/mL 10 100 100 exactitud

%

activo mg 75 100 130

TOTAL X3

2,250

3,000

3,900

9,15 27,45

matriz Ml

mL Solc.st ug 2 2,25 2 3 2 3,9 6 9,15 18 27,45

V1 225,0 300,0 390,0

C fin ug/mL 100 2,25 100 3,00 100 3,90

El número total de determinaciones es de 9 (tres por cada nivel de concentración). NOTA: el estándar de trabajo que se utiliza para adicionar a las muestras debe ajustarse al 100%.

Preparación de las soluciones madres de estándares: (POR TRIPLICADO) Pesar 10.0mg de Estándar de Gentamicina Sulfato en balón volumétrico de 100.0mL Aforar con Solución Amortiguadora B.3 Concentración final 100 ug/mL.

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Preparación de la muestra a 75%. Tomar una alícuota de 2.25 mL de solución MADRE DE ESTANDAR balón volumétrico de 100 mL y agregar 2.0 mL de matriz llevar aforo con Solución Amortiguadora B.3

Preparación de la muestra a 100%. (Realizar tres alícuotas) Tomar una alícuota de 3.0 mL de solución MADRE DE ESTANDAR balón volumétrico de 100 mL y agregar 2.0 mL de matriz llevar aforo con Solución Amortiguadora B.3

Preparación de la muestra a 130%. (Realizar tres alícuotas) Tomar una alícuota de 3.9 mL de solución MADRE DE ESTANDAR balón volumétrico de 100 mL y agregar 2.0 mL de matriz llevar aforo con Solución Amortiguadora B.3 Procedimiento: Preparar 3 placas Petri por cada concentración de la siguiente manera: Agregar 21 mL de agar antibiótico N11 y 4mL de capa inoculo, colocar 6 cilindros en cada placa a los cuales se les colocara 200 µL de cada concentración según corresponda. Preparar 1 curva estándar según lo descrito en 5

ESPECIFICIDAD Preparar matriz y una muestra a una concentración (matriz + St de Gentamicina) para comparar la respuesta.

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Preparación de la Matriz: Tomar 2 mL de matriz y transferir a un balón volumétrico de 100 mL con diluyente.

Preparación de la muestra (matriz + principio activo): Tomar una alícuota de 3.0 mL de solución MADRE DE ESTANDAR balón volumétrico de 100mL y agregar 2.0 mL de matriz llevar aforo con Solución Amortiguadora B.3 Realizar las correspondientes Lecturas

6.2.

REPETIBILIDAD:

Preparar 6 determinaciones, preparando 6 estándares Gentamicina Sulfato y preparando 6 muestras de un lote de producto terminado al 100% según lo descrito en el numeral 5.

6.3.

PRECISION INTERMEDIA:

Se efectuará la precisión siguiendo las mismas indicaciones del apartado 6.2., utilizando como muestras soluciones del mismo lote de producto terminado, en días diferentes, por dos analistas diferentes. NOTA: Para la realización de este parámetro se pueden usar los resultados de la Repetibilidad de uno de los analistas.

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7.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:

PAR METRO DE

REPORTAR

LIMITE

Respuesta después de aplicar el método RECOBRO

Solo debida al analito

DESEMPEÑO 1. Especificidad

Prueba de Cochran

G exp < G tab

T Student

T exp < T tab

Porcentaje de recobro

98 -102%

LINEALIDAD DEL METODO 2. Exactitud

Coeficiente de determinación (r 2) Pendiente (β1) Intervalo de confianza de la pendiente IC (β1) Intervalo de confianza del intercepto IC (βo)

Rango lineal

≥ 0.95 ≠0

Incluye la Unidad Debe incluir el cero --------

PRECISION

3. Repetibilidad

4. Precisión Intermedia

Coeficiente de variación Global

≤ 2%

Promedio

--------

Coeficiente de variación

≤ 2%

Promedio

--------


≤ 2%

Prueba de Fisher

F exp < F tab

Prueba T student

T exp < T tab

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5.1.2. INFORME FINAL DE VALIDACION

Página | 50

INFORME FINAL DE VALIDACIÓN Página: 1 de 6 LABORATORIO CONTROL USAM INFORME Nº: 30 Código: IFGI30 Título: VALIDACIÓN DE POTENCIA DE ANTIBIOTICO EN GENTAMICINA SOLUCION INYECTABLE 80 mg/2mL POR EL MÉTODO DE CILINDRO-PLACA Elaborado por: Revisado por: Eg. Ricardo José Aguiluz Moreno Lic. Gracia Magaña Eg. Nelson Salomón Zamora Díaz Lic. Martha Ruth Marroquín Elaboración: 07-07-2016 Aprobación: 12-07-2016

INFORME FINAL 1. OBJETIVO: Proporcionar todos los resultados obtenidos en la Validación del Método Analítico de Gentamicina Sulfato por Potencia de Antibióticos para demostrar que es un método confiable, consistente y repetitivo que cumplió con los parámetros de desempeño establecidos.

2. ALCANCE: Gentamicina Sulfato solución inyectable

2.2.

Formula Cuali-Cuantitativa:

Contenido declarado: 80 mg / 2 mL

3. RESPONSABLES: Ricardo José Aguiluz Moreno Nelson Salomón Zamora Díaz

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4. DESCRIPCION

DEL

METODO

ANALITICO

EMPLEADO

EN

LA

CUANTIFICACION Ver Protocolo de Validación código: PVGI30, revisión 0, apartado 5.

6. RESULTADOS ANALÍTICOS Y ESTADÍSTICOS DE LA VALIDACION DE GENTAMICINA SOLUCION INYECTABLE

EXACTITUD, LINEALIDAD, PRECISION Y ESPECIFICIDAD DEL METODO: % Teorico

% Encontrado

Promedio

DS

Varianza

Sln 1

75

76,7

73,3

73,3

74,58

1,9245

3,7037

Sln 2

100

100,0

100,0

96,7

99,17

1,9245

3,7037

Sln 3

130

130,0

126,7

126,7

128,33

1,9245

3,7037

Gexp

0,3333

G tab.

0,870

Gexp
Página | 52


% Teorico

% Recuperacion

Sln 1

75

102,2

97,8

97,8

Sln 2

100

100,0

100,0

96,7

Sln 3

130

100,0

97,4

97,4

t exp p n n-1

1,9374 0,05 9,0 8,0 2,3060

t tab(P=0.05)

Promedio DS CV PRECISION

98,81 1,82 1,84

CV<2 CUMPLE

texp
LINEALIDAD DEL METODO: Numero 1 2 3 4 5 6 7 8 9

dicionado X(ug) Recuperado Y(ug) 2,25

2,3

2,25

2,2

2,25

2,2

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0

2,9

3,9

3,9

3,9

3,8

3,9

3,8

Página | 53


Prom edio y/x DEST.F(Y/X)

CVf b1 bo r² r

probabilidad α

n n-2

0,98813 0,01816 1,838157557 0,969474969 0,054212454 0,99481 0,99740 0,05 9 7

t n-2,0.05

factor de respuesta

pendiente ordenada al origen coeficiente de determinaciòn coeficiente de correlaciòn

2,365 t de tabla 0,90690 b1- t0.95,n-2 sb1 intervalo de confianza de la 1,03205 b 1+ t 0.95,n-2 s b1 pendiente

IC ( ß1)

-0,14125 b0- t0.95,n-2 sb0 intervalo de confianza de la 0,24968 b0+ t0.95,n-2 sb ordenada

IC ( ßo)

2,3

Rango Lineal

a

3,9

mg

LINEAL IDAD DEL METODO

s o d a r e p u c e R g u

4,0

-1,00 -1,0

4,00

9,00

ug

Adicionados

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14,00


ESPECIFICIDAD La respuesta al aplicar el método es exclusivamente del analito.

REPETIBILIDAD Numero 1 2 3 4 5 6 promedio DS CV RESULTADO

% 97,0 97,1 97,7 97,4 98,2 97,1 97,4 0,462241

0,474499 CV<2 CUMPLE

PRECISION INTERMEDIA: Analis ta

NELSON 97,0 97,1 97,7 97,4 98,2 97,1

RICARDO 98,4 97,4 97,1 97,5 98,2 97,1

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Promedio Min (%) Max ( %)

DS CV% Varianza Promedio SD CV% S² Criterio Fcal
tcal
97,4 97,0 98,2 0,4622 0,4745 0,2137

97,6 97,1 98,4 0,5565 0,5701 0,3097

97,5 0,4988 0,5115 0,26 Resultado 1,45

F-cal

Fcalc
DECLARACION DE APTITUD DEL METODO El método es apto para el uso propuesto.

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5.1.3. RESULTADOS DE PARAMETROS DE DESEMPEÑO Tabla 2. Resultados de parámetros de desempeño

PAR METRO DE

REPORTAR

LIMITE

RESULTADOS

Respuesta después de aplicar el método

Solo debida al analito

Respuesta debido solo al analito

DESEMPEÑO 1. Especificidad

RECOBRO Prueba de Cochran

G exp < G tab

T Student

T exp < T tab

Porcentaje de recobro

98 -102%

G tab=0.87 G exp=0.33 t tab=2.3 t exp=1.9 98.8%

LINEALIDAD DEL METODO 2. Exactitud

Coeficiente de determinación (r 2)

≥ 0.95

0.99

≠ 0 Incluye la Unidad Debe incluir el cero --------

0.97 0.906901.03205 -0.141250.24968 2.3-3.9

Coeficiente de variación Global

≤ 2%

1.8

Promedio

--------

97.4%


≤ 2%

0.47

Promedio

--------

97.5%


≤ 2%

0.5 F tab=5.05 F exp=1.45 t tab=2.23 t exp=0.68

Pendiente (β1) Intervalo de confianza de la pendiente IC (β1) Intervalo de confianza del intercepto IC (βo) Rango lineal

PRECISION

3. Repetibilidad

4. Precisión Intermedia

Prueba de Fisher

F exp < F tab

Prueba T student

T exp < T tab

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5.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS En la validación de potencia de antibiótico en Gentamicina solución inyectable por el método de cilindro placa llevado a cabo en esta investigación, los parámetros a estudiar se definen y se seleccionan en función de las características de la muestra, tipo de método analítico y rango de concentración del analito. En comparación con otros trabajos de validación de antibióticos o validaciones se encuentran concordancias entres los parámetros fijados de estudio, como ya ha sido mencionado, los parámetros a estudiar se esta blecen según el tipo de metodología, por ejemplo en la investigación “Validación del Método de Análisis por HPLC para Cremas de Hidrocortisona distribuidas en el país” se incluyen los

parámetros que en esta investigación se estudiaron los cuales son: especificidad, exactitud, Repetibilidad y precisión intermedia, en la investigación “Validación de un Método Analítico por Espectrofotometría UV-Visible para la cuantificación del contenido de Ácido Glutámico en Jarabes” igualmente se estudian los mismos parámetros pero incluyendo, linealidad del sistema ¿Por qué la diferencia de agregar otro parámetro de estudio, a qué se debe que no se incluya en la validación de potencia de Gentamicina? La validación llevada a cabo en esta investigación está basada bajo lineamientos establecidos USP, no se realizan cambios al método establecido, en cambio la validación para la cuantificación de ácido glutámico es un método que ha sido modificado y acondicionado a nuevas condiciones del lugar donde se lleva a cabo, por lo que se habla de un método no oficial de la USP por lo tanto debe demostrar que el método empleado contribuye a la obtención de resultados repetitivos. Para la investigación que se presenta, los parámetros en estudio son tomados de la Guía de Validación de métodos fisicoquímicos del Organismo Salvadoreño de Acreditación, ya que es el ente el cual ha acreditado al laboratorio de control de calidad de la USAM, cumpliendo con todos los elementos de cada parámetro de estudio que se reflejan en la tabla 2. Resultados de parámetros de estudio. Por lo que se establece que el método proporciona resultados repetitivo. Lo novedoso del estudio es que como resultados se presenta el Protocolo de validación y el Informe final de validación, dos documentos de suma importancia al momento de validar, requeridos según el Reglamento Centroamericano “ Validación de Métodos Analíticos para la Evaluación de la Calidad de

los Medicamentos” así sirviendo como un molde a estudiantes de Química y farmacia y todo aquel interesado en la validación de métodos analíticos.

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CONCLUSIONES -

Los resultados obtenidos en el recobro nos indican que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados con un G experimental de 0.3333 siendo menor al G de tablas que es de 0.870. El porcentaje promedio de recobro obtenido (100.0%) está incluido en el Intervalo de confianza de la media poblacional IC (µ) que es 98-101%.

-

En cuanto a la linealidad del método se puede concluir que existe buena correlación entre los microgramos de activo adicionados y los recuperados ya que se obtuvo un coeficiente de determinación de 0.9948 para y el Intervalo de confianza de la pendiente incluye la unidad

-

El método también muestra precisión aceptable pues el coeficiente de variación experimental es 1.84% y no sobrepasa el límite 2%.

-

Se comprueba la Especificidad del método ya que la placa que solamente contenía matriz no presento crecimiento de halos, lo contrario a la placa con matriz y estándar que, si tuvo crecimiento de halos, corroborando así que la matriz no presenta interferencias para el principio activo.

-

Se comprueba la Repetibilidad del método con un Coeficiente de variación menor a 2 % siendo de 042%. De igual manera en la Precisión Intermedia la prueba de Fischer nos indica que los datos experimentales en todos los puntos evaluados provienen de poblaciones con varianzas similares ya que en todos los casos el F calculado no es mayor al de tablas. Por otra parte, también se refleja que no existe evidencia de diferencia significativa entre las medias de cada una de las series de porcentajes pues los valores de t experimental son menores al de t de tabla a un nivel de confianza del 95%.

-

Se concluye que el método es apto para el uso propuesto.

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RECOMENDACIONES -

Colocar la capa base sobre una mesa con un nivel comprobado para asegurar la uniformidad del medio cultivo.

-

Colocar la capa inoculo habiendo esperado un tiempo prudencial, después de haber colocado la capa base.

-

Descartar para análisis aquellas placas en las cuales no se logra una capa uniforme debido a que puede contribuir a datos erróneos.

-

Colocar los cilindros sobre la capa inoculo habiendo esperado un tiempo prudencial luego de haber distribuido la capa inoculo.

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BIBLIOGRAFÍA

1. Velandia Castellanos JC. (2008). Validación Del Método Analítico Para La Cuantificación De Bacitracina En El Laboratorio De Control De Calidad De Una Industria Farmacéutica Veterinaria. Cali, Colombia: Pontificia Universidad Javeriana. 2.

Farmacopea de Los Estados Unidos, USP 38, Formulario Nacional, NF 33. EE.UU. (2015).

3. R.T.C.A. (2006). Productos Farmacéuticos, Validación de Métodos Analíticos para la Evaluación de la Calidad de los Medicamentos. En Reglamento Tecnico Centro Americano. Centro America. 4. Morales Meza JD. (2007). Implementación y Desarrollo de la Técnica de Potencia Microbiológica de Antibióticos y su Impacto Económico en la empresa Calox de Costa Rica, S.A. Costa Rica: Instituto Tecnológico de Costa Rica. Escuela de Biología: UCR. 5. Corado Hernández, Silhy Zacarías. (2008). Validación de un Método Analítico por Espectrofotometría UV-Visible para la cuantificación del contenido de Ácido Glutámico en Jarabes. Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer. Facultad de Química y Farmacia: USAM. 6. Barrientos Cuellar AM, Bertrand Rodríguez FR. (2000). Validación del Método de Análisis por HPLC para Cremas de Hidrocortisona distribuidas en el país. Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer. Facultad de Química y Farmacia; USAM.

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GLOSARIO -

Especificidad; selectividad: Capacidad de evaluar, medir e identificar simultánea o separadamente, los analitos de interés de forma inequívoca sin interferencias de impurezas, productos de degradación, compuestos relacionados, excipientes u otras sustancias previsibles presentes en la matriz de la muestra.

-

Exactitud; veracidad: Es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese método y el valor verdadero.

-

Intervalo: amplitud entre las concentraciones inferior y superior de analito (incluyendo esos niveles), en la cual se puede determinar el analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad utilizando el método según se describe.

-

Linealidad: capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras en un intervalo dado.

-

Método analítico: Adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado, en la cual se identifican los recursos materiales y el procedimiento.

-

Microorganismos viables: Organismos microscópicos como bacterias y hongos con capacidad de reproducción y dan lugar a la formación de colonias.

-

Parámetros de desempeño analítico; parámetros de mérito o elementos requeridos para el ensayo de validación: Características de validación que necesitan ser evaluadas y que típicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad e intervalo de linealidad.

-

Precisión: Expresa el grado de concordancia entre una serie de mediciones individuales obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea original o bien a partir de varias muestras obtenidas por dilución de la muestra bajo condiciones establecidas. Existen tres formas de determinación: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.

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-

Procedimiento analítico: Descripción detallada de los pasos necesarios para aplicar un método analítico.

-

Validación: Establecimiento de la evidencia documental que un procedimiento analítico conducirá con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos.

-

Validación de un procedimiento analítico: Procedimiento para establecer pruebas documentales

que demuestren científicamente que un método analítico tiene las

características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no sólo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales.

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ANEXOS

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ANEXO I: CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 2016

2015

Actividad

DIC

3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2

Presentación del tema Primera reunión con asesor Recolección de información Revisión / segunda reunión con asesor Recolección de información Revisión asesor Revisión de observaciones Presentación de anteproyecto Revisión de observaciones Corrección de observaciones Ejecución de practica Procesamiento de los datos Revisión final por jurado Defensa

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ANEXO II. IMÁGENES PARTE EXPERIMENTAL

ANEXO II. IMÁGENES PARTE EXPERIMENTAL

Preparación de las pruebas, en imagen: USP38, Protocolo de validación.

En imagen: Estándar de Gentamicina en frasco ámbar, al final frascos con solución buffer Nº 9

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Preparación: se muestra puntas para micropipetas, micropipeta, cristalería.

Frasco con bacterias S.epidermidids

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Empaques con bacteria

Preparación de la bacteria inoculo

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En ambas imágenes se muestra la prueba la transmitancia del inoculo Página | 69

Preparación de soluciones para la curva con soluciones estándares

Balones con muestra de repetibilidad 1

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Preparación de soluciones de muestra, se observa en la parte derecha inferior los viales de muestra

Preparación de los balones con soluciones de muestras, traslado de balones a copas de vidrio

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Preparación de la base a la cual se le inoculo la bacteria

Preparación de las placas para adicción de capa inoculada, en imagen se visualizan las placas, además la conexión de entrada de gas al mechero para evitar contaminación ambiental en las placas.

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Molde para la colocación manual de cilindros de acero inoxidable sobre las bases de agar en la placa, la flecha en círculo es la del inicio que concuerda con la flecha que las placas poseen.

Colocación de cilindros de acero inoxidable sobre placas (foto demostrativa, placa no utilizada en el proceso).

Página | 73

Llenado de cilindros colocados sobre las placas

Placas de curva del estándar con los cilindros llenados

Página | 74

Incubación de placas

Incubadora

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Placas después de incubar y se les ha retirado el cilindro de acero inoxidable

Lector de halos Página | 76

Validacion de potencia de antibiotico

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