Universidad de Nariño Laboratorio de bioquímica Fermentación de la glucosa
Integrantes: Anamaria pinza Figueroa Pablo Moreno Diego Jiménez RESUMEN:
Durante esta práctica de laboratorio se trabajó en la obtención de los productos formados en la fermentación de glucosa glucosa por acción de de la levadura y lactobacillus, lactobacillus, además además de realizar algunas pruebas para la identificación identificación de estos; tales como: determinación determinación de piruvato con nitro prusiato de sodio, determinación de piruvato con 2-4 dinitrofenilhidrazina, determinación de etanol, determinación de etanol a ácido sulfocromico a acetaldehído y determinación de ácido láctico. INTRODUCCION:
La glucolisis glucolisis es el proceso proceso por el cual la glucosa se transforma en piruvato con formación de ATP. En ausencia de oxígeno, luego de la glucolisis se lleva a cabo la fermentación, donde se produce etanol y CO2 y/o ácido láctico, dependiendo del organismo que lo efectué; en el primer caso las levaduras son las responsables. Ambas rutas de fermentación (producción de etanol y ácido láctico) son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo similares las etapas de conservación de energía que conducen a la formación de ATP. La glucolisis no solo es la vía principal para el metabolismo de la glucosa que conlleva a la producción de acetil- CoA y a su subsiguiente oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. METODOLOGIA.
1. preparación del filtrado.
En dos tubos de ensayo se pipeteo 10 ml de glucosa, a un tubo se le añadió 5 ml de suspensión de levadura y en el otro 5 ml de la suspensión de lactobacillus. Se tapó los tubos con papel aluminio y se los coloco en un baño maría entre 35-40 °C durante una hora, luego se añadió a cada tubo 2 ml de la solución de ácido tricloroacetico. 2. determinación de piruvato con nitro prusiato de sodio.
En un tubo de ensayo se calentó hasta ebullición 2 ml del filtrado y se le agrego 1 g de sulfato de amonio sólido y se le adiciono 2 gotas de solución de nitro prusiato de sodio y se mezcló vigorosamente, se dejó deslizar por las paredes del tubo amoniaco concentrado hasta que se formaron dos capas. 3. determinación de piruvato con 2,4dinitrofenilhidrazina
A dos ml del filtrado se le agregó 1 ml de solución saturada de 2,4dinitrofenilhidrazina, se mezcló vigorosamente y se colocó 3 gotas de la
mezcla en un tubo de ensayo, se agregó 1 ml de solución de hidróxido de sodio al 10% y se diluyo con agua destilada hasta 5 ml. 4. Determinación de etanol A 2 ml del filtrado se le agregó 0.2 g de carbonato sódico. Después de disolverlos se colocó el tubo en un baño maría manteniendo a unos 70 °C y se fue añadiendo gotas de yodo- yoduro hasta que no desapareció el color del yodo; llegando a este punto se dejó los tubos unos tres minutos más en el baño de agua caliente y luego se enfrió en un baño de agua fría. 5. determinación de etanol mediante su oxidación
con
ácido
sulfocromico
a
acetaldehído.
A 1ml del filtrado se le añadió 0.5 ml de solución sulfocromica diluida, tras mezclar bien el conjunto se calentó en un baño de agua hirviente. 6. determinación del ácido láctico A 1 ml de filtrado se le agregó 1 ml de éter etílico y se agito intensamente el conjunto; una vez separadas las fases se recogió la fase etérea (correspondiente a la parte superior) y se le añadió un volumen igual de solución de cloruro férrico. Resultados y discusión. Pruebas
Tubo con levadura
Tubo con lactobacillus
piruvato con nitro prusiato
+
+
piruvato fenilhidrazina
con
+
+
Determ. De etanol con carbonato etanol
+
-
+
-
Ácido láctico
-
+
1. determinación
de
piruvato
con
nitro
prusiato de sodio.
Se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima piruvato descarboxilasa funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima, o se puede usar un agente como el nitro prusiato de sodio que “atrape” el intermediario y que forme un compuesto que no puede metabolizarse. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitro prusiato de sodio, entonces se desactiva la enzima piruvato descarboxilasa en solución alcalina débil, entonces el nitro prusiato de sodio reacciona con el piruvato formando un anillo de coloración verde EL nitroprusiato de sodio DETECTA GRUPOS CETONICOS COMO EL PRESENTE EN LOS PIRUVATOS H3C-CO-COO2. Determinación de piruvato con 2,4dinitrofenilhidrazina.
Las observaciones anteriores se deben a que los intermediarios metabólicos como el piruvato se encuentra presentes en bajas concentraciones, por lo tanto para demostrar su existencia como intermediarios en el proceso metabólico es necesario que se impida que sean transformados en otros compuestos. La 2,4-dinitrofenilhidracina puede usarse para detectar cualitativamente los grupos carbonilo de cetonas y aldehídos. El resultado es positivo cuando hay un precipitado rojo o amarillo, de esta manera la coloración que se presento en nuestros resultados fueron de coloración roja.
4. determinación de etanol mediante su oxidación
con
ácido
sulfocromico
a
acetaldehído.
3. Determinación de etanol con carbonato sódico
Los resultados de esta prueba fueron positivos para la muestra con levadura presentándose una precipitación en la base de color amarillo y en la parte superior de color blanco, además de presentar cierto olor característico al yodoformo; en la muestra con lactobacillus no se presento este tipo de reacción determinante del etanol, se presento una precipitación de color amarillo ocre. Fueron positivos para la muestra con levadura debido a que la ruta metabólica que sigue es el de la fermentación alcohólica para formar acetaldehído y seguidamente el etanol, Cuando se usan yodo y carbonato sódico como reactivos, una reacción positiva produce yodoformo. El yodoformo (CHI3) es una sustancia de color amarillo pálido, es insoluble en agua, y tiene un olor a antiséptico. Se formará un precipitado visible de este compuesto a partir de una muestra, sólo cuando esté presente una metilcetona, etanal, alcohol secundario de metilo, o etanol.
Los resultados de esta prueba dieron positivos para la levadura, presentándose un color verde, mientras que en lactobacillus se formo un precipitado dando la prueba negativa. La oxidación de un alcohol produce un compuesto carbonilico. Dependiendo del alcohol y del agente oxidante puede resultar que se obtenga un aldehído, una cetona o un ácido carboxílico; en nuestro caso un acetaldehído. El etanol es un alcohol primario Por lo general es difícil obtener el acetaldehído, porque la mayor parte de los agentes oxidantes que pueden oxidar al alcohol primario, también oxidan al aldehído. El ácido crómico oxida a un alcohol primario y llega hasta el ácido carboxílico. Esquema general: -paso 1El ácido crómico es protonado, casi de inmediato se rompe el enlace con el cromo para formar agua, la parte parcialmente positiva del cromo se une con la negativa del alcohol para formar un éster cromado:
-paso 2- El agua se protona formando un ión hidronio, se forma el doble enlace con el oxígeno para formar un aldehído, el cromo se reacomoda para formar el ion cromito más estable:
-En las reacciones mostradas se indica el
esquema general del proceso de prueba de yodoformo, el alcohol utilizado es alcohol isopropilico, KI (lugol)-
5. determinación del ácido láctico.
La fermentación láctica es una ruta metabólica anaeróbica que se desarrolla en el citoplasma de la célula, en este proceso la glucosa se oxida parcialmente para obtener energía y acido láctico. El acido láctico se identifica en los sistemas D y Dm que siguen
la ruta de la fermentación láctica, dada la adición de el lactobacillus proveniente del yogurt. El método empleado para su determinación colorimétrica, es la adición de cloruro férrico (formación de lactato ferroso que presenta una coloración amarillo verdoso).
--- ESQUEMAS DE LAS REACCIONES DE FERMENTACION ALCOHOLICA Y LACTICA---
Conclusiones.
mediante esta práctica de laboratorio se logro identificar los productos procedentes de las rutas metabólicas, mediante el uso de algunas pruebas que identificaban sus grupos funcionales.
