Tincion de gram-Introduccion desarrollo e interpretacion de resultados Practica 2

Practica de Microbiología 2010

Universidad Autónoma de Zacatecas Francisco García Salinas Área de Ciencias de la Salud Unidad Académica de Ciencias Químicas Químico Farmacéutico Biólogo REPORTE DE PRÁCTICA: PRÁCTICA: LABORATORIO LABORATORIO DE DE MICROBIOLOGIA RACTICA 2 P RACTICA

TINCION DE GRAM *López Arellano Arellano Abraham M. en C. Rubén Méndez Márquez *5°Semestre Grupo ³C´ Programa educativo Q.F.B. UACQ, UACQ, ACS, Campus UAZ Siglo XXI, carretera Zacatecas-Guadalajara Km 6 s/n ejido La Escondida Cp. 98160 Zacatecas Zac. Ciclo agosto-diciembre 2010 Lunes 30 de agosto-lunes 6 de septiembre 2010 OBJETIVO Mostrar la importancia de una tinción para la diferenciación de bacterias basándose en las propiedades estructurales de la pared celular, aplicando el mecanismo de la coloración de Gram, con microorganismos conocidos y desconocidos. RESÚMEN La tinción de Gram es una prueba útil y de fácil realización que permite diferenciar las dos principales clases de bacterias con el objeto de instaurar un tratamiento Se colocan sobre un portaobjetos bacterias fijadas por calor o secadas de algún otro modo y se tiñen con cristal violeta a continuación, se añade una solución yodada que actúa como mordiente y luego se realiza un lavado con un agente decolorante (acetona) y agua con el fin de eliminar el colorante colorante no fijado. f ijado. Posteriormente Posteriormente se cubre con un colorante de contraste, safranina, para teñir de rojo las células que no hayan retenido el cristal violeta. Todo este proceso tiene una duración inferior a 10 minutos. [1] 1

Palabras clave: Pared celular, Gram positiva, Gram negativa.

Laboratorio de Microbiología LÓPEZ ARELLANO ABRAHAM

Practica de Microbiología 2010 INTRODUCCIÓN Y FUNDAMENTO La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células Gram positivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. Laboratorio de Microbiología LÓPEZ ARELLANO ABRAHAM

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Practica de Microbiología 2010 El carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son Gram-variables, es decir, unas veces Gram positivos y otras Gram negativos. Morfología ultramicroscópica ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares, extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular.Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, amino azúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias Grampositivas contienen menos aminoácidos que las Gram-negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las Gram-negativas que en las Gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al Gram (ver las dos imágenes juntas). [2]*

Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

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Practica de Microbiología 2010 MATERIAL Y EQUIPO Laminas portaobjetos Cubreobjetos Asa de platino Microscopio Óptico (marca Carl Zeizz) línea Axiostar Plus (serie student). Mechero de Bunsen Puente para tinciones Goteros Lápiz graso y y y y y y y y

REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS Un cultivo de 24 horas, en agar nutriente de E scherichia scherichia coli Un cultivo de 24 horas en agar nutriente de S taphylococcus taphylococcus aureus Solución de cristal violeta Solución de agua-acetona Solución de lugol Solución de Safranina Aceite de inmersión y y y y y y y

PROCEDIMIENTO 1. En cada lamina lamina portaobjetos trazar una línea línea de seguridad con el lápiz graso. graso. 2. Colocar una gota de agua en cada uno de los extremos del portaobjetos. Con el asa de nicromo, después de haberla esterilizado en la flama, tome una pequeña asada del microorganismo E. coli, haga el frotis en forma oval sobre la gota de agua colocada anteriormente en la primera parte del portaobjetos. Hacemos l mismo para el cultivo de S. aureus en el otro extremo del portaobjetos. 3. Fijamos la preparación al calor, pero sin calentar demasiado el portaobjetos. 4. Repetir los pasos pasos 2 y 3 en las tres láminas restantes. 5. Al primer portaobjetos cubrirlo con cristal violeta violeta durante 60 s Tirar el exceso de colorante y lavar al chorro de agua indirectamente, secar al aire. 6. Al segundo frotis cubrirlo con cristal violeta durante 60s. Tirar el exceso exceso de colorante y lavar con agua, agregamos lugol dejándolo sobre la preparación durante 30s. lavamos con agua indirectamente y secamos secamos al aire


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Practica de Microbiología 2010 7.

Al tercer frotis cubrirlo con cristal violeta durante 60 s, tirar el exceso de colorante y lavar con agua, agregamos lugol dejándolo 30s, decoloramos con alcohol-acetona, Lavamos a chorro de agua indirecto y secamos al aire.

8. Al cuarto frotis cubrirlo con cristal violeta durante 60 s, tirar el exceso de colorante y lavar con agua, agregamos lugol dejándolo 30s, decoloramos con alcohol-acetona, y aplicamos el colorante de contraste (Safranina o fucsina) y lo dejamos actuar durante 15s. Lavamos a chorro de agua indirecto y secamos al aire. 9. Observamos con aceite y objetivo objetivo de inmersión las cuatro preparaciones preparaciones y dibujamos y anotamos los resultados. OBSERVACION OBSERVACION Y RESULTADOS

Portaobjetos No. 1 A

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E. coli Inmersión 100x

S. aureus Inmersión 100x


B

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S. aureus Inmersión 100x Laboratorio de Microbiología

LÓPEZ ARELLANO ABRAHAM

Practica de Microbiología 2010 Portaobjetos No. 3 A

B





B


Aquí se muestran las imágenes de lo observado en un lado de los portaobjetos (izq.) se muestra el microorganismo E scherichia scherichia coli y del lado derecho vemos el taphylococcus aureus los cuales se tiñeron con cristal violeta para el primer S taphylococcus portaobjetos, por lo que observamos su coloración azul o violeta en ambos microorganismos pero tienen una marcada diferencia en su forma ya que el E . coli tiene forma bacilar y agrupamiento de de estreptos y empalizada mientras que el S . aureus tiene forma de coco agrupándose en forma de diplococos tétradas y sarcinas principalmente. Sobre la morfología macroscópica no fue posible su observación ya Laboratorio de Microbiología LÓPEZ ARELLANO ABRAHAM

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Practica de Microbiología 2010 que aun no se tenía en cuenta pero en general su elevación se observo plana un borde ondulado- lobulado y de forma de circulo a irregular, no se aprecio un olor alguno mucho menos su sabor, a simple vista se observaron colonias blancasamarillentas en los dos cultivos. Microscópicamente se observo su tamaño: E. coli 1x3 micrómetros y el S. aureus alrededor de 0.9 micrómetros de diámetro no vimos flagelos pues no teníamos tinción especial parta ellos pues de antemano se sabe que la E. coli tiene flagelo tampoco observamos fimbrias, solo su membrana-pared celular que se tiñe un poco más obscuro que el resto de su citosol. En el segundo portaobjetos lo que hay que resaltar es que no se observan cambios aparentes aunque a este se le agrego lugol los dos microorganismos microorganismos se siguen viendo azul-violeta pero en un tono un poco menor debido a que se lava un poco más el colorante de cristal cuando se quita el exceso de lugol. En el tercer portaobjetos que decoloramos con acetona-agua no se observa nada en la parte del E . coli pues este no retiene el complejo yodo cristal violeta perdiendo todo el color siendo imposible observarlo, mientras que del lado donde se encuentra el S . aureus se vuelve a observar el microorganismo del mismo color pues este si retiene el complejo yodo cristal violeta dándonos como resultado que es una bacteria Gram positiva (azul). En el cuarto portaobjetos Para hacer la diferenciación se requiere un colorante de contraste que en esta ocasión fue la safranina tiñendo esta solo al microorganismo E. coli de un color rojonaranja dándonos así por concluido el procedimiento para diferenciar las bacterias en Gram negativa (roja E. coli) y Gram positiva (azul S. aureus).

DISCUSION La dictaminarían que dé el químico al dar los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnostico y buen tratamiento de la patología relacionada microorganismos es necesario saber cómo influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en su detección y en el tratamiento. Porque existen componentes de la pared celular que contribuyen a la virulencia de las bacterias protegiéndolas de las respuestas inmunitarias. En el laboratorio se desearía eliminar de forma selectiva las bacterias Gram positivas de una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram negativas. La tinción de Gram no es una prueba fiable de tinción de bacterias en medios de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria) o tratados con antibióticos debido a la degradación del peptidoglicano por parte de estos fármacos.


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Practica de Microbiología 2010 CONCLUSION La tinción de Gram es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología así como en los análisis clínicos y diagnostico medico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes celulares tendrán o no propiedades patológicas diferentes. CUESTIONARIO 1.-Mencione el grosor de la pared celular bacterianas Gram positivas y Gram negativas: Una bacteria grampositiva posee una pared celular gruesa. (150 a 500 A) que rodea la membrana citoplásmica consta de varias capas y está formada principalmente por peptidoglicano que contiene ácidos teicoico y lipoteicoico Las paredes celulares Gram negativas son más delgadas. 2.-Mencione como se clasifican los colorantes de acuerdo a sus cargas eléctricas Colorantes ácidos, básicos y neutros a) Tinción básica es aquella en que el color está dado por el ion cargado positivamente. Azul de metileno (+) + cloruro (-) b) Tinción ácida es aquella en que el color está dado por el ion cargado negativamente. Ejemplo: Eosinato (-) + Sodio (+) c) Tinción neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos colorantes ácidos y básicos. Una reacción de tinción se debería a una combinación de reacciones físicas y químicas. rupo cromóforo 3.-Dig a que ent i iende ende por g rupo

Los colorantes son compuestos químicos químicos que poseen un grupo grupo cromóforo que es la una parte o conjunto de átomos átomos en una molécula responsable de su color a la molécula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electro-líticamente y por lo tanto formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica. . También se puede definir como una sustancia que tiene muchos electrones capaces de absorber energía o luz visible, y excitarse para así emitir diversos colores, dependiendo de las longitudes de onda de la energía emitida por el cambio de nivel energético de los electrones, de estado excitado a estado fundamental o basal.[3] 4.- Dig os se pueden ut i i l liz ar como contraste, en esta .- Dig a que colorantes secundar i os i z ar t i i nc nc i ión ó n.

Fucsina básica y Safranina


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Practica de Microbiología 2010 Invest ig ue .- Invest ig ue 5 .-

la reacc i ión ó os y levaduras n de Gram de hon g os La Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994.establece el método para evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos.

. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras obtenidas. Contar las colonias presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. El color depende de la composición de la pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como en las bacterias Observar la presencia de colonias en la superficie del medio de cultivo. Antes de hacer el recuento hay que distinguir entre las colonias de levaduras y las colonias formadas por las bacterias presentes en la muestra. Para ello, sólo es preciso realizar una tinción Gram de todos los tipos coloniales que puedan inducir a error. [4] REFERENCIAS 1Daniel

RA, E rrington rrington J: Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell, Cell 113:767-776,200 3. 2-http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/ S eminarioTinciones.htm eminarioTinciones.htm *gráficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm 3. html.rincondelvago.com/espectroscopia-de-absorcion-molecular-uv-vis.html 4. Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B. S errano errano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. Versión

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