Validacion de Tecnica Analitica Permetrina

“Año de la

Promoción de la Industria Responsable y del Compromiso Climático”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA PROYECTO DE TESIS

TÍTULO: Desarrollo y validación de un método analítico para la cuantificación de Permetrina 1% en Shampoo mediante Cromatografía Liquida de alta Resolución (HPLC). PRESENTADO POR LOS BACHILLERES: Bach: Ruddy Verónica Guardia Vargas. Bach: Susan Lizeth Elias Da Silva.

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE: QUÍMICO FARMACÉUTICO

ASESOR: Q. F. Luis Domingo Nonato Ramírez. Iquitos - Perú 2014

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DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PERMETRINA 1% EN SHAMPOO MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC). Bach: Ruddy Verónica Guardia Vargas. Bach: Susan Lizeth Elias Da Silva.

RESUMEN Se desarrolló y validó una nueva técnica de análisis por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para la cuantificación de Permetrina 1% en Shampoo, de acuerdo a la exigencia y normatividad vigente referida a Buenas Prácticas de Fabricación de productos farmacéuticos (USP 36). La técnica de análisis se realizó mediante el tipo de muestreo aleatorio al azar, se tomó en cuenta la preparación de la muestra para que el principio activo pueda ser cuantificado en un sistema (fase móvil, columna cromatográfica y longitud de onda). Como paso previo a la validación de la técnica de análisis, se evaluó la aptitud del sistema cromatográfico, asegurando de esta manera, el funcionamiento adecuado del mismo. Posteriormente, se procedió a la validación del método de análisis evaluando los parámetros que indican las obras oficiales, como son: selectividad, linealidad, precisión, exactitud y robustez. Seguidamente, se elaboró el Protocolo de validación del método, para lo cual se contó con el diseño experimental y los procedimientos estadísticos, concluyéndose así que el método analítico propuesto es selectivo, porque permite el análisis del principio activo sin la interferencia de los excipientes presentes en la formulación del Shampoo, es lineal, porque los resultados obtenidos son directamente proporcionales a la concentración de analito en la muestra, es preciso, porque nos permite obtener resultados repetitivos y reproducibles, cuando este es aplicado en análisis repetitivos de la misma muestra y es exacto, ya que permite la recuperación de la totalidad de analito presente en la muestra, comprobándose así su validez.

Palabras claves: -

Permetrina.

-

Cromatografía líquida de alta resolución.

-

Método analítico.

-

Validación.

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DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A QUANTITATIVE ANALYTICAL METHOD FOR permethrin 1% SHAMPOO IN LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC). Bach: Ruddy Verónica Guardia Vargas. Bach: Susan Lizeth Elias Da Silva.

ABSTRACT Was developed and validated a new analysis technique for liquid chromatography (HPLC) for the quantification of Permethrin 1% by Shampoo, according to the requirement and current regulations relating to good manufacturing practices for pharmaceutical products (USP 36). The technique of analysis was performed using the type of random sampling randomly, took into account the sample preparation for the active substance can be quantified in a system (mobile phase chromatographic column and wavelength). Prior to the validation of analytical technique it was evaluated the system suitability chromatographic, thus ensuring the proper functioning thereof was evaluated. Subsequently, we proceeded to validate the method of analysis evaluating the parameters that indicate the official work, such as: selectivity, linearity, precision, accuracy and robustness. Then, Protocol validation method was developed, for which it had the experimental design and statistical procedures, thus concluding that the proposed analytical method is selective, it allows the analysis of the active ingredient without interference from the excipients present in the formulation of the shampoo, is linear in that the results obtained are directly proportional to the concentration of analyte in the sample, it is necessary, because it enables us for repeatable and reproducible results, when this is applied in repetitive analyzes of the same sample and exact because it allows the recovery of all of the analyte present in the sample and checked for validity.

Keywords: -

Permethrin

-

High Performance liquid Chromatography

-

Analytical method

-

Validation

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DEDICATORIA . Con todo mi cariño y mi amor para las personas que hicieron todo en la vida para que yo pudiera lograr mis sueños, por motivarme y darme la mano cuando sentía que el camino se terminaba, a ustedes por siempre mi corazón y mi agradecimiento.

Susan Lizeth E lías Da Silva.

A DIOS, por ser el principal sustento de Aliento, Fe y Esperanza en mi vida y sin el cual no hubiese sido posible todo esto ni ningún otro logro. A mis amados padres,

Victor Guardia Rodríguez y Norma Vargas De Guardia, por formar en mí esos principios y valores que han hecho de mí una gran persona, capaz de salir adelante en beneficio propio, de mi familia y de la sociedad.

Ruddy Verónica Guardia Vargas

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AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana por la excelente formación profesional recibida. A Laboratorios PORTUGAL S.R.L. en la persona de su jefe de control de calidad Dra: Nolly Huanca, por el apoyo y facilidades brindadas. A nuestras familias, por su apoyo incondicional, permanente aliento que hizo posible la realización de este trabajo. A la Ing. María Milagros Manrique Nina por su confianza y apoyo brindado. Al asesor de esta tesis, nuestro profundo agradecimiento por sus valiosos aportes y tiempo brindado. A los catedráticos de la Facultad, que con sus conocimientos brindados, forjaron y fortalecieron nuestro desarrollo profesional.

Gracias.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN……………………………………………………………………………

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ABSTRACT…………………………………………………………………………..

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DEDICATORIA……………………………………………………………………... 04 AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….. 05

CAPÍTULO I 1.1 INTRODUCCIÓN…………………………………………………………............ 15 1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……….................................................... 17 1.3 OBJETIVOS………………………….…………………………………….….…. 19 1.3.1 General………………………………...…………………………………….. 19 1.3.2 Específicos……………………………………………………...…………… 19

CAPÍTULO II 2.1 MARCO TEÓRICO…………………………………………………………..….. 21 2.1.1 Antecedentes………………………………………………………………………. 21 2.1.2 Consideraciones teóricas…………………………………………………………... 23 2.1.2.1 Piretrinas y Piretroides…………………………………………………………... 23 2.1.2.1.1 Generalidades………………………………………………………………...... 23 2.1.2.1.2 Piretroides……………………………………………………………………... 24 2.1.2.1.2.1 Definición…………………………………………………………………… 24 2.1.2.1.2.2 Clasificación………………………………………………………………… 24 2.1.2.1.3 Permetrina……………………………………………………………………... 27 2.1.2.1.3.1 Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina ……………………………... 28 2.1.2.2 Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC)……………………………. 28 2.1.2.2.1 Definición……………………………………………………………………... 28 2.1.2.2.2 Partes…………………………………………………………………………... 29 a. Bomba………………………………………………………………………………… 29

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b. Inyectores……………………………………………………………………………... 29 c. Detectores…………………………………………………………………………….. 30 d. Sistema de toma y procesamiento de datos…………………………………………... 30 2.1.2.2.3 Parámetros cromatográficos…………………………………………………... 31 a. Tiempo de Retención ( tR)……………………………………………………………... 31 b. Tiempo muerto………………………………………………………………………... 31 c. Factor de Retención (K)………………………………………………………………. 32 d. Selectividad (α)……………………………………………………………………….. 32 e. Eficiencia (N)…………………………………………………………………………. 32 f. Resolución (R)………………………………………………………………………… 33 2.1.2.3 Validación de técnicas analíticas……………………………………………….. 33 2.1.2.3.1 Razones que justifican la validación de métodos analíticos…………………... 34 2.1.2.3.2 Métodos susceptibles de ser validados………………………………………... 35 2.1.2.3.3 Tipos de validación……………………………………………………………. 35 a. Validación Prospectiva……………………………………………………………….. 35 b. Validación Retrospectiva……………………………………………………………... 36 c. Revalidación………………………………………………………………………….. 36 2.1.2.3.4 Características de desempeño analítico……………………………………….. 36 a. Exactitud……………………………………………………………………………… 36 b. Precisión……………………………………………………………………………… 37 c. Selectividad……………………...…………………………………………………… 38 d. Linealidad…………………………………………….………………………………. 39 e. Intervalo………………………………………………………………………………. 40 2.1.2.3.5 Datos requeridos para la validación…………………………………………… 40

2.2 DEFINICIONES OPERACIONALES…………………………………………... 41 2.2.1 Variables independientes………………………………………………………….. 42 2.2.2 Variables dependientes……………………………………………………………. 43

2.3 HIPÓTESIS………………………………………………………………………...46

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CAPITULO III 3.1 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN…………………………………...48 3.1.1 Método de investigación…………………………………….…………………….. 48 3.1.2 Población y Muestra……………………………………………………………….. 49 3.1.2.1 Población……………………………………………………………………….... 49 3.1.2.2 Muestra……………………………………………….………………………….. 49 3.1.2.2.1 Tipo de muestreo………………………………………………………………. 49 3.1.2.2.2 Tamaño de la muestra…………………………………………………………. 49 3.1.2.2.3 Identificación de muestra…………………………… …………………………50 3.1.2.2.4 Procesamiento de muestra…………………………………………………….. 50 3.1.2.3 Placebo……………………………………..……………………………………50 3.1.3 Parte experimental………………………………………………………………… 50 3.1.3.1 Desarrollo y validación de la técnica analítica………………………………….. 50 1. Objetivo…………………………………………………………………………. 52 2. Alcance………………………………………………………………………….. 52 3. Método de Validación………………………………………………………….... 52 4. Técnica analítica……………………………………….………………………... 52 4.1 Desarrollo de la técnica analítica……..…………………………. 52 4.2 Materiales, reactivos, producto de referencia y equipos………… 53 4.3 Procedimiento analítico………………………………………….. 56 4.3.1 Preparación de fase móvil…………………………………………………………. 56 4.3.2 Preparación de solución estándar………………………………………………….. 56 4.3.3 Preparación de solución prueba…………………………………………………. 56 4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema………………………………………………….... 57 5. Parámetros de validación………………………………………………………... 57 5.1 Desarrollo de los parámetros de validación…………………………………. 57 5.1.1 Selectividad de la técnica analítica………………………………….. 57 5.1.1.1 Interferencia del método………………………………………… 57 5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras………….…………………58 5.1.2 Linealidad de la técnica analítica…………………………………… 59 5.1.2.1 Linealidad del sistema……………………………..…….……… 59 5.1.2.2 Linealidad método………………………………………………. 61

8

5.1.3 Exactitud de la técnica analítica……………………………………… 62 5.1.4 Precisión……………………………………………………………… 63 5.1.5 Robustez……………………………………………………………… 64 5.1.6 Intervalo……………………………………………………………… 65

5.2 RESULTADOS…………..…………………………………………………………66 5.2.1 Aptitud del Sistema……………………………………………………………… 66 5.2.2 Selectividad……………………………………………………………………… 68 5.2.3 Linealidad……………………………………….………….………….………… 70 5.2.3.1 Linealidad del sistema ……………………………………………………………71 5.2.3.2 Linealidad del Método…………………………………………………………….72 5.2.4. Exactitud………………………………………………………………..………......79

5.2.5 Precisión………………………………………………………………………...... 81 5.2.5.1 Repetibilidad del sistema…………………………………………………………82 5.2.5.2 Repetibilidad del método………………………………………………………… 84 5.2.5.3 Precisión Intermedia………………………………………………………………85 5.2.6 Robustez de la técnica analítica …………………………………………………..87 5.2.7. Intervalo…………………………………………………………………………...89 6.

Informe Técnico………………………………………………………………….....90

CAPITULO IV 4.1 DISCUSIONES……………………………………………………………………..

92

4.2 CONCLUSIONES…………………………….…………………………………….93 4.3 BIBLIOGRAFÍA……………………………….………………………………......94 4.5 ANEXOS…………………………………………………………………………….98

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ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Características Generales Tabla 2: Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina. Tabla 3: Datos Requeridos para la validación de técnicas analíticas Tabla 4: Variable Independiente Tabla 5: Variable Dependiente Tabla 6: Estresamiento de Muestras Tabla 7: Aptitud del Sistema (HPLC). Tabla 8: Interferencia de las muestras. Tabla 9: Muestras Estresadas Tabla 10: Linealidad del Sistema-Isómero Trans Tabla 11: Linealidad del Sistema-Isómero Cis Tabla 12: Linealidad del Método Analítico. Tabla 13: Exactitud de la técnica analítica. Tabla 14: Repetibilidad del Sistema Tabla 15: Repetibilidad del Método Tabla 16: Precisión Intermedia-Analista A Tabla 17: Precisión Intermedia-Analista B Tabla 18: Robustez de la técnica analítica. Tabla 19: Intervalo de la técnica analítica. Tabla 20: Resumen de Resultados

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Piretro Figura 2: Degradación del piretro Figura 3: Alcohol Elliot Figura 4: Fenotrina Figura 5: Permetrina Figura 6: Cipermetrina Figura 7: Deltametrina Figura 8: Fenvalerato Figura 9: Cifenotrin Figura 10: Esquema de una posible configuración de un cromatógrafo liquido isocrático

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ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1: Linealidad del Sistema-Isómero Trans Gráfico 2: Linealidad del Sistema-Isómero Cis Gráfico 3: Linealidad del Método

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ANEXOS ANEXO 1: Ensayo de Aptitud del Sistema (HPLC). ANEXO 2: Interferencia del Método. ANEXO 3: Prueba de Estresamiento de Muestras. ANEXO 4: Linealidad del Sistema. ANEXO 5: Linealidad del Método. ANEXO 6: Exactitud de la técnica analítica. ANEXO 7: Repetibilidad del Sistema. ANEXO 8: Repetibilidad del Método. ANEXO 9: Precisión intermedia. ANEXO 10: Robustez de la técnica analítica. ANEXO 11: Criterios de Aceptación de los Parámetros de Validación.

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CAPITULO I

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1.1 INTRODUCCIÓN La industria farmacéutica se ha caracterizado desde sus inicios por la necesidad de alcanzar altos niveles de calidad, para lo cual fue desarrollando procedimientos que han evolucionado con una reglamentación estricta: en este avance por conseguir un alto dominio de la calidad, es cuando surge el concepto de validación. El desarrollo y validación de técnicas analíticas, es una tarea que se viene realizando en diferentes laboratorios farmacéuticos peruanos en los últimos años, debido al mayor énfasis que ha puesto la industria en los temas de Aseguramiento de la Calidad y mejora de la productividad; así mismo, es parte integral de las Buenas Prácticas de Manufactura y del desarrollo de un método de análisis, puesto que sin fiabilidad de los resultados analíticos es imposible asegurar que un medicamento cumple con las especificaciones exigidas, además contribuye a garantizar la calidad de un producto determinado. En el presente trabajo se ha desarrollado una técnica de análisis para cuantificar Permetrina 1% en shampoo por Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). Las razones de la preferencia de este tipo de cromatografía son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria y en muchos campos de la ciencia. El desarrollo y validación de la presente técnica analítica fue realizada en Laboratorios Portugal S.R.L. en el Departamento de Control de Calidad de acuerdo a la exigencia y normatividad vigente referida a las Buenas Prácticas de Fabricación de productos farmacéuticos (USP 36). Este trabajo aportará conocimientos técnico-científicos que pueden ser aplicados en la actividad de las áreas de control de calidad e investigación de los laboratorios farmacéuticos del país, ya que al validar este método analítico, se obtendrá un procedimiento específico para el análisis en las condiciones propuestas, así mismo se creará evidencia documentaria de un alto grado de confianza y seguridad, que a su vez

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minimizará el número de fallos y repeticiones, permitiendo un importante ahorro de costos por análisis y garantizando la calidad y mejora de la productividad.

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1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La investigación y el desarrollo son muy importantes en la industria farmacéutica ya que de ello depende que se puedan desarrollar nuevos productos. (1) El departamento de desarrollo farmacéutico por lo general trabaja con fármacos, excipientes, tecnología y formas farmacéuticas, para poder así alcanzar la innovación mediante la selección, modificación, combinación de lo ya conocido, con el objetivo de obtener una mejor calidad, disponibilidad, aceptación, eficacia y estabilidad en el medicamento. (2,3) En el mercado farmacéutico actual, existen varios medicamentos de gran demanda por la población, cuyas técnicas de análisis no se encuentran publicadas en las obras oficiales que generalmente se consultan a saber: Farmacopea americana, británica, europea y japonesa. Esto hace necesario desarrollar nuevas técnicas de análisis en el laboratorio con el fin de separar y cuantificar los principios activos de dichos medicamentos. (4,5) La literatura sobre el desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación de Permetrina (plaguicida sintético), en productos farmacéuticos es escasa, y la mayoría están destinados para el análisis de múltiples residuos de piretroides en diferentes y complejas matrices, por lo tanto, el pre-tratamiento de las muestras. (6) Usualmente, cada método desarrollado es propuesto especialmente para un tipo de formulación, no habiendo un método universal propuesto como aplicable para el análisis de formulaciones de varios usos. (7,8) Por lo tanto, el objetivo de este estudio será el desarrollo y validación de una metodología de análisis que emplea la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para la determinación de Permetrina 1% en Shampoo y se pueda aplicar al control de calidad de estos productos. Por lo anteriormente manifestado es que en el presente trabajo de investigación nos planteamos la siguiente interrogante:

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¿El método analítico por Cromatografía Liquida de Alta Resolución para la cuantificación de Permetrina 1% en shampoo, cumplirá con los parámetros de desempeño de validación?

18

1.3 OBJETIVOS 1.3.1 GENERAL Desarrollar y validar un método analítico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para cuantificar Permetrina 1% en Shampoo.

1.3.2 ESPECÍFICOS



Desarrollar una metodología de análisis capaz de cuantificar el principio activo del Shampoo de Permetrina.



Demostrar que el método analítico propuesto cumple con las características de desempeño: selectividad, Precisión, linealidad y exactitud.



Proveer una metodología analítica validada, que sirva como guía a la industria farmacéutica, para la cuantificación del principio activo.

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CAPÍTULO II

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2.1 MARCO TEÓRICO 2.1.1 ANTECEDENTES García García y Barbas (2001): Desarrollaron y validaron una técnica analítica utilizando un método de Cromatografía Líquida con Alta Eficiencia para el control de calidad de lociones y champús que contienen Permetrina como ingrediente activo. En el trabajo de este grupo, C is y Trans- permetrina se separaron e identificaron en la misma serie cromatográfica, que hizo posible la cuantificación de cada isómero. Sin embargo, según los mismos autores, sólo el isómero Cis se considera activo para el uso previsto. (9)

Rezende, Oliveira y Siqueira. (2008): En el trabajo que desarrollaron para la cuantificación de Cis Permetrina por HPLC, refieren que Choi, Hoddgson y Rose (2002) obtuvieron 9,39 y 19,17 mg/ml en los límites de detección y de cuantificación, respectivamente, cuando se trabaja con una muestra de fluido biológico. Estos valores son significativamente más altos en comparación con los encontrados en este estudio. (Límite de Detección = 1,6 mg / ml y Limite de cuantificación = 2,4 mg /ml), que pone de relieve la necesidad de validación mediante la variación de la matriz de la muestra. También en relación con los límites de confianza del método para la cuantificación de Cis- permetrina en loción capilar, se tiene que el valor medio obtenido para la prueba de precisión, medida en concentraciones de 6,4 a 38,4 mg de Cis- permetrina/ml de muestra fue de 103% (93,0107,7%). Este valor es similar a la encontrada por Wang, Moorman y Burleson (2003) , que es 98,8% (94,6%-103%). En comparación con los resultados de la prueba de precisión intra-ensayo llevado a cabo por Wang, Moorman y Burleson (2003) , que se encontró que el coeficiente de variación de 0,43%, el promedio de los coeficientes medios de variación obtenidos en el método propuesto fue mayor (0,96%). Sin embargo, esta diferencia no pone en peligro la exactitud del método publicado, ya que el valor recomendado por la Agencia Nacional de Vigilancia (10)

Sanitaria (ANVISA) es hasta 5% (BRASIL, 2003).

Modamio et al. (2008-2009): En su investigación, el ensayo de especificidad del método fue corroborado a través de los cromatogramas realizados, en los cuales los tiempos de retención fueron entre 9,2 min para el isómero trans y 11,5 min para el isómero cis. En el

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ensayo de linealidad se obtuvieron coeficientes de correlación de r= 0,9998 para el isómero trans y r= 0,9997 para el isómero cis. La precisión se demostró a través del CV% (coeficiente de variación) de la serie de medidas con un valor de 2,07 y 1,73% para el interdia de los isómeros trans y cis y 2,1 y 0,73% para el intradia respectivamente. La exactitud se

comprobó por el ER% (error relativo porcentual) con valores de -0,2% y -2,05% para el interdía para los isómeros trans y cis y -0,37% y -0,3% para el intradía de los isómeros.

(11)

Tarinas et al. (2010): En su investigación, el ensayo de especificidad del método fue corroborado a través de los cromatogramas realizados, en los cuales los tiempos de retención fueron entre 8,8 y 9,2 min para el isómero trans y entre 10,7 y 11,2 min para el isómero cis. El coeficiente de correlación determinado para ambos isómeros fue mayor que 0,99; el coeficiente de variación fue menor que 3 % y el error relativo porcentual estuvo entre -3 y 1 %, tanto para los estudios interdía como intradía. Se determinó que la media de la concentración de permetrina en lotes de solución tópica 1 % resultó de 6 780,14

g/mL.

En el ensayo de linealidad se obtuvieron coeficientes de correlación de r= 0,9991 para el isómero trans y r= 0,9988 para el isómero cis. La precisión se demostró a través del CV% (coeficiente de variación) de la serie de medidas con un valor de 2,48 y 2,0 % para el ensayo interdía de los isómeros trans y cis y de 2,62 y 2,90 % para el intradía, respectivamente. La exactitud se comprobó por el ER% (error relativo porcentual) con valores de -1,02% y -2,71% para los isómeros Trans y Cis en el ensayo interdía, 0,59 y 0,94 % para el intradía de los isómeros. (12)

Maja Shishovska y Marina Stefova (2010): Concluyeron en un artículo que las condiciones para el análisis de Permetrina utilizando una columna C18 de rápida resolución de 5cm x 4.6mm id con partículas de 1.8 m son: fase móvil (Acetonitrilo: Agua en proporción 75:25); Velocidad de Flujo: 1,0mL/min, temperatura: 45°C y Detector: UV a 215nm. Afirmando que el método propuesto es rápido, simple, exacto y preciso para el análisis de ambos isómeros de Permetrina en varios tipos de formulaciones aplicables con (13)

el sistema de HPLC convenientes. En otro artículo acerca de la determinación de permetrina en residuos de vino, Maja

Shishovska y Marina Stefova (República de Macedonia, 2010), concluyeron que el método directo para la cuantificación de residuos de los isómeros de permetrina en la

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fabricación de vino son: columna de HPLC RP18 (25cm x 4mm id, 5m); fase móvil (Acetonitrilo: agua en proporción 70:30); Velocidad de flujo de 2ml/min; temperatura: 25°C y detector: UV a 215nm. En estas condiciones los isómeros de permetrina fueron bien separados de los componentes naturales del vino y también uno del otro. (14)

M. Saeed Arayne, et al (2011): En el estudio que realizaron para la determinación de Permetrina, concluyeron que se puede determinar este principio activo usando el método a 272nm. Teniendo la ventaja de simplicidad, estabilidad, reproducibilidad y precisión y se asocia con una mayor sensibilidad y precisión. La no interferencia de excipientes hace que el método sea adecuado para la determinación de la droga en forma de crema y por lo tanto se puede utilizar para el control de rutina de la calidad de la formulación de Permetrina de todas las potencias. (15) Los trabajos mencionados muestran la necesidad de la validación de las técnicas analíticas y la importancia de su inclusión dentro de los programas de validación en los laboratorios de Control de Calidad, así como la ventaja en la reducción de costos por análisis y su aplicación a productos que se comercializan en el mercado.

2.1.2 CONSIDERACIONES TEÓRICAS 2.1.2.1 Piretrinas y Piretroides. 2.1.2.1.1 Generalidades Las Piretrinas se obtienen del extracto de oleorresina de las flores del crisantemo, Chrysanthemum cineriaefolium, los piretroides tienen la misma estructura pero se obtienen

por síntesis química modificando su estructura básica para incrementar su estabilidad en el ambiente natural. Son insecticidas muy populares y se calcula que existen aproximadamente 2000 productos que los contienen. En general son insecticidas de baja toxicidad por lo que se les recomienda para uso en salud pública, para fumigar hospitales, restaurantes, comedores y para el propio hogar. (16)

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Tabla 1. Características Generales de Piretrinas y Piretroides.

PIRETRINAS

PIRETROIDES

Insecticidas de srcen natural (flor del

Insecticidas sintéticos.

crisantemo).

Se disuelven mejor en agua.

Poco soluble en agua. Inestables a la luz y al calor

Fórmula 

química

modificada

para

No mejorar la estabilidad  Más persistente.

persistentes. Fuente: Piretrinas y piretroides. Dr. Diego Gonzales Machin.

2.1.2.1.2 Piretroides 2.1.2.1.2.1 Definición Se definen como ésteres de ácidos derivados del ciclopropano. Son poco tóxicos para los mamíferos, quienes los metabolizan y excretan con rapidez. Dejan residuos muy bajos o nulos: en el suelo, se descomponen; son solubles en agua. (17)

2.1.2.1.2.2 Clasificación a) Piretroides de Primera Generación Se generaron en las décadas 40 al 60. Aletrinas y sus isómeros, Partrina, Dimetrina, Benatrina, Tetrametrina, etc. (17)

Figura1. Piretro

El piretro se halla constituido por seis ésteres de dos ácidos: crisantémico y piretrico. El pirétrico se degrada. (17)

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Figura 2. Degradación del Piretro

El alcohol Elliot es más efectivo y no tan tóxico (17)

.

Figura 3.Alcohol Elliot

El primero fue la FENOTRINA:

Figura 4. Fenotrina

b)

Piretroides de Segunda Generación

En la década del 70 los japoneses reemplazaron los metilos de la cadena lateral del carbono 3 del ciclopropano por cloro, obteniéndose el primer piretroide totalmente fotoestable: la PERMETRINA: (17)

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Figura 5. Permetrina

Su acción insecticida es aumentada fuertemente por los ingleses por el grupo ciano en el carbono del hidroxilo alcohílo: (17)

Figura 6. Cipermetrina

Luego aparece la deltametrina (muy aplicado en el uso de cucarachas). No es muy tóxico. (17)

Figura 7. Deltametrina

Finalmente, manteniendo la estructura alcohólica, pero modificando la ácida, eliminando el ciclopropano, se llegó al: (17)

Figura 8. Fenvalerato

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c)

Piretroides de Tercera Generación

Buscando fotoestabilidad, poca volatilidad, fuerte acción letal, buena estabilidad, pero eliminando los halógenos, por considerarlos causantes de residuos. Nace así el CIFENOTRIN. (17)

Figura 9. Cifenotrin

2.1.2.1.3 Permetrina Es un plaguicida sintético de amplio espectro perteneciente al grupo químico de los piretroides, cuyo mecanismo de acción es la neurotoxicidad. (18)

Se usa principalmente para matar insectos, arañas y orugas, como también para repeler una amplia gama de insectos. Produce reacciones de hipersensibilidad en mamíferos, incluyendo a los seres humanos. (19) La permetrinaes elegida por la OMS (organización mundial de la salud) como tratamiento de primera elección para combatir los piojos. (20)

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2.1.2.1.3.1 Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina. Tabla 2. Propiedades Físicas y Químicas de Permetrina. PERMETRINA

Nombre (IUPAC) sistemático 3-Phenoxybenzyl (1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl) -2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate General C21H20Cl2O3 Fórmula semidesarrollada Identificadores 52645-53-11 Número CAS Propiedades físicas cristales incoloros Apariencia 1190 kg/m3; 1.19g/cm3 Densidad 307 K (34 °C) Punto de fusión 473 K (200 °C) Punto de ebullición Propiedades químicas Insoluble (5.5 x 10-3ppm) Solubilidad en agua Compuestos relacionados Bifentrín Piretroides

Deltametrín Fuente: es.wikipedia.org/wiki/permetrina

2.1.2.2 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). 2.1.2.2.1 Definición La Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución - HPLC (por sus siglas en inglés), es una técnica utilizada para la separación, identificación cualitativa y determinación cuantitativa de componentes químicos en mezclas complejas. (21)

Ampliamente utilizada en la industria farmacéutica por las ventajas que la técnica presenta, obteniendo un análisis cuantitativo rápido y preciso, es una operación automatizada, tiene una alta sensibilidad de detección pudiendo detectar nanogramos, picogramos, inclusive niveles de femtogramos; y una de las ventajas más importantes es la susceptibilidad a la detección de un 60% a 80% de todos los componentes existentes. Por otra parte, las

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limitaciones que presenta, son que el sistema no cuenta con un detector universal como en otros sistemas, por lo tanto la detección es problemática si el analito no absorbe haces de luz UV, otra desventaja se da cuando el analito no es fácilmente ionizado; y por último, la técnica por HPLC, tiene muchos parámetros operacionales que lo hace dificultoso para un principiante. (22) Existiendo cuatro tipos principales de técnicas de HPLC que responden a las fuerzas moleculares básicas: fuerzas iónicas, fuerzas polares y fuerzas de dispersión; cada técnica específica a cada una de ellas: las fuerzas polares son el tipo dominante de las interacciones moleculares empleadas en HPLC de fase normal; las fuerzas de dispersión son empleados en HPLC de fase reversa; las fuerzas iónicas son empleados en HPLC de intercambio iónico; y el cuarto tipo de técnica de HPLC de exclusión de tamaño, se basa en la separación dinámica de las moléculas de acuerdo al tamaño que presente, sin la interacción del analito con la fase estacionaria. (23)

2.1.2.2.2 Partes a. Bomba El sistema de bombas puede ser considerado como el corazón del HPLC; las características de funcionamiento y rendimiento de la bomba fundamentalmente definen y limitan el tipo de separaciones que pueden ser realizadas; las características más importantes son: a) la reproducibilidad de caudal, b) el rango de caudal, c) la estabilidad de la presión. (24)(25) Existen cuatro tipos de bombas: Las bombas de presión constante, las bombas de caudal constante, las bombas alternativas y las bombas de jeringa. (25)

b. Inyectores La muestra a analizar debe ser introducida en la fase móvil; una válvula de inyección adecuadamente diseñada y utilizada de manera correcta, asegura máxima eficiencia durante la cromatografía. Hoy en día la inyección manual es poco frecuente y sólo es

29

justificado cuando la cantidad de muestra es limitada; la utilización de inyectores automáticos facilita la transferencia de muestras y el procesamiento automático de variables operativas como el control de volumen, número de inyecciones, el intervalo entre las inyecciones, ciclos de enjuague de las muestras; suprimiendo factor del error humano y mejorando la precisión del método. (24)

c. Detectores El propósito de un detector en un sistema de HPLC es identificar la presencia de componentes de interés del eluyente proveniente de la columna del HPLC. El analito es reconocido por interacciones fisicoquímicas como por ejemplo la de absorbancia de radiación UV en una cierta longitud de onda. Los detectores pueden ser clasificados dentro de dos categorías; los detectores basados en una propiedad de disolución que responden cualquier cambio de la alguna propiedad física de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden únicamente a propiedades del analito, como la absorbancia UV, fluorescencia, o actividad electroquímica, que no son propias de la fase móvil.

d. Sistemas de toma y procesamiento de datos Para toma de datos, procesamiento de datos y el reporte, el uso de un sistema informático integrado es esencial. Este sistema integrado, recibe y almacena la señal de los detectores e imprime cromatogramas completos, e incluso controla la mayoría de variables operativas como selección de muestras, válvulas de muestreo, condiciones del detector, entre otros; simplificando el trabajo tedioso de una selección manual de las condiciones operativas cromatográficas; con el objetivo de obtener el cromatograma con fracciones separadas e identificadas de cuya interpretación puede extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas de mezclas complejas. (26)

30

Figura 10. Esquema de una posible configuración de un cromatógrafo liquido isocrático

2.1.2.2.3 Parámetros Cromatográficos a. Tiempo de Retención (tR ) Cada analito específico está representado por un pico en el cromatograma; estos picos son simétricos y se asemejan a una curva de distribución normal tipo Gaussiana. La distancia máxima del pico desde el punto de inyección, expresado en unidades de tiempo se llama tiempo de retención (tR). El tiempo de retención de analito es dependiente del caudal de fase móvil; a mayor velocidad del caudal de flujo, más pequeño es el tiempo de retención de analito. El producto del tiempo de retención de analito y el caudal de fase móvil es el volumen de retención (VR). (27)

b. Tiempo muerto Es el tiempo requerido por un compuesto inerte para migrar desde la inyección en la columna sin retraso por la fase estacionaria. Por consiguiente, el tiempo muerto es (26)(27)

idéntico con el tiempo de residencia del compuesto en la fase móvil.

31

c. Factor de Retención(K) La retención del analito se compone de dos partes: 1) El tiempo que el analito eluye en la fase móvil; 2) el tiempo que el analito es retenido en la fase estacionaria. La diferencia entre el tiempo total de retención ( tR) y el tiempo de demora, se denomina tiempo de retención reducido (t’R), y la correspondiente diferencia entre el volumen de retención del analito y el volumen muerto se llama volumen de retención neta (V’R). La relación entre el volumen de retención reducido y del volumen muerto da un parámetro adimensional llamado factor de retención, (K) llamado también factor de capacidad. (27)

d. Selectividad (α) La capacidad del sistema Cromatográfico para discriminar diferentes analitos se llama selectividad (α). La selectividad se determina como la relación de los factores de retención de dos analitos, o la relación de los tiempos de retención reducida. La retención relativa describe la capacidad de un sistema Cromatográfico de discriminar entre dos compuestos; es independiente de la longitud de columna y la velocidad de flujo; por el contrario es dependiente de la temperatura y las propiedades de la fase móvil y la fase estacionaria. (26)(27)

e. Eficiencia (N ) La eficiencia es la medida del ensanchamiento de cinta cromatográfica y el número de los platos teóricos (N) en la columna. El número de los platos teóricos caracteriza la calidad de la columna y los fenómenos de transferencia de masas. Valores grandes para N califican la columna para separar mezclas complejas. (27)

32

f. Resolución (R ) La resolución (R) está definida como la proporción de la distancia entre dos picos a la anchura media de los mismos y este descriptor abarca tanto eficacia como selectividad. (27)

2.1.2.3 Validación de Métodos analíticos Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. (28) Aunque los estudios de validación de técnicas analíticas se han realizado en la industria farmacéutica durante mucho tiempo, hoy en día es de uso rutinario debido a un mayor énfasis de la industria en los últimos años de garantía de calidad y mejora de la productividad. La validación de técnicas analíticas es una parte necesaria del programa de gestión de calidad y es fundamental para una operación de producción eficiente y es parte integral de las Buenas prácticas de manufactura; todo el conjunto de procesos de validación están descritos en un Plan Maestro de Validaciones, este plan considera el desarrollo de actividades como la Calificación del Sistema que viene a ser la ejecución de pruebas para determinar si un componente de un proceso posee los atributos requeridos para trabajar correctamente la técnica analítica elegida, esta primera etapa considera: 

Calificación del diseño (DQ): Define los datos específicos funcionales y operacionales del instrumento y sistemas auxiliares, de acuerdo a los requerimientos de las Buenas Prácticas de Manufactura. Es sumamente importante la selección cuidadosa de los procedimientos de prueba y límites de la aceptación definidos.

33



Calificación de la Instalación (IQ): Establece que el equipo y los sistemas auxiliares son entregados de acuerdo al diseño y especificación del fabricante, instalados en el ambiente seleccionado, y que este ambiente es conveniente para la operación y el empleo del instrumento.



Calificación operacional (OQ): Es el proceso de demostración que un instrumento funcionará según su especificación operacional en el ambiente seleccionado, el objetivo principal es de asegurar que el hardware y software del equipo se encuentran funcionales según los datos específicos requeridos en el documento DQ.



Calificación del performance (PQ): Establece por evidencia objetiva que el proceso, bajo condiciones delimitadas, produce constantemente un producto que cumple con las características de calidad deseadas y que las especificaciones del proceso no afectan al producto final.

Los métodos analíticos deben ser validados antes de su introducción en el uso de rutina; y revalidados al cambio de las condiciones del método validado (por ejemplo, un instrumento con características diferentes o muestras con una matriz diferentes); al cambio en el procedimiento analítico que se encuentra fuera del alcance de aplicación inicial del método; al cambio en la síntesis del principio activo, al cambio de la composición del producto terminado. (29-33)

2.1.2.3.1 Razones que justifican la validación de métodos analíticos 

Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis propuestos en las condiciones descritas, la validación es la herramienta que permite obtener las pruebas documentales al respecto.



Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad en los resultados, lo cual a su vez minimizara el número de fallos y repeticiones, permitiendo un importante ahorro de costes.

34



Trabajar con métodos validados, permite no sólo el conocimiento del método analítico, sino también cumplir con las exigencias legales tanto de registro de especialidades farmacéuticas como las buenas prácticas de laboratorio, con el fin de asegurar la calidad y eficacia del producto.



La validación es también un paso o requisito previo de los procesos de transferencia de métodos analíticos. (28)

2.1.2.3.2 Métodos susceptibles de ser validados Son validables los métodos analíticos clasificados en la siguiente forma: 

Ensayos de identificación.



Ensayos para la determinación del analito de interés de una materia prima o de una especialidad farmacéutica.



Ensayos para la determinación de características farmacotécnicas inherentes.



Ensayo de límite de impurezas y de cuantificación de impurezas.



Ensayo para la determinación de analitos en fluidos biológicos y en productos naturales. (28)



Ensayos microbiológicos.

2.1.2.3.3 Tipos de validación a) Validación Prospectiva Se realiza cuando la verificación del cumplimiento de las condiciones establecidas para un proceso o método analítico se lleva a cabo antes de la comercialización del producto. Este tipo de validación se aplica cuando se elabora un nuevo método analítico. Es típico en los laboratorios de investigación y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios necesarios para demostrar el buen funcionamiento del método. (34)

35

b) Validación Retrospectiva Se realiza cuando la idoneidad del método o proceso analítico se basa en la garantía constatada a través de los datos analíticos del producto ya comercializado, se aplica a métodos no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de resultados. (34)

c) Revalidación La introducción de un cambio que pueda afectar la idoneidad del método analítico establecido por la validación, podrá exigir una nueva validación, es decir una revalidación total o parcial de dicho método analítico. Los criterios a estudiar se deciden en función del tipo de cambio efectuado. Entre los motivos que exige una nueva validación tenemos: 

Cambios importantes en la matriz del producto.



Cambios importantes en el método analítico.



Cambios en las especificaciones. (34)

2.1.2.3.4 Características de desempeño analítico. a. Exactitud La exactitud está definida como la concordancia entre el resultado obtenido mediante el método elegido y el valor verdadero. La falta de exactitud puede ser por exceso o por defecto; las desviaciones por exceso suelen producirse cuando existen interferencias analíticas y la selectividad del método no es la adecuada obteniéndose valores superiores al valor verdadero; las desviaciones por defecto suelen darse en métodos analíticos muy laboriosos, con varias fases, extracciones, purificaciones, etc., que se traducen en una disminución de la recuperación. Matemáticamente, la exactitud se expresa en forma de porcentaje de recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra o bien en forma de diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero (error o error porcentual).

36

Estadísticamente, suele efectuarse un test de “t” de student para determinar si el valor

medio del error y valor considerado verdadero no difieren significativamente para un grado de probabilidad determinado. Las pautas de validación de los métodos analíticos descritos por la ICH recomiendan que se evalúe realizando un mínimo de nueve determinaciones de tres niveles de concentración, cubriendo así, el intervalo especificado. (28)(31)(35)(36)

b. Precisión La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea o expresado de otra forma, es la distribución de los valores analíticos alrededor de su media. La precisión de un método analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa de una serie de mediciones. (28) Dentro del término precisión se pueden distinguir el grado de reproducibilidad o de repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación. En este contexto, la reproducibilidad se refiere a la medida de precisión de los resultados de un método analítico efectuado por laboratorios diferentes y en condiciones diferentes (diferentes analistas, equipos, días, etc.). Una precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio. 

La repetibilidad se refiere a la medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con el mismo equipo y en el curso de la misma serie de análisis efectuados durante un periodo de tiempo corto.



La precisión de un método analítico matemáticamente se expresa por la desviación estándar de la desviación estándar relativa.

37

Las pautas de validación de los métodos analíticos descritos por la ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad analizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento. (28)(31)(35)(36)

c. Selectividad Se define como la capacidad para medir y/o identificar simultáneamente el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como impurezas, productos de degradación y componentes relacionados o productos de degradación que puedan estar presentes en la matriz. La selectividad de un método analítico, se determina comparando los resultados de análisis de muestras conteniendo impurezas, siendo un parámetro crucial para conseguir una buena exactitud por lo que es, en todos los casos, un criterio clave. Los estudios de selectividad varían según el método aplicado: 

Métodos de identificación. Debe demostrar que el método funciona en presencia de otras sustancias que pueden interferir y de aquéllas de composición similar.



Ensayos de pureza. Debe garantizar que el método analítico permite la evaluación de impurezas cualitativa o cuantitativamente.



Determinación cuantitativa de un componente . Debe asegurar que la señal medida con el método analítico procede únicamente de la sustancia analizada sin interferencia de excipientes, productos de degradación y/o impurezas cuando se determina el contenido en principio activo u otro componente (conservador, antioxidante) en un medicamento.

Para la determinación de la selectividad, se pueden plantear diferentes alternativas. Una de ellas es por la adición de interferencias, en estos casos se puede comprobar la selectividad comparando los resultados del análisis de muestras con o sin analito en presencia o ausencia de dichas interferencias; para la determinación de una forma farmacéutica el

38

grupo de muestras a preparar serían: matriz, analito, matriz + analito, matriz + analito + impurezas + productos de degradación. La otra aplicación es utilizando pruebas confirmatorias con muestras sometidas a estrés para generar compuestos potencialmente interferentes, por lo cual, adquiere importancia para métodos que se desea evaluar la estabilidad de un principio activo o forma farmacéutica; estas condiciones, para lograr una degradación se somete a degradaciones de luz, humedad relativa, calor, hidrólisis ácida, hidrólisis básica y oxidación. La selectividad se confirma cuando un pico de la absorbancia es puro y no hay ninguna interferencia del placebo en el tiempo de retención correspondiente al analito. (28)(35)(36)

d. Linealidad La linealidad de un método analítico incluye la proporcionalidad entre la concentración del analito y su capacidad de respuesta, así como el intervalo de concentraciones del analito para los cuales el método es satisfactorio. La linealidad se relaciona además, con la sensibilidad de calibrado (representación gráfica del cociente entre la señal del analito y la señal del patrón frente a la concentración de analito de los patrones). La determinación de la linealidad se realiza calculando la curva de calibración que relaciona respuesta (áreas, alturas, absorbancias, etc.) con una concentración de analito determinado. Generalmente se pretende obtener una recta de calibración, determinándose los parámetros de la recta de regresión; para algunos casos, la obtención del parámetro de linealidad entre la respuesta de un analito y su concentración, se tienen que someter a una transformación matemática. Los datos obtenidos a través de la línea de regresión pueden ser útiles para proporcionar estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se debería presentar el coeficiente de correlación, la intersección del eje de ordenadas, la pendiente de la línea de regresión y la suma de los cuadrados residuales. Las pautas de validación de los métodos analíticos descritos por la ICH recomiendan que para establecer la linealidad se utilice normalmente un mínimo de 5 concentraciones. También recomienda que para la valoración de un fármaco (o de un producto terminado) se realice dentro del intervalo de 80% a 120% de la concentración de prueba. (28)(31)(36)

39

e. Intervalo El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo. (37)

2.1.2.3.5 Datos Requeridos para la Validación Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde determinaciones analíticas muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia variedad, es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de validación. Las categorías de prueba más habituales para las que se exigen datos de validación se indican a continuación: (37)

Categoría I: Procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.

Categoría II: Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite.

Categoría III: Procedimientos analíticos para la determinación de las características de desempeño (p.ej. disolución, liberación de fármacos, etc.).

Categoría IV: Pruebas de identificación. Para cada categoría, se requiere diferente información analítica. En la Tabla 3 se indican los datos que normalmente se requieren para cada una de estas categorías.

40

Tabla 3. Datos requeridos para la validación de técnicas analíticas Características de Desempeño Analítico

Categoría II Categoría I

Análisis Cuantitativos

Pruebas de Límite

Categoría III

Categoría IV

Exactitud

Sí

Sí

*

*

No

Precisión

Sí

Sí

No

Sí

No

Especificidad

Sí

Sí

Sí

*

Sí

Límite de Detección

No

No

Sí

*

No

Límite de Cuantificación

No

Sí

No

*

No

Linealidad

Sí

Sí

No

*

No

Intervalo

Sí

Sí

*

*

No

*Pueden Requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica. (USP 36)

2.2. DEFINICIONES OPERACIONALES 2.2.1 Variables Independientes. 

Cuantificación de Permetrina.

2.2.2 Variables Dependientes. 

Validación de un método analítico.

41

Tabla 4: Variable Independiente

Variable Independiente

Definición Conceptual

Definición Operacional

Permetrina es un plaguicida sintético de amplio HPLC, es una técnica utilizada para la separación,

Indicador

Método analítico: HPLC

Escala

Intervalo tipo

Cuantificación de

espectro, indicada para erradicar parásitos

identificación cualitativa y determinación

Permetrina

dérmicos como los piojos y los causantes de la

cuantitativa de componentes químicos en mezclas

Conforme-No

escabiosis (sarna), que se cuantificara mediante

complejas, el cual permite obtener un análisis

conforme.

el método de HPLC.

cuantitativo rápido y preciso.

cuantitativo.

42

Tabla 5: Variable Dependiente

Variables

Definición Conceptual

Definición Operacional

Indicador

Escala

Dependientes documentadas

Selectividad:

Selectividad

Selectividad

un método

que proporcionan un alto

Capacidad para

Por adición deinterferencias

El TR del pico

analítico.

grado de certeza de que medir y/o identificar el analito en presencia

Validación de

Pruebas

principal en el

un proceso específico

de aquellos componentes cuya presencia

 

cromatograma de la

coherentemente

resulta previsible, como impurezas, etc

        

muestra debe ser

producirá un producto que cumpla sus datos Solución estándar [0,5mg/ml]

Lectura de l Placebo

específicos predeterminados atributos

calidad,

Cromatografía

Líquida

utilizando de

Alta

 

y

de

la Resolución

Linealidad:

Farmacopea Estadunidense normas ICH.

Linealidad

estándar. No debe interferir.

Linealidad

Proporcionalidad entre la concentración del analito y su capacidad de respuesta.

(HPLC), según normas Se trabajará a concentraciones de 50%, establecidas

     

similar al TR del

en 75%, 100%, 125%, 150%

Coeficientede Correlación (r)



 ∑   ∑  ∑  √ ∑    ∑ )) ∑    ∑ )

Mayor o igual que 0,999

r= indica el grado de correlación entre “x” y 36 y “y”. Si “r” es cercano a la unidad significa qu existe correlación con una probabilidad elevada.

r2= Expresa la proporción de la variación tot

Coeficiente de Determinación2(r) r2

Mayor o igual que 0,998

de “Y” explicada por el modelo lineal.

43

Precisión: Grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos analíticos.

CV (%)=expresa la relación entre la lectura o respuesta y la concentración.

Precisión

Precisión

Repetibilidad del Sistema: estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento. Repetibilidad del Método: El ensayo se efectúa sobre una muestra homogénea.

 )   

CV o RSD < 2,0

(Coeficiente de variación) Estudia la variabilidad del método

Precisión Intermedia:

efectuando una serie de análisis sobre la

 )   

misma muestra pero en condiciones operativas diferentes.

Exactitud:

Exactitud

Concordancia entre el resultado obtenido

CV o RSD < 2,0

Exactitud

mediante el método elegido y el valor verdadero %R= Determina la fracción de analito adicionada a una muestra de prueba (muestra fortificada o adicionada) previa al análisis

E l % de recuperación promedio

 

      

Máximo 3,0 %

44

Se utiliza el test de student para confirmar la recuperación del estudio.

Test de recupe r ación promedio y el 100% y n-1 Grados deLibertad

| |            

T exp. < T tabla (2,306)

Test de igualdad de variancias de vari os gru Determina si las varianzas son homogéneas, muéstrales del mismo Tama ño.   es decir si el factor de concentración no   influye en la variabilidad de resultados. Se trabajará con concentraciones al 50%, 100% y 150%



    

 

G exp < G tab (0,871)

Gtabla (α=0.05, k, n) Según farmacopea estadunidense 36, y normas ICH

45

2.3. HIPÓTESIS 

La técnica analítica desarrollada para la cuantificación Permetrina 1% por cromatografía líquida de alta Resolución, cumple con los parámetros de desempeño de la validación.

46

CAPÍTULO III

47

3.1 METODOLOGÍA 3.1.1 Método de Investigación a) De acuerdo al tipo de estudio: 

Experimental: Porque existirá manipulación deliberada de variables, con el fin de investigar las posibles relaciones causa – efecto.

b) De acuerdo al periodo en que se capta la información: 

Prospectiva: Porque se registrará la información según van ocurriendo los fenómenos.

c) De acuerdo a la evolución del fenómeno estudiado: 

Transversal: Porque se estudiarán las variables simultáneamente en un determinado momento.

d) De acuerdo con la comparación de las poblaciones: 

Descriptivo: porque se estudiará solo a una población, la cual se pretenderá describir en función de un grupo de variables.

e) De acuerdo con la interferencia del investigador en el f enómeno que se analiza: 

De observación: porque el investigador solo podrá describir o medir el fenómeno estudiado

48

3.1.2 Población y Muestra. 3.1.2.1 Población SHAMPOO DE PERMETRINA 1%, fabricado en Laboratorios Portugal S.R.L.

3.1.2.2 Muestra 3.1.2.2.1 Tipo de muestreo. Aleatorio al azar.

3.1.2.2.2 Tamaño de la muestra Se utilizó la fórmula para cálculo de datos globales:

Donde: N: es el tamaño de la población o universo. k: Constante que depende del nivel de confianza. e: es el error muestral deseado, en tanto por uno. p: proporción de individuos que poseen en la población la característica de estudio. Este dato es generalmente desconocido y se suele suponer que p=q=0.5 que es la opción más segura. q: proporción de individuos que no poseen esa característica, es decir, es 1-p. n: tamaño de la muestra. Datos: N: 1 Litro de Shampoo de Permetrina 1% k: 1,96 (nivel de confianza 95%) e: 0 , porque la muestra es homogénea. p: 0.5

n=

(1,96)2x1x0.5x 0.5 2

2

(0) (28-1) + (1,96) x 0,5 x 0,5

n = 1,0 L

n: tamaño de muestra

49

3.1.2.2.3 Identificación de muestra Las muestras se rotularon con la siguiente información: nombre del producto, lote, fecha de muestreo y nombre del muestreador.

3.1.2.2.4 Procesamiento de muestra Las muestras se almacenaron en la sección del área de Desarrollo y Validación de Técnicas Analíticas, en un ambiente cerrado y protegido de la luz (si se considera necesario) hasta su respectivo análisis.

3.1.2.3 Placebo Se preparó de acuerdo a su respectiva fórmula cuali-cuantitativa, 300ml de placebo del producto Shampoo de Permetrina 1%, el cual fue sumistrado en su totalidad al área de Desarrollo y Validación de Técnicas Analíticas.

Uso del placebo: Determinar si el producto tiene o no impurezas y si interviene con el principio activo.

3.1.3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1.3.1 DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA Departamento de Control de Calidad PVT – 0304 - GEN

PROTOCOLO DE VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

VERSION: 01

PERMETRINA 1% SHAMPOO CONTENIDO 1. Objetivo 2. Alcance. 3. Método de Validación. 4. Técnica analítica. 4.1

Desarrollo de la técnica analítica.

4.2

Materiales, reactivos, producto de referencia y equipos.

4.3

Procedimiento analítico.

50

4.3.1 Preparación de fase móvil. 4.3.2 Preparación de solución estándar. 4.3.3 Preparación de solución prueba. 4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema. 5. Parámetros de validación. 5.1

Desarrollo de los parámetros de validación. 5.1.1 Selectividad de la técnica analítica. 5.1.1.1 Interferencia del método. 5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras. 5.1.2 Linealidad de la técnica analítica. 5.1.2.1 Linealidad del sistema. 5.1.2.2 Linealidad método analítico. 5.1.3 Exactitud de la técnica analítica. 5.1.4 Precisión de la técnica analítica. 5.1.5 Robustez de la técnica analítica. 5.1.6 Intervalo de la técnica analítica.

5.2

Resultados 5.2.1 Aptitud del Sistema 5.2.2 Selectividad de la técnica analítica. 5.2.3 Linealidad de la técnica analítica. 5.2.3.1 Linealidad del sistema. 5.2.3.2 Linealidad del Método. 5.2.4 Exactitud de la técnica analítica. 5.2.5 Precisión de la técnica analítica. 5.2.5.1 Repetibilidad del sistema. 5.2.5.2 Repetibilidad del método. 5.2.5.3 Precisión Intermedia 5.2.6 Robustez de la técnica analítica.

5.2.7 Intervalo de la técnica analítica. 6. Informe Técnico

51

1. Objetivo Establecer y demostrar que el método analítico para la valoración del analito Permetrina por cromatografía líquida de alta resolución, cumpla con las características de desempeño: selectividad, precisión, linealidad, exactitud, rango y robustez, cumpliendo en forma consistente y repetitiva las especificaciones establecidas, proporcionando resultados confiables.

2. Alcance El Protocolo de Validación tiene por alcance realizar la valoración de todos los productos que tengan en su composición como analito Permetrina, y estén fabricados bajo la misma fórmula cuali-cuantitativa.

3. Método de Validación 3.1 Tipo de Validación Se aplica la validación de tipo PROSPECTIVA al método analítico.

4. Técnica Analítica La técnica analítica descrita se desarrolló y validó por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC).

4.1 Desarrollo de la técnica analítica Para armar la técnica analítica se procedió a desarrollar una serie de parámetros, con la finalidad de encontrar los adecuados y más afines al principio activo a evaluar. De acuerdo a la naturaleza del principio activo, soluble en metanol, se preparó una fase móvil a base de metanol y agua en una proporción de 83:17 v/v descartándose así cualquier precipitación de la muestra dentro del equipo. Posteriormente se seleccionó la columna cromatográfica Nucleosil 100 C18 de 125mm x 4,0mm x 5 m, permitiendo de esta manera una mejor separación de los compuestos. Para determinar la longitud de onda con la cual se realizará la lectura, se utilizó un cromatógrafo líquido de alta resolución con un detector DAD (Detector Diodo - Array) cuyo rango de longitud de onda es de 200nm a 400nm. La lectura del pico del principio activo se detectó en una longitud de onda de 254nm.

52

Por último se preparó la muestra de Permetrina y se realizó el ensayo para seleccionar el volumen de inyección, flujo adecuado y estimar el tiempo de retención para los picos del principio activo. Una vez determinados estos parámetros se procedió a realizar la validación de la técnica analítica.

4.2 Materiales, Reactivos, Producto de referencia y Equipos

Materiales:  Pipetas graduadas de 1mL. 

Vaso de precipitado de 250mL.



Probeta de 1000mL.



Probeta de 100mL.



Frascos vidrio con tapa azul de 2000mL.



Fiolas de 5mL y 10mL.



Fiolas de 25mL y 20mL.



Fiolas de ámbar de 100mL.



Pipeta volumétrica de 1mL, 2mL, 3mL y 5mL.



Viales para HPLC de color ámbar.



Jeringas de 10mL.



Membranas filtrantes con tamaño de poro de 0,45 µm.

Reactivos: 

Metanol, grado gradiente para cromatografía líquida, marca MERCK. Lote: I664707. Lote: I670207. Lote: I687507.



Hidróxido de sodio en pellets GR para análisis, marca MERCK.



Lote: 0000015080. Ácido Clorhídrico al 37% para análisis, marca MERCK. Lote: K44364917.



Peróxido de Hidrógeno al 30% para análisis, marca MERCK. Lote: K40128210.

53



Agua grado HPLC. Lote: No aplica.

Producto de referencia: Estándar: 

Nombre del estándar: Permetrina.



Tipo de estándar: Secundario.



Código: SSTD-60-01-12. Lote: 1203047.



Fecha de vencimiento: 2014-06-30.



Potencia: Isómero Cis 27.89% e Isómero Trans 68.38%



Equipos: LÁMPARA ULTRAVIOLETA Marca

PHILIPS

Modelo

TUV-15W/G15T8 N.A.

Serie Calibración Código

CONFORME LAM – 007

BALANZA ANALÍTICA Marca

METTLER TOLEDO

Modelo

XP105DR

Serie

B107112658

Calibración

CONFORME BAL – 006

Código

BALANZA ANALÍTICA Marca

METTLER TOLEDO

Modelo Serie

ML204 B229124486

Calibración

CONFORME

Código

BAL – 010

54

BAÑO TERMOSTÁTICO Marca

ZHICHENG

Modelo

ZSBB – 726 E00E5619

Serie

CONFORME

Calibración

BAÑ- 002

Código

ULTRASONIDO Marca

BRANSON

Modelo

3510R DHT EMC080271723E

Serie

CONFORME

Calibración

BUS- 001

Código

BOMBA AL VACÍO Marca

GAST

Modelo Serie

DOA – P704 – AA ----------

Calibración Código

HPLC – 005

N.A. COM – 001

Marca:

HITACHI

Modelo:

Chromaster

Se encuentra equipado con: Autosampler

Serie

1102-023

Detector RI

Serie

1104-007

Detector UV – VIS Bomba

Serie Serie

1101- 003 1102-014

Horno

Serie

1102-043

Calibración

CONFORME

55

COLUMNA: Nucleosil 100 C18 de 125mm x 4,0mm (5,0m) Código

82

Lote

201309162

Marca

Agilent

Serie

USM001870

125mm x 4,0mm x 5,0m

Otros

--------

Dimensiones

4.3 Procedimiento analítico: Tomando en cuenta el siguiente sistema cromatográfico:

Detector

UV, 254 nm.

Columna

Columna Nucleosil C18 100 de 125mm x 4,0mm x 5m

Velocidad de flujo Volumen de inyección Temperatura %DSR Tiempo de corrida Tiempo de retención

1,3mL/minuto 20 µL 25 ºC no es más del 2% para inyecciones repetidas 10 minutos aproximadamente. 4,9 minutos para el Isómero Trans, aproximadamente y 6,0 minutos para el isómero Cis aproximadamente.

Se procedió de la siguiente manera: 4.3.1 Preparación de fase móvil: Metanol y agua (83:17), filtrar y desgasificar con filtro de membrana de PVDF de 0,45 µm.

4.3.2 Preparación de solución estándar: Calentar el estándar de Permetrina a 40°C, hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Posteriormente pesar 50,0mg de Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. Concentración final aproximada de 0.5mg/ml de Permetrina.

4.3.3 Preparación de solución prueba: Pesar el equivalente a 50mg de Permetrina (aproximadamente 5ml de la muestra) a un matraz volumétrico de 100ml, agregar 90ml de metanol y llevar a volumen con agua. Concentración final aproximada de 0.5mg/ml de Permetrina.

56

Filtrar una porción de la solución estándar y de la solución prueba a través de filtro de membrana de PVDF de 0,45 µm descartando los primeros mililitros del filtrado.

4.3.4 Ensayo de aptitud del sistema: Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar 5 veces como mínimo la solución estándar en el HPLC. Obtener cromatrograma respectivo [Anexo 1] y resultados de aptitud del sistema (ver punto 5.2.1.1).

5. Parámetros de validación 5.1 Desarrollo de los parámetros de validación 5.1.1 Selectividad de la técnica analítica. Este ensayo se realizó con la finalidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes, cuya presencia resulta previsible, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.

5.1.1.1 Interferencia del método Muestra 1: (Fase Móvil) Proceder según preparación de fase móvil (ver punto 4.3.1) y filtrar por membrana PVDF de 0,45 µm en un vial de HPLC.

Muestra 2: (Placebo) Transferir 5,0mL de placebo y proceder según la preparación de solución prueba (ver punto 4.3.2)

Muestra 3: (Estándar de Permetrina) Proceder según preparación de solución estándar (ver punto 4.3.2)

Muestra 4: (Muestra) Proceder según la preparación de solución prueba (ver punto 4.3.3)

Procedimiento: Filtrar e inyectar todas las muestras preparadas por triplicado en el HPLC, obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 2].

57

5.1.1.2 Prueba de estresamiento de muestras Una vez preparadas las muestras se someterán a las siguientes condiciones: Tabla 6: Estresamiento de muestras

Muestras sometidas a: Condiciones Normales Condición Térmica Condición Alcalina Condición Ácida Condición Oxidativa Exposición luz UV

Muestra problema Preparar muestras a condiciones normales Someter a las muestras a una temperatura mayor del estudio de estabilidad (Tprom = 70 °C x 1h) Atacar a las muestras con solución de NaOH 2N. Atacar a las muestras con solución de HCl 2N. Atacar a las muestras con solución de peróxido de hidrogeno 3%. Someter a las muestras a exposición de luz UV x 5h

Preparación de las muestras: Muestra a condiciones normales : transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación térmica: transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol y llevar a 100ml con agua, mezclar. Luego llevar a baño maría a una temperatura de 70°C por una hora, dejar enfriar a temperatura ambiente y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Degradación alcalina: transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol, 1mL de NaOH 2N, disolver y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

58

Muestra sometida a Degradación ácida: transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol, 1mL de HCl 2N, disolver y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación oxidativa: transferir aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol, 1mL de H2O2 3%, disolver y llevar a volumen con agua, mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Muestra sometida a Degradación por luz

UV 254 nm: transferir

aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90 mL de metanol y llevar a volumen con agua, mezclar. Exponer a la luz UV 254 nm por 5 horas. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

Procedimiento: *Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar al sistema por quintuplicado como mínimo. *Filtrar e inyectar todas las muestras por triplicado en el HPLC, obtener los cromatogramas respectivos [Anexo 3] y las áreas.

5.1.2 Linealidad de la técnica analítica. Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar la proporcionalidad entre la concentración del principio activo y su respuesta (áreas) y nos demuestra la capacidad que tiene el método de obtener resultados linealmente proporcionales a la concentración del principio activo en la muestra.

5.1.2.1 Linealidad del sistema Se preparan 3 curvas de calibración correspondientes a 5 concentraciones que cubran el intervalo del analito (50%, 75%, 100%, 125% y 150%)

Preparación: 

Proceder a preparar los estándares (el cual será el 100%) de manera independiente (ver punto 4.3.2).

59



Tomar como referencia el peso del estándar al 100% y calcular el peso a las diferentes concentraciones que formarán la curva de calibración.



Estándar al 50%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 25,0mg de Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de 0,25mg/ml de Permetrina) 

Estándar al 75%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 37,50mg de Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de 0,375mg/ml de Permetrina)



Estándar al 100%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 50,0mg de Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)



Estándar al 125%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 62,50mg de Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de 0,625mg/ml de Permetrina)



Estándar al 150%:

Calentar el estándar a 40°C hasta que se disuelva, luego dejar enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Pesar luego aproximadamente 75,0mg de

60

Permetrina, transferirlo a un matraz volumétrico de 100mL, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua. (Concentración final aproximada de 0,75mg/ml de Permetrina)

Procedimiento: Filtrar e inyectar los 15 estándares preparados por triplicado en el HPLC, de preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración. Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 4].

5.1.2.2 Linealidad método Se preparan 3 curvas de calibración correspondientes a 5 concentraciones que cubran el intervalo del analito en la muestra (50%, 75% 100%, 125% y150%)

Preparación: 

Proceder a preparar las muestras (el cual será el 100%) de manera independiente (ver punto 4.3.3).



Tomar como referencia el peso de la muestra al 100% y calcular el peso a las diferentes concentraciones que formarán la curva de calibración.



Muestra al 50%:

Pesar aproximadamente 2,5mL de la muestra (± 25,0mg de Permetrina) llevar a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,25mg/ml de Permetrina)



Muestra al 75%:

Pesar aproximadamente 3,75mL de la muestra (± 37,5mg de Permetrina) llevar a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,375mg/ml de Permetrina)

Muestra al 100%: Pesar aproximadamente 5,0mL de la muestra (± 50,0mg de Permetrina) llevar a un



matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,5mg/ml de Permetrina)

61



Muestra al 125%:

Pesar aproximadamente 6,25mL de la muestra (± 62,5mg de Permetrina) llevar a un matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,625mg/ml de Permetrina)

Muestra al 150%: Pesar aproximadamente 7,5mL de la muestra (± 75,0mg de Permetrina) llevar a un



matraz volumétrico de 100mL, adicionar 90mL de metanol llevar a volumen con agua y mezclar. (Concentración final aproximada de 0,75mg/ml de Permetrina)

Procedimiento: 

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar por triplicado en el HPLC.



Filtrar e inyectar las 15 muestras preparados por triplicado en el HPLC, de preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración.



Obtener las áreas de cada inyección y los cromatogramas respectivos [Anexo 5].

5.1.3 Exactitud de la técnica analítica. Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar la proximidad entre los resultados obtenidos y el valor verdadero. Preparar 3 curvas de calibración correspondientes a 3 concentraciones que cubran el intervalo del analito (50%, 100% y 150%).

Preparación de las 9 muestras: Preparar por triplicado las muestras, para lo cual se pesa cantidades conocidas de analito que cubran los tres niveles de la curva (50%, 100% y 150%).



Estándar + Placebo al 50%:

Pesar en un matraz volumétrico de 100mL, aproximadamente 25mg de estándar de referencia de Permetrina y 2,5mL de placebo, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua.

62



Estándar + Placebo al 100%:

Pesar en un matraz volumétrico de 100mL, aproximadamente 50mg de estándar de referencia de Permetrina y 5,0mL de placebo, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua.



Estándar + Placebo al 150%:

Pesar en un matraz volumétrico de 100mL, aproximadamente 75mg de estándar de referencia de Permetrina y 7,5mL de placebo, agregar 90mL de metanol y llevar a volumen con agua.

Procedimiento: 

Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2). Filtrar e inyectar por quintuplicado en el HPLC.



Filtrar e inyectar las 9 muestras preparadas por triplicado en el HPLC, de preferencia colocarlos en sentido creciente a la concentración.



Obtener las áreas de cada inyección y los cromatogramas respectivos tanto del estándar y de las muestras [Anexo 6].

5.1.4 Precisión de la técnica analítica. Este ensayo se realizó con la finalidad de determinar el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.

5.1.4.1 Repetibilidad del sistema Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2).

Procedimiento:  

Filtrar e inyectar 6 veces la solución estándar. Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 7].

63

5.1.4.2 Repetibilidad del método Realizar los análisis de contenido de Permetrina en el producto a evaluar; preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6 muestras (ver punto 4.3.3) de manera independiente.

Procedimiento: 



Filtrar e inyectar 5 veces como mínimo la solución estándar y las muestras por duplicado en el HPLC. Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 8]

5.1.4.3 Precisión intermedia: Un primer analista debe realizar el análisis de contenido de Permetrina en el producto a evaluar. Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6 muestras (ver punto 4.3.3)

Un segundo analista debe realizar el análisis de contenido de Permetrina en el mismo producto a evaluar. Preparar una solución estándar (ver punto 4.3.2) y 6 muestras (ver punto 4.3.3)

Procedimiento para cada analista: 

Filtrar e inyectar la solución estándar 6 veces como mínimo y las 6 muestras por duplicado en el HPLC.



Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 9].

5.1.5 Robustez de la técnica analítica. Realizar los análisis de contenido de Permetrina en el producto a evaluar, una solución estándar (ver punto 4.3.2) y una muestra (ver punto 4.3.3) Se evaluará una muestra a condiciones normales vs una muestra cuantificada modificando: 

Velocidad de flujo de 1,3ml/ min a 1,5ml/ min



Volumen de inyección de 20ul a 10 l

64



Cambio de columna Nucleosil C18 de 125mm x 4,0mm x 5,0 m a Purospher RP18e 125mm x 4,0mm x 5,0m.



Combinación de la Fase Móvil a través de la bomba

Procedimiento: 

Filtrar e inyectar 5 veces la solución estándar y las muestras por duplicado en el HPLC.



Obtener las áreas y los cromatogramas respectivos [Anexo 10].

5.1.6 Intervalo de la técnica analítica. Se valida verificando que el procedimiento analítico proporcionado por la precisión, exactitud y linealidad son aceptables.

65

5.2 RESULTADOS Se verificará la conformidad de las pruebas respecto a los criterios de aceptación en cada una de las etapas de la Validación. Los resultados y la conformidad de los mismos se encuentran en el punto 6

5.2.1 Aptitud del Sistema (HPLC) Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina Permetrina SSTD-60-01-12

Nombre Código Pot. Tal cual

F. vencimiento

Isómero Cis: 27,89%

Isómero Trans: 68.38%

30- 06- 2014

Tabla 7: Áreas y Tiempos de retención obtenidos con la muestra.

N° Inyección 1 2 3 4 5 Promedio Coef. de Variación (CV)

Áreas Isómero Isómero Trans Cis 4005937 1501206 4005668 1515832 4004739 1518325 4008541 1505436 4004780 1516642 4005933 1511488 0.0407 0.5065

Tiempos de Retención (min) Isómero Trans

Isómero Cis

4.90 4.90 4.90 4.90 4.90 4.90 0.0000

6.03 6.03 6.04 6.03 6.03 6.03 0.074

66

Tabla 8: Aptitud del Sistema (HPLC)

Parámetros

Especificaciones

Cromatográficos

Resultados Isómero Trans

Isómero Cis

Observaciones

Coef. De Variación (CV)

%RSD < 2

0.039

0.507

Conforme

Factor de Asimetría (T)

0.8 < T < 2.0

1.099

1.107

Conforme

Tiempo de retención (rt)

% RSD < 1

0.000

0.025

Conforme

N° de platos teóricos (N)

N > 1000

2634

2871

Conforme

Factor de capacidad (K)

K>1

8.793

11.068

Conforme

Resolución (R)

R >1.5

---

2.734

Conforme

Al correr el estándar durante todas las pruebas, comprobamos que los parámetros cromatográficos evaluados en el método para HPLC son: 

Tiempo de retención < 1%



Coeficiente de variación < 2%



Factor de asimetría entre 0.8 y 2.0



Factor de Capacidad > 1



Resolución > 1.5



Platos teóricos > 1000

Por lo que queda definido el System Suitability Test, para los ensayos correspondientes a realizar durante la validación.

CONFORME

X

NO CONFORME

67

5.2.2 Selectividad de la técnica analítica. Producto Método Técnica analítica

Nombre Código

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina Permetrina SSTD-60-01-12

Pot. Tal cual F. vencimiento

Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38% 30- 06- 2014

5.2.2.1 Interferencia del placebo y fase móvil con respecto a la muestra. Tabla 9: Interferencia de placebo y fase móvil con respecto a la muestra

ÁREAS MUESTRAS

Fase móvil Placebo Muestra Estándar

Isómero Trans 0 34777 2253013 4005933

Isómero Cis 0 0 1144742 1511488

%interferencia en relación con %interferencia en relación con el SSTD el producto Isómero Trans

Isómero Cis

Isómero Trans

Isómero Cis

0 0.87 -

-

100

-

0 0 100 -

-

RESULTADO

Conforme Conforme -

Al evaluar la interferencia del método, se pudo comprobar que al inyectar el placebo y la fase móvil en el equipo, no existe interferencia en el mismo tiempo de retención del estándar de referencia, por lo tanto: No existe interferencia alguna en la cuantificación del analito en estudio.

68

5.2.2.2 Muestras sometidas a estresamiento Tabla 10: Estresamiento de las muestras.

ESTRESAMIENTO DE MUESTRAS

Interferencia <2%

RESULTADO

Condiciones normales Estresamiento térmico Estresamiento Alcalina NaOH 2N

< 2% < 2% < 2%

Conforme Conforme Conforme

Estresamiento ácido HCL 2N Estresamiento oxidativo H2O2 3% Estresamiento luz UV 254nm

< 2% < 2% < 2%

Conforme Conforme Conforme

Asimismo se evaluó el estresamiento de las muestras, observando que

los

productos de degradación de las muestras, no interfieren con el tiempo de retención del principio activo. Por lo tanto el método es selectivo y no presenta interferencia alguna al momento de cuantificar el analito.

CONFORME

X

NO CONFORME

69

5.2.3 Linealidad de la técnica analítica. 5.2.3.1 Linealidad del sistema (HPLC) Producto Método Técnica analítica

Nombre Código

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina. Permetrina SSTD-60-01-12

Pot. Tal cual

Isómero Cis: 27,89%

Isómero Trans: 68.38%

30- 06- 2014

F. vencimiento

Diluciones para Isómero Trans Muestra1 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Peso Fiola 24.73 100 35.32 100 52.29 100 65.02 100 78.24 100

Factor 0.169104 0.241518 0.357559 0.444607 0.535005

Área 1 1827222 2627496 3875166 4572403 5751729

Área 2 1822439 2625643 3880497 4577695 5817423

Área 3 1821335 2624061 3881502 4582279 5793669

Peso Fiola 21.17 100 40.54 100 50.45 100 61.74 100 79.14 100

Factor 0.144760 0.277213 0.344977 0.422178 0.541159

Área 1 1558693 3008119 3722212 4554080 5786384

Área 2 1554610 3012047 3713898 4552063 5817677

Área 3 1554858 3005531 3711300 4542644 5804042

Peso Fiola 29.64 100 40.76 100 54.96 100 68.01 100 79.13 100

Factor 0.202678 0.278717 0.375816 0.465052 0.541091

Área 1 2078586 3031699 4093599 4907886 5755352

Área 2 2070472 3027804 4089906 4931759 5762534

Área 3 2082489 3029844 4090364 4937011 5751095

Muestra2 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Muestra3 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

70

Tabla 11: Linealidad del Sistema - Isómero Trans Concentración Teórica 50%

75%

100%

125%

150%

mg/mL (x)

Áreas (y)

mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1

0.169104

1823665

308388.628375

0.028596

3325755248001.78

10784299

0.144760

1556054

225255.044571

0.020956

2421303013546.78

10749162

0.202678

2077182

420999.825654

0.041079

4314686445912.11

10248666

0.241518

2625733

634162.283317

0.058331

6894475537777.78

10871784

0.277213

3008566

834012.070042

0.076847

9051467370645.44

10852921

0.278717

3029782

844451.479026

0.077683

9179580987378.78

10870466

0.357559

3879055

1386991.104326

0.127848

15047067693025.00

10848712

0.344977

3715803

1281867.058104

0.119009

13807194412011.10

10771159

0.375816

4091290

1537574.081187

0.141238

16738651136573.40

10886403

0.444607

4577459

2035159.215023

0.197675

20953130896681.00

10295523

0.422178

4549596

1920739.745313

0.178234

20698820730152.10

10776484

0.465052

4925552

2290639.680414

0.216274

24261062504704.00

10591392

0.535005

5787607

3096399.377548

0.286230

33496394786449.00

10817853

mp2 mp3

0.541159

5802701

3140185.727323

0.292853

33671338895401.00

0.541091

5756327

3114696.387377

0.292779

33135300530929.00

5.341435

57206372

23071531.707601

Muestras

x2

Xy

f (factor respuesta)

y2

2.155633

246996230189188.00

10722722

Varianza

89772463850

110893513.5

3452691940

58853520311

8063039028

10638373 160413334562

160252608642

Gráfico 1: Linealidad del Sistema – Isómero Trans

LINEALIDAD DEL SISTEMA 8000000 6000000

S A E 4000000 R A

2000000 0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

mg/mL

71

Ecuación de la recta:      Coeficiente de correlación (r): r = 0.998905 Coeficiente de Determinación (r2): r2 = 0.997811 Test de Linealidad Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f ) : 1.855085458 % Variación del error experimental total

: 4853208425.759610

Varianza de la Pendiente Desviación Estándar de la pendiente

: 19139430123.729 : 38345.3292444

Desviación Estándar Relativa de la pendiente

: 1.299%

Prueba de T-Student

: 76.9829 > 2.1604

Test de Proporcionalidad Varianza del intercepto (a)

: 2750506186.407460

Desviación Estándar del intercepto (a)

: 52445.268484

Intervalo de confianza del intercepto (a)

: -92021.095 < a < 134542.464

Prueba de T-Student

: 0.405388 < 2.160

Test de Cochram

: 0.5602 < 0.6830

Diluciones para Isómero Cis Muestra1 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Peso 24.73 35.32 52.29 65.02 78.24

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.068972 0.098507 0.145837 0.181341 0.218211

Área 1 664299 953336 1459409 1692528 2146771

Área 2 660224 952128 1462462 1677754 2154280

Área 3 659718 953178 1455661 1695236 2173784

Peso 21.17 40.54 50.45 61.74 79.14

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.059043 0.113066 0.140705 0.172193 0.220721

Área 1 563570 1122248 1390900 1681857 2158763

Área 2 563358 1097982 1390768 1698458 2172880

Área 3 561585 1096514 1383240 1704803 2170632

Muestra2 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

72

Muestra 3 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Peso 29.64 40.76 54.96 68.01 79.13

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.082666 0.113680 0.153283 0.189680 0.220694

Área 1 7565155 1105652 1528546 1891766 2152534

Área 2 759485 1105382 1530996 1875400 2141703

Área 3 768696 1105110 1513133 1880483 2140689

Tabla 12: Linealidad del Sistema – Isómero Cis Concentración Teórica 50%

75%

100%

125%

150%

Muestras mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3 mp1 mp2 mp3

mg/mL (x)

Áreas (y)

0.068972

661414

45619.003600

0.004757

437468038453.44

9589601

0.059043

562838

33231.697500

0.003486

316786239018.78

9532653

0.082666

761565

62955.529400

0.006834

579981756935.11

9212563

Xy

2 x

y2

f (factor respuesta)

0.098507

952881

93865.873200

0.009704

907981564907.11

9673181

0.113066

1105581

125003.725400

0.012784

1222310084615.11

9778189

0.113680

1105381

125659.352000

0.012923

1221867892081.78

9723653

0.145837

1459177

212801.767500

0.021268

2129198490113.78

10005549

0.140705

1388303

195341.196100

0.019798

1927384294273.78

9866758

0.153283

1524225

233638.451300

0.023496

2323261850625.00

9943833

0.181341

1688506

306194.995100

0.032884

2851052512036.00

9311232

0.172193

1695039

291873.670600

0.029650

2851052512036.00

9843842

0.189680

1882550

357081.813700

0.035978

2873158341547.11

9924877

0.218211

2158278

470960.850400

0.047616

3543993247466.78

9890770

0.220721

2167425

478397.210400

0.048718

4658165364136.11

9819729

0.220694

2144975

473382.263900

0.048706

4697731130625.00

9719247

2.178599

21258139

3506007.400200

0.358603

34291259987443.30

167610005798

Varianza

41309792559

2758069607

4835394756

1.11134E+11

7427248411

167464170121

73

Gráfico 2: Linealidad del Sistema – Isómero Cis

LINEALIDAD DEL SISTEMA 2500000 2000000 S 1500000 A E R A1000000

500000 0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

mg/mL

Ecuación de la recta:     ) Coeficiente de correlación (r): r = 0.9985 Coeficiente de Determinación (r2): r2 = 0.9970 Test de Linealidad Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f) :

2.352 %

Variación del error experimental total

:

965625289.24

Varianza de la Pendiente

:

22891268278.14

Desviación Estándar de la pendiente

:

151298.61

Desviación Estándar Relativa de la pendiente

:

1.525%

Prueba de T-Student

:

65.5688 > 2.1604

Test de Proporcionalidad Varianza del intercepto (a)

: 547258246.26

Desviación Estándar del intercepto (a)

: 23393.55

Intervalo de confianza del intercepto (a)

: - 74168.342 < a < 26891.800

Prueba de T-Student Test de Cochram

: 1.0105 < 2.160 : 0.6636 < 0.6830

CONFORME

X

NO CONFORME

74

5.2.3.2 Linealidad del método analítico. Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Nombre Código

Estándar de Referencia de Permetrina. Permetrina SSTD-60-01-12

Pot. Tal cual

Isómero Cis: 27,89%

Isómero Trans: 68.38%

30- 06- 2014

F. vencimiento

Muestra1 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Peso 23.99 35.98 47.95 60.00 71.94

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.239870 0.359800 0.479540 0.599950 0.719400

Área 1 1125388 1619946 2113662 2707034 3176269

Área 2 1103289 1620775 2124244 2704735 3239597

Área 3 1105290 1634319 2120344 2705791 3188965

T. Áreas Área 1 1653954 546769 2435250 809185 3186461 1060336 4089853 1383851 4853210 1639654

Área 2 538357 805544 1070317 1382469 1673449

Área 3 542768 815982 1070519 1385680 1641695

Peso 24.09 35.93 48.01 60.01 72.01

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.240920 0.359300 0.480090 0.600060 0.720050

Área 1 1094736 1600243 2120877 2649442 3049092

Área 2 1100012 1605194 2131657 2662255 3216539

Área 3 1099712 1605591 2133529 2641868 3219224

T. Áreas 1639068 2403119 3202437 4005339 4791898

Área 2 538290 798576 1075359 1365282 1661781

Área 3 541952 800721 1074540 1341612 1663862

Muestra2 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Área 1 542501 799031 1071349 1355559 1565196

75

Muestra3 Dilución al 50% Dilución al 75% Dilución al 100% Dilución al 125% Dilución al 150%

Peso 24.05 36.01 47.95 60.02 71.98

Fiola 100 100 100 100 100

Factor 0.240480 0.360060 0.479480 0.600220 0.719830

Área 1 1086576 1584486 2178552 2662269 3159549

Área 2 1086771 1590883 2180020 2668803 3156127

Área 3 1081086 1592228 2179007 2682504 3162867

T. Áreas 1618275 2383832 3280682 4036905 4827152

Área 1 534703 791512 1101896 1362258 1672269

Área 2 533542 794885 1102766 1365809 1663029

Área 3 532146 797502 1099806 1369073 1667616

Tabla 13: Linealidad del Método

Concentración Muestras Teórica mp1 50% mp2 mp3 mp1 75% mp2 mp3 mp1 100% mp2 mp3 mp1 125% mp2 mp3 mp1 150% mp2 mp3

mg/mL (x) 0.239870 0.240920 0.240480 0.359800 0.359300 0.360060 0.479540 0.480090 0.479480 0.599950 0.600060 0.600220 0.719400 0.720050 0.719830 7.199050

Áreas (y)

Xy

x2

1653954 1639068 1618275 2435250 2403119 2383832 3186461 3202437 3280682 4089853 4005339 4036905 4853210 4791898 4827152 48407435

396733.8660 394884.1823 389162.6918 876203.0699 863440.5369 858322.5499 1528035.3481 1537457.9793 1573021.5652 2453707.5073 2403443.9204 2423031.3192 3491399.0342 3450406.1549 3474729.0641 26113978.7896

0.057538 0.058042 0.057831 0.129456 0.129096 0.129643 0.229959 0.230486 0.229901 0.359940 0.360072 0.360264 0.517536 0.518472 0.518155 3.886392

f (factor y2 respuesta) 2735562731480.11 6895209 2686542815912.11 6803369 2618812896775.11 6729352 5930444186000.11 6768344 5774979326081.78 6688335 5682655004224.00 6620652 10153531580213.80 6644828 10255602738969.00 6670493 10762876572245.40 6842167 16726900288177.80 6816990 16042743175147.10 6674898 16296604670295.10 6725709 23553644068626.80 6746191 22962286442404.00 6654952 23301399649205.40 6705962 175484586145758.00 31257570468

Varianza 6903533460 5465919754 11512270316 5184032436 2090827050 31156583017

76

Gráfico 3: Linealidad del Método

LINEALIDAD DEL MÉTODO 6000000

S 4000000 A E R A2000000

0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

mg/mL

Ecuación de la recta:     ) Coeficiente de correlación (r): r = 0.9996 Coeficiente de Determinación (r2): r2 = 0.9992 Test de Linealidad Coeficiente de variación de los factores de respuesta (f ) :

1.179%

Variación del error experimental total

:

1172504547

Varianza de la Pendiente Desviación Estándar de la pendiente

: :

2718510070 52139.33

Desviación Estándar Relativa de la pendiente

:

0.780%

Prueba de T-Student

:

128.1345 > 2.1604

Test de Proporcionalidad Varianza del intercepto (a)

: 704346415.3

Desviación Estándar del intercepto (a)

: 26539.53

Intervalo de confianza del intercepto (a)

: - 36545.447 < a < 78105.303

Prueba de T-Student Test de Cochram

: 0.7830 < 2.160 : 0.3695 < 0.6830

77

*El gráfico de respuesta (áreas) vs. Concentración del analito, demuestra que el método por cromatografía liquida de alta resolución, produce una respuesta lineal para el analito. *La ecuación de la recta que se obtiene tanto en linealidad del sistema como linealidad del método, nos demuestran que el método responde linealmente en el rango de trabajo empleado. *Los factores de respuesta son semejantes entre si y cercanos al valor de la pendiente. *Usando el test de Cochram, se pudo apreciar que tanto en la linealidad del sistema como del método los resultados Gexp son menores que Gtabla, lo que nos indica que las varianzas de las concentraciones evaluadas son homogéneas y que el factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados. *Mediante el test de linealidad se pudo observar que el texp > t tabla, lo cual significa que la probabilidad de ser b diferente de cero es elevada, confirmando la linealidad del método. *Para el caso de test de proporcionalidad, aplicando el t student, nos indica que el valor experimental es menor al de la tabla con lo cual, nos indica que el valor de “a” es igual o

cercano a cero, comprobándose así la proporcionalidad entre la concentración del principio activo y su respuesta

CONFORME

X

NO CONFORME

78

5.2.4 Exactitud de la técnica analítica. Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina. Permetrina

Nombre

SSTD-60-01-12 Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38%

Código Pot. Tal cual

30- 06- 2014

F. vencimiento

TIEMPPOS DE RETENCIÓN (min)

ÁREAS

N° INYECCIÓN 1 2 3 4 5 PROMEDIO Suma de áreas Coef. de Variación (CV)

Isómero Isómero Trans Cis 3716490 1297118 3756979 1329204 3779727 1332570 3776790 1303625 3704219 1315677 3746841 1315639 5062480 0.7778 1.3583

Isómero Trans

Isómero Cis

4.88 4.87 4.87 4.86 4.85 4.87 0.1678

6.02 6.01 6.00 5.99 5.97 6.00 0.2152

Tabla 14: Porcentaje de recuperación del método analítico.

Porcentaje de analito teórico Exactitud 80%

Exactitud 100%

Exactitud 120%

mg de analito Añadido 29.15 31.32 26.93 55.50 52.19 52.00 67.53 72.98 73.07

Suma de áreas

mg de analito Hallado 29.1512 30.5466 26.6319 54.2380 52.0580 51.6579 63.6945 72.4180 73.2764

2933324 3073729 2679813 5457661 5238298 5198041 6409211 7287008 7373389 Promedio (Rprom) Desviación Estándar (S) Coeficiente de variación (CV)

Porcentaje de recuperación (%R) 100.0043 97.5306 98.8929 97.7261 99.7470 99.3421 94.3202 99.2299 100.2825 98.5640 1.849 1.876

Varianza 1.535012

1.143252

10.12683

79

Porcentaje de recuperación total

: 98.5640%

Prueba de T-Student

: 2.296 < 2.306

*Al ser texp menor que ttabla no existe diferencia significativa entre la recuperación y el 100%, confirmando así la exactitud del método.

CONFORME

X

NO CONFORME

80

5.2.5 Precisión de la técnica analítica. 5.2.5.1 Repetibilidad del sistema (HPLC) Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina. Permetrina SSTD-60-01-12

Nombre Código

Isómero Cis: 27,89%

Pot. Tal cual

Isómero Trans: 68.38%

30- 06- 2014

F. vencimiento

Tabla 15: Repetibilidad del Sistema (HPLC)

N° INYECCIÓN 1 2 3 4 5 6 PROMEDIO Coef. de Variación (CV)

TIEMPPOS DE RETENCIÓN (min)

ÁREAS Isómero Trans 4010309 4031399 4005529 4001430 4004436 4009615 4010453 0.269

Isómero Cis 1501206 1515832 1518325 1505436 1516642 1502777 1510036 0.511

Isómero Trans

Isómero Cis

4.90 4.90 4.90 4.90 4.90 4.90 4.90 0.0000

6.03 6.03 6.04 6.03 6.03 6.03 6.03 0.068

*Al realizar repetidamente los ensayos se obtuvo un coeficiente de variación menor al 2% entre las áreas obtenidas, corroborándose así la repetibilidad del sistema.

CONFORME

X

NO CONFORME

81

5.2.5.2 Repetibilidad de la técnica analítica. Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia Estándar de Referencia de ´Permetrina. Permetrina SSTD-60-01-12

Nombre Código

Isómero Cis: 27,89%

Pot. Tal cual

Isómero Trans: 68.38%

30- 06- 2014 53.94mg

F. vencimiento Peso (mg)

Tabla 16: Repetibilidad del Método (HPLC)

Área M1 Lectura1 Lectura2 Promedio

Isómero Trans

Isómero Cis

2173805 2196089 2184947

1138397 1150305 1144351

Área M2 Isómero Trans

2228998 2195589 2212294

Área M3

Isómero Cis

Isómero Trans

1171919 1155584 1163752

2179812 2175719 2177766

Isómero Cis

Área M4 Isómero Trans

Isómero Cis

Área M5 Isómero Trans

Isómero Cis

1144119 2209966 1162123 2189748 1146998 1144548 2189187 1148693 2175855 1144000 1144334 2199577 1155408 2182802 1145499

Área M6 Isómero Trans

Isómero Cis

2222173 1170643 2218756 1164209 2220465 1167426

Concentración (g/100ml) Lectura1 Lectura2 Promedio

1.0097 1.0202 1.0150

1.0375 1.0223 1.0299

1.0134 1.0123 1.0129

1.0260 1.0155 1.0208

1.0177 1.0126 1.0152

1.0261 1.0231 1.0246

82

Lectura de Repetitividad del Método (HPLC).

N° Muestras

Concentrac. % Concent. (g/100ml) 1.0150 101.4950 1.0299 102.9900 1.0129 101.2850 1.0208 102.0750 1.0152 101.5150 1.0246 102.4600 1.0187 101.9700 0.0066 0.6623 0.6495 0.6495

1 2 3 4 5 6 Promedio S RSD

*Al realizar repetidamente los ensayos se obtuvo un coeficiente de variación menor al 2% entre las áreas y las concentraciones obtenidas, corroborándose así la repetibilidad del método.

CONFORME

X

NO CONFORME

83

5.2.5.3 Precisión Intermedia de la técnica analítica. Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

ANALISTA A: Estándar de Referencia Permetrina de P ermetrina. Nombre SSTD-60-01-12 Código Pot. Tal cual Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38% 30- 06- 2014 F. vencimiento 53.93mg Peso (mg) Estándar 1 2 3 4 5 6

Áreas Isómero Trans 4011562 4012555 4003426 4003177 4006986 4004328

Áreas Isómero Cis 1521126 1516025 1519827 1513455 1518337 1509704

Promedio RSD

4007006 0.10360

1516412 0.28210

Tabla 16: Precisión Intermedia – Analista A

M1

Lectura1 3312202 Lectura2 3346394 Promedio 3329298 Promedio total áreas S

%RSD Lectura1 Lectura2 Promedio S %RSD

1.0097 1.0202 1.0150 0.0066 0.6495

M2

M3

M4

M5

M6

Suma de Áreas del Isómero Trans e Isómero Cis 3400917 3323931 3372089 3336746 3392816 3351173 3320267 3337880 3319855 3382965 3376045 3322099 3354985 3328301 3387891 3349770 27628

0.8248 Concentración (g/100ml) 1.0375 1.0223 1.0299

1.0134 1.0260 1.0177 1.0123 1.0155 1.0126 1.0129 1.0208 1.0152 Promedio de la concentración 1.0197

1.0261 1.0231 1.0246

84

ANALISTA B: Estándar de Referencia Permetrina Nombre SSTD-60-01-12 Código Pot. Tal cual Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38% 30- 06- 2014 F. vencimiento 53.93mg Peso (mg)

Estándar 1 2 3 4 5 6 Promedio RSD

Áreas 3986832 Isómero Trans 4002256 4004514 4004953 4006508 4005244 4001718 0.1855

Áreas1561200 Isómero Cis 1563817 1569620 1567244 1566271 1569362 1566252 0.2088

Tabla 17: Precisión Intermedia – Analista B

M1

Lectura1 3336465 Lectura2 3351117 Promedio 3343791 Promedio total áreas S

%RSD Lectura1 Lectura2 Promedio S %RSD

1.0070 1.0114 1.0092 0.0066 0.6603

M2

M3

M4

M5

M6

Suma de Áreas del Isómero Trans e Isómero Cis 3298475 3355435 3340355 3318686 3316086 3290466 3351783 3330996 3327802 3392145 3294471 3353609 3335676 3323244 3354116 3334151 22654

0.6794 Concentración (g/100ml) 0.9952 0.9928 0.9940

1.0121 1.0072 1.0017 1.0110 1.0043 1.0044 1.0116 1.0058 1.0031 Promedio de la concentración 1.0058

Promedio total entre analistas:

1.01284

Desviación Estándar entre analistas:

0.0096

0.9997 1.0227 1.0112

Coeficiente de Variación entre analistas: 0.949 *En el análisis de precisión intermedia, los resultados obtenidos por ambos analistas, dan un coeficiente de variación menor al 2%, lo que nos demuestra la fiabilidad del método.

85

Asimismo haciendo un análisis global con todos los resultados obtenemos una desviación estándar relativa menor al 3%. Esto demuestra la Precisión del método analítico.

CONFORME

X

NO CONFORME

86

5.2.6 Robustez de la técnica analítica. Producto Método Técnica analítica

: Permetrina 1% Shampoo : Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) : Metodología Propia

Estándar de Referencia de Permetrina. Permetrina Nombre SSTD-60-01-12 Código Isómero Cis: 27,89% Isómero Trans: 68.38% Pot. Tal cual 30- 06- 2014 F. vencimiento 53.30mg Peso (mg)

87

Tabla 18: Robustez de la técnica analítica.

Muestras

Muestra 100 %

Factores Modificados

Condiciones

Volumen de inyección Combinación de la fase móvil a través de la bomba

Normal 20µl a 10µl

Variando marca de la columna Flujo Volumen de inyección Combinación de la fase móvil a través de la bomba Estándar 100 %

Variando marca de la columna Flujo

Bomba: 83:17 NucleosilC18 125mmx4.0mmx5.0µm a Purospher RP 18e 125mmx4.0mmx5.0µm 1,3mL/min a 1,5 mL/min Normal 20µl a 10µl Bomba: 83:17 NucleosilC18 125mmx4.0mmx5.0µm a Purospher RP 18e 125mmx4.0mmx5.0µm 1,3mL/min a 1,5 mL/min

Suma áreas Concentración Iso Trans e %Alteración g/100mL Iso Cis 3283568 0.9750 100 100 1649496 0.9766 100.16 0.16 3312259

0.9745

99.95

0.05

3219224

0.961

98.56

1.44

0.9568

98.13

1.87

2775587 5281537 2684887

Coef. de variación CV %

5364847 5751612

0.947%

4606728

*Luego de evaluar las concentraciones modificando parámetros cromatográficos del sistema HPLC obtenemos concentraciones similares En comparación con la concentración del producto a condiciones normales, por lo que el método evaluado es robusto frente al cambio Cromatografico estudiado.

CONFORME

X

NO CONFORME

88

5.2.7 Intervalo de la técnica analítica.

Producto

: Permetrina 1% Shampoo

Método

: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Técnica analítica

: Metodología Propia Tabla 19: Intervalo de la técnica analítica.

PARÁMETROS

RANGO

RESULTADO

LINEALIDAD

50% - 150%

CUMPLE

EXACTITUD

50% - 150%

CUMPLE

100%

PRECISIÓN

CONFORME

X

CUMPLE

NO CONFORME

89

6. Informe Técnico Tabla 20: Resumen de Resultados

PARÁMETRO DE VALIDACIÓN SELECTIVIDAD

RESULTADOS ESPECIFICACION

Isómero Trans

Interferencia no mayor a 2 %

Coeficiente de correlación : r > 0,997 Coeficiente de determinación: r2 > 0.995 Ecuación de la recta. y = bx + a Test de Linealidad CV Factor de Respuesta: CV (f) < 5 % LINEALIDAD DE RSD de la pendiente (b): menor a 2 % SISTEMA Test de Student: t exp > t tablas Test de Proporcionalidad Test de Student: t exp < t tabla Test de Cochram: Gexp < Gtabla Coeficiente de correlación : r > 0,997 Coeficiente de determinación: r2 > 0.995 Ecuación de la recta. y = bx + a Test de Linealidad LINEALIDAD DE CV Factor de Respuesta: RSD < 5 % RSD de la pendiente (b): menor a 2 % MÉTODO Test de Student: t exp > t tablas Test de Proporcionalidad Test de Student: t exp < t tabla Test de Cochram: Gexp < Gtabla EXACTITUD

Porcentaje de recuperación: 97%-103% Test de G de Cochran: G exp < G tablas Test de T de Student: T exp < T tablas

PRECISION

Repetibilidad del sistema: RSD < 2 % Repetibilidad del método: RSD < 2 % P. Intermedia: RSD entre analistas < 3 %

ROBUSTEZ

RSD < 2 %

Isómero Cis

CONFORME 0.9989 0.9978

0.9985 0.9970

y =10650220.15X + 21260.68

y =9920461.80X + (-23638.27)

1.855% 1.299% 76.9829 > 2.1604

2.352% 1.525% 65.5688 > 2.1604

0.4054 < 2.1604 0.5602 < 0.6830

1.0105 < 2.1604 0.6636 < 0.6830

0.9996 0.9992 y = 6680844X + 20779.93 1.179% 0.780% 128.1345 > 2.1604 0.7830 < 2.1604 0.3695 < 0.6830 98.5640% 0.7908 < 0.8709 2.296 < 2.306 0.38%

0.38% 0.649% 0.951% 0.95%

90

CAPÍTULO IV

91

4.1 DISCUSIONES:



Se validó la técnica analítica con un sistema cromatográfico similar al referido por P.

Modamio: columna: Nucleosil C18x 125mm x 4,0mm x 5,0µm; flujo: 1,3mL/min; fase móvil: metanol: agua (83:17); detección: 254nm, diferente de P. Modamioque detectó las muestras a una longitud de onda de 272nm. Esta diferencia pone de relieve la necesidad de validar técnicas de acuerdo a la variación de la matriz de la muestra. 

La Selectividad del método fue corroborada a través de los cromatogramas realizados, en los cuales los tiempos de retención fueron 4.90 min para el isómero trans y 6.03 para el isómero Cis, y aunque los tiempos fueron inferiores a lo referido por Tarinas

et al. y P. Modamio , el método cumple con el parámetro de Selectividad ya que no existen interferencias en los tiempos de retención de los picos mencionados. 

Los resultados del ensayo de Linealidad mostraron una buena correlación entre el área y la concentración dentro del rango estudiado dado por los coeficientes de correlación (r), que es r > 0.99 para ambos isómeros y cumple con lo establecido en la literatura, dato similares encontrados por Tarinas et al. Esto demuestra que existe relación lineal entre las variables de concentración y sus respuestas.



El método es también Exacto y Preciso dentro del rango de concentraciones estudiado, cumpliendo con lo establecido por la literatura, CV < 2%

92

4.2 CONCLUSIONES



El método es selectivo, porque permite el análisis del principio activo sin la interferencia de los excipientes presentes en la formulación del Shampoo.



El método es lineal, porque los resultados obtenidos son directamente proporcionales a la concentración de analito en la muestra.



El método es preciso, porque nos permite obtener resultados repetitivos y reproducibles, cuando este es aplicado en análisis repetitivos de la misma muestra.



El método es exacto, ya que permite la recuperación de la totalidad de analito presente en la muestra.



El método de análisis propuesto cumple con los parámetros establecidos para una validación demostrando que es posible la cuantificación de Permetrina por HPLC.



El método de análisis para la cuantificación del analito en estudio cumple con los parámetros de selectividad, Linealidad, exactitud y precisión; por lo tanto dicho método se encuentra validado y es apto para su utilización.

93

11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1. Orosco Ch. Anteproyecto Residencia Profesional. “Validación de dos métodos analíticos para la cuantificación de Metformina en tabletas”. Instituto Tecnológico de

Durango. Durango 2011. 2. Yulissa. Desarrollo y validacion de una tecnica analitica por cromatografia liquida de alta performance(HPLC) para cuantificar clonixinato de lisina 125mg y parvagerina clorhidrato 10mg en tabletas recubiertas. Tesis. Lima: Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima; 2007. 3. Barbosa NR, Santos FO, Ferreira AS. Cromatografía líquida de alta eficiencia aplicada al control de calidad de cis- permetrina en loción para el cabello. HU Journal. 2008; 34(1). 4. shishovska Ma, Stefova MT. Fast and Universal HPLC method for determination of premethrn in formulations using 1.8um Particle-packed column and performance comparison with others column types. Journal of Cromatographic Science. 2012; 50: p. 43-50. 5. Montoya E. Optimización, validación y modelización de un proceso de fabricación de comprimidos. Desarrollo de una aplicación interactiva multimedia. Tesis. Barcelona: Universidad de Barcelona, Barcelona 2001. 6. Galvez C. scribd. [Online].; 2010 [cited 2012 Agosto 18. Available from: es.scribd.com/doc/27119624/Por-Que-Validar-Un-Metodo-A. 7. Polanco MEH. Scribd. [Online].; 2008 [cited 2013 Agosto 18. Available from: http://es.scribd.com/doc/4925527/porque-validar-metodos-analiticos. 8. Henry Paúl Capcha Espinoza Gplr. "Desarrollo y Validación de un Método Analítico para la Cuantificación de Dexametasona y Clotrimazol en Crema, Por Hplc Y Análisis de Productos Comercializados en El Perú” Henry Paúl Capcha Espinoza Gplr, editor.

94

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95

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96

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97

ANEXOS

98

Anexo 1. Aptitud del Sistema

Cromatograma N°1: Primera Inyección

Cromatograma N°2: Segunda Inyección

99

Cromatograma N°3: Tercera Inyección

Cromatograma N°4: Cuarta Inyección

100

Cromatograma N°5: Quinta Inyección

Anexo 2: Interferencia del método

Cromatograma N°6: Interferencia de la fase móvil

101

Cromatograma N°7: Interferencia de la muestra

Cromatograma N°8: Interferencia del placebo

102

Cromatograma N°9: Interferencia del estándar

Anexo 3: Prueba de Estresamiento de muestras.

Cromatograma N°10: Muestra en condiciones normales

103

Cromatograma N°11: Muestra con degradación térmica

Cromatograma N°12: Muestra con degradación Alcalina

104

Cromatograma N°13: Muestra con degradación acida

Cromatograma N°14: Muestra con degradación oxidativa

105

Cromatograma N°15: Muestra expuesta a luz UV

Anexo 4: Linealidad del Sistema Cromatograma N°16: Linealidad 50% - I

106

Cromatograma N°17: Linealidad 50% - II

Cromatograma N°18: Linealidad 50% - III

Cromatograma N°19: Linealidad 75% - I

107

Cromatograma N°20: Linealidad 75% - II

Cromatograma N°21: Linealidad 75% - III

Cromatograma N°22: Linealidad 100% - I

108

Cromatograma N°23: Linealidad 100% - II

Cromatograma N°24: Linealidad 100% - III

Cromatograma N°25: Linealidad 125% - I

109

Cromatograma N°26: Linealidad 125% - II

Cromatograma N°27: Linealidad 125% - III

Cromatograma N°28: Linealidad 150% - I

110

Cromatograma N°29: Linealidad 150% - II

Cromatograma N°30: Linealidad 150% - III

111

Anexo 5: Linealidad del Método Cromatograma N°31: Linealidad 50% - I

Cromatograma N°32: Linealidad 50% - II

Cromatograma N°33: Linealidad 50% - III

112

Cromatograma N°34: Linealidad 75% - I

Cromatograma N°35: Linealidad 75% - II

Cromatograma N°36: Linealidad 75% - III

113

Cromatograma N°37: Linealidad 100% - I

Cromatograma N°38: Linealidad 100% - II

Cromatograma N°39: Linealidad 100% - III

114

Cromatograma N°40: Linealidad 125% - I

Cromatograma N°41: Linealidad 125% - II

Cromatograma N°42: Linealidad 125% - III

115

Cromatograma N°43: Linealidad 150% - I

Cromatograma N°44: Linealidad 150% - II

Cromatograma N°45: Linealidad 150% - III

116

Anexo 6: Exactitud Cromatograma N°46: Exactitud 50% - I

Cromatograma N°47: Exactitud 50% - II

Cromatograma N°48: Exactitud 50% - III

117

Cromatograma N°49: Exactitud 100% - I

Cromatograma N°50: Exactitud 100% - II

Cromatograma N°51: Exactitud 100% - III

118

Cromatograma N°52: Exactitud 150% - I

Cromatograma N°53: Exactitud 150% - II

Cromatograma N°54: Exactitud 150% - III

119

Anexo 7: Repetibilidad del Sistema Cromatograma N°55: Primera Inyección

Cromatograma N°56: Segunda Inyección

Cromatograma N°57: Tercera Inyección

120

Cromatograma N°58: Cuarta Inyección

Cromatograma N°59: Quinta Inyección

Cromatograma N°60: Sexta Inyección

121

Anexo 8: Repetibilidad del Método Cromatograma N°61: Primera Muestra

Cromatograma N°62: Segunda Muestra

Cromatograma N°63: Tercera Muestra

122

Cromatograma N°64: Cuarta Muestra

Cromatograma N°65: Quinta Muestra

Cromatograma N°66: Sexta Muestra

123

Anexo 9: Precisión Intermedia Analista A Cromatograma N°67: Primera Muestra

Cromatograma N°68: Segunda Muestra

Cromatograma N°69: Tercera Muestra

124

Cromatograma N°70: Cuarta Muestra

Cromatograma N°71: Quinta Muestra

Cromatograma N°72: Sexta Muestra

125

Analista B Cromatograma N°73: Primera Muestra

Cromatograma N°74: Segunda Muestra

Cromatograma N°75: Tercera Muestra

126

Cromatograma N°76: Cuarta Muestra

Cromatograma N°77: Quinta Muestra

Cromatograma N°78: Sexta Muestra

127

Anexo 10: Robustez Cromatograma N°79: Muestra a condiciones normales

Cromatograma N°80: Muestra con Volumen modificado

Cromatograma N°81: Muestra con variación de flujo

128

Cromatograma N°82: Muestra Refrigerada

Cromatograma N°83: Muestra con cambio de columna

Cromatograma N°84: Muestra con fase móvil modificada

129

Anexo 11: Criterios de Aceptación de los Parámetros de Validación

PARÁMETRO DE VALIDACIÓN SELECTIVIDAD

ESPECIFICACION Interferencia no mayor a 2 % Coeficiente de correlación : r > 0,997 Coeficiente de determinación: r2 > 0.995

LINEALIDAD DE SISTEMA

Ecuación de la recta. y = bx + a Test de Linealidad CV Factor de Respuesta: CV (f) < 5 % RSD de la pendiente (b): menor a 2 % Test de Student: t exp > t tablas Test de Proporcionalidad Test de Student: t exp < t tabla Test de Cochram: Gexp < Gtabla

LINEALIDAD DE MÉTODO

Coeficiente de correlación : r > 0,997 Coeficiente de determinación: r2 > 0.995 Ecuación de la recta. y = bx + a Test de Linealidad CV Factor de Respuesta: RSD < 5 % RSD de la pendiente (b): menor a 2 % Test de Student: t exp > t tablas Test de Proporcionalidad Test de Student: t exp < t tabla Test de Cochram: Gexp < Gtabla

EXACTITUD

Porcentaje de recuperación: 97%-103% Test de G de Cochran: G exp < G tablas Test de T de Student: T exp < T tablas

PRECISION

Repetibilidad del sistema: RSD < 2 % Repetibilidad del método: RSD < 2 % P. Intermedia: RSD entre analistas < 3 %

ROBUSTEZ

RSD < 2 %

Fuentes: Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), Validación de Métodos Analíticos, Madrid: Gráficas Gispert S.A., 2001. States Pharmacopeial Conv. Inc., United States Pharmacopeia 35 NF 30, Monografías Oficiales, 2012.

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