UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
UNIVERSITE DE CARTHAGE INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES ET DE TECHNOLOGIE
Thèse DE DOCTORAT en BIOLOGIE Spécialité : Génétique et Biologie Moléculaire Présentée par :
Aymen EZZINE
Intitulée :
Technologie d’Expression des Protéines Recombinantes d’Intérêt Thérapeutique Chez Arabidopsis thaliana et Pichia pastoris
Soutenue le 28 Mai 2011 devant le jury composé de : Pr. Mohamed Amri Pr. Amel Salhi Hannachi. Pr. Sadok Boukhchina Dr. Sami Fattouch. Pr. Med Najib Marzouki
Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Directeur de thèse
Année Universitaire 2010/2011
Dieu Merci, De M’accorder La Force, La Patience Et Le Savoir Faire
Dédicace ;
A Mes Chers Parents Je Vous Adresse Tous Mes Sentiments D’amour Et De Gratitude Je Suis Vraiment Fier D’être Votre Fils Je Ne Trouve Aucun Mot Ni Expression Qui Peut Suffire Pour Vous Remercier Que Dieu Vous Réserve Toute La Joie Et Le Bonheur
A Mon Cher Frère Achref; A Ma Chère Sœur Maha Et Ses Petites Filles Yasmine Et Hanine
"Si la nature apparut d'abord à l'Homme comme une donné qu'il ne pouvait maitriser parce qu'il ne pouvait que l'observer à défaut de le comprendre, qui profitait à son corps ou le menaçait, jamais depuis qu'il est Homme il ne sut s'en contenter. Toujours, il lui a fallut chercher à conserver ou à modifier le vivant qui l'entourait, parce que d'abord il lui fallait protéger son corps, sa vie même."
François gros in "l'ingénierie du vivant", éd. Odile Jacob, 1992.
Je voudrais remercier le professeur Med Najib Marzouki, responsable de l’Unité de recherche de Génie Biologique à l’INSAT pour m’avoir intégrer au sein de son équipe. La confiance qu’il m’a accordé m’a beaucoup soutenu lors de ma présence au sein de l’équipe. Ses conseils très instructifs et ses qualités scientifiques très exceptionnelles m’étaient d’un très grand apport lors de l’accomplissement de ce travail. Qu’il trouve ici l’expression de mon sincère respect. J’avais la chance de participer au projet de collaboration avec Dr. Laura Baciou qui m’a soulevé de grands apports aussi bien scientifiques qu’intellectuelles. Merci pour l'accueil, les conseils, et ta gentillesse perpétuelle. Grand merci du fond du cœur. Merci à tous les membres du Jury d’accepter de lire et critiquer ce mémoire. Professeur Mohamed Amri, Merci pour votre intérêt à mon travail, de vos conseils précieux et de votre disponibilité. Professeur Amel Hannachi Salhi, Vous m'avez toujours témoigné une grande gentillesse. Vous avez également su me faire profiter de vos conseils et de vos encouragements. C'est pour moi un plaisir que vous soyez rapporteur de cette thèse. Professeur Sadok Boukhchina, Je vous remercie d’accepter de lire et critiquer ce travail. Vous avez toujours donné l’exemple dans le sérieux et l’honnêteté scientifique. Vos conseils et vos remarques m’ont beaucoup aidé dans ce rapport. Docteur Sami Fattouch, Votre intérêt et vos conseils m'ont vraiment encouragé aussi bien dans le domaine de la recherche que dans l’enseignement. Merci pour le sens de l’amitié. Je vous remercie d'avoir accepté d'examiner ma thèse. Avec mon respect.
Cette page ne suffira pas, et j'en oublierai quand même, mais je veux essayer de remercier tous ceux qui ont contribué à ce travail, ou qui ont contribué à me le rendre agréable. Un grand merci donc à tous pour l’amour, l’amitié, la gentillesse, merci pour les sourires, merci de m'avoir supporté…
Un grand Merci à Ines Ben Khadija ; tu as guidé mes premiers pas dans le laboratoire. Un remerciement exceptionnel adressé à mon cher ami Dr. Said Galai et sa femme Sihem pour la sympathie et l’amitié qu’ils m’ont fourni tout au long de ce travail avec des moments tant difficiles qu’agréables. Que Dieu vous accorde la chance et le bonheur. Je veux remercier aussi Dr. Sonia M’Hirsi et Dr. Farid Abidi pour leurs qualités humaines et leurs encouragements continus. A mon ami et collègue Dr. Issam Smaâli je te remercie pour tous les conseils et les discussions scientifiques. Je te souhaite un bon avenir et la réussite dans la vie. A mon amie Imène Hadji Sfaxi, je te remercie du fond du cœur pour l’amitié et pour ton encouragement continu. J’avais le plaisir de travailler et discuter des idées avec toi. Pour tous les membres du laboratoire, vraiment vous êtes agréables. Haifa, Rym, Mouna, Sana, Feten, Ines, Nesrine, Souhir, Refka, Wafa et le fameux Mohamed. Je vous adresse toutes les expressions de considération et d’amitié. Merci beaucoup pour toutes les personnes qui m’ont aidé scientifiquement, amicalement ou même par les bonnes expressions de soutien moral. Je veux citer Sajiaa Keskes, Hassib Bouallagui, Eltaief Khelifi, Imène ben Dhifallah, Imène ben Abdelmalek, Sonia Belhadj Khlifa, Ines ben Rejab, Salma Khiari.... Je vous remercie tous. Un remerciement adressé à mes amies Aynur Ahmadova et Burçak Gökmen pour leur sympathie et pour leur aide dans la lecture de l’article et leurs remarques pertinentes. Une dédicace à tous mes étudiants à l’INSAT qui ont été agréables et ont montré beaucoup de sérieux et de rigueur, je les souhaite un bon avenir et bon courage.
Sommaire
INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………………................…1 I. Technologie d’expression des protéines recombinantes……………………………...…..............…..5 I.1. Généralités sur la production des protéines recombinantes…………………......……..............5 I.2. Biosynthèse et modifications post-traductionnelles des protéines………....….....................…..7 I.3. La glycosylation des protéines…………………………………...……………..................……..10 I.4. Les différents systèmes de production des protéines recombinantes........................................15 I.4.1. Les bactéries ..........................................................................................................................15 I.4.2. Les levures et les champignons.............................................................................................16 I.4.3. Les cellules de mammifères ..................................................................................................22 I.4.4. Les cellules d'insectes ............................................................................................................23 I.4.5. Production des protéines recombinantes chez les plantes transgéniques.........................24 I.4.5.1. Les techniques de transformation génétique des végétaux........................................26 a- Les méthodes directes ......................................................................................................26 b- Les méthodes indirectes ...................................................................................................26 I.4.5.2. Transformation génétique in planta ............................................................................29 I.5. Comparaison des différents systèmes d’expression des protéines recombinantes...................29 I.6. Etudes sur le repliement des protéines recombinantes ..............................................................34 I.6.1 Formation des corps d’inclusion............................................................................................34 I.6.2. Renaturation des protéines in vitro.......................................................................................36 I.6.3. Minimiser l’agrégation in vivo .............................................................................................37 I.6.4. Contrôle conformationnel des protéines .............................................................................39 I.7. La purification des protéines ........................................................................................................40 I.7.1. Démarche globale de purification des protéines recombinantes ......................................40 I.7.2. Chromatographie d’affinité .................................................................................................41 I.7.3. Chromatographie d’échange d’ions.....................................................................................42 I.7.4. Chromatographie d’exclusion/diffusion (Gel filtration) ....................................................43 I.8. L'évolution des protéines ..............................................................................................................44 II. Les Papillomavirus Humains ..............................................................................................................50 II.1. Généralités sur l’infection génitale à PVH.................................................................................51 II.2. Morphologie et structure des Papillomavirus ...........................................................................54 II.3. Les protéines virales du PVH......................................................................................................55 II.3.1. Les protéines précoces ........................................................................................................55 II.3.2. Les protéines tardives...........................................................................................................56 a- La protéine L1 .......................................................................................................................56 b- La protéine L2 ......................................................................................................................56 c- Assemblage de la capside des papillomavirus .....................................................................57 II.3.3. Classification des Papillomavirus .......................................................................................58 II.4. Mécanismes de l’infection par les Papillomavirus.....................................................................59 II.5. Du virus HPV au vaccin à VLP ..................................................................................................62 II.5.1. Principe du vaccin prophylactique ....................................................................................62 II.5.2. Comment développer une mémoire immunitaire?............................................................64 II.5.3. Points forts portant sur l’efficacité du vaccin ...................................................................67 II.6. Conclusion.....................................................................................................................................68 III. Les Nanobodies un nouveau concept dans l’ingénierie des anticorps............................................70 III.1. Introduction ................................................................................................................................70 III.2. Structure des VHH ou « Nanobodies » ....................................................................................71 III.3. Donc, c’est quoi les Nanobodies ?..............................................................................................73 III.4. Propriétés biochimiques et fonctionnelles des Nanobodies ....................................................75 III.5. Production des anticorps VHH recombinants .........................................................................76 III.6. Applications biotechnologiques et médicales des Nanobodies ...............................................80 MATERIEL ET METHODES MATERIEL I. Les systèmes d’expression et cellules hôtes..........................................................................................84 I.1. Le système Levure « Pichia pastoris » .......................................................................................84 I.2. Le vecteur d’expression pPICZαA.............................................................................................85
I.3. Le système plante ........................................................................................................................86 I.4. Vecteur binaire d’expression .....................................................................................................87 I.5. Les souches bactériennes ............................................................................................................88 II. Milieux de culture, solutions et produits de biologie moléculaire....................................................89 II.1. Milieu de culture des graines ...................................................................................................89 II.2. Les antibiotiques ........................................................................................................................89 II.3. Milieux de culture bactériens ...................................................................................................89 II.4. Milieux de culture pour Pichia pastoris ...................................................................................90 II.5. Solutions d’extraction d’ADN plasmidique par méthode de lyse alcaline............................91 II.6. Tampon de charge pour protéines ........................................................................................91 II.7. Gels de polyacrylamide pour PAGE-SDS................................................................................92 II.8. Solutions pour technique western blot ....................................................................................92 II.9. Enzymes et réactifs de biologie moléculaire ...........................................................................93 METHODES PARTIE I. UTILISATION DE LA PLANTE ARABIDOPSIS THALIANA COMME SYSTEME D’EXPRESSION DE LA PROTEINE L1 DE LA CAPSIDE DU HPV16 III.1. Stérilisation des graines d’Arabidopsis thaliana ....................................................................96 III.2. Germination des graines sur milieu MS ................................................................................96 III.3. Culture des plantes sur terreau ..............................................................................................96 III.4. Extraction d’ADN génomique de la plante Arabidopsis thaliana : Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)................................................................................................................97 III.5. Amplification du fragment spécifique du gène L1 de HPV16 (450pb) par PCR................97 III.6. Synthèse d’ADNc à partir des ARN totaux de plantes..........................................................98 III.6.1. Extraction des ARN totaux de plante Arabidopsis thaliana: SV Total RNA Isolation System (Promega)..........................................................................................................................98 III.6.2. Synthèse de l’ADNc par la Reverse Transcriptase........................................................98 III.7. Analyse des génomes des plantes Arabidopsis thaliana par Southern blot..........................99 III.8. Protocole d’extraction des protéines totales à partir de plante............................................99 PARTIE II. UTILISATION DE LA LEVURE PICHIA PASTORIS POUR L’EXPRESSION DE L’ANTICORPS VHH22 III.9. Extraction d’ADN plasmidique pPICZαA ..........................................................................100 III.9.1. Mini préparation par lyse alcaline................................................................................100 III.9.2. Mini préparation de plasmides utilisant un système de purification sur colonne de silice : QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen)........................................100 III.10. Amplification de l’ADNc du VHH22 par PCR utilisant des amorces spécifiques..........101 III.11. Purification de l’ADN sur colonne de silice à partir du gel d’agarose : MiniElute Gel Extraction (Qiagen)..........................................................................................................................101 III.12. Traitement enzymatique de l’ADN.....................................................................................102 III.12.1. Digestion du vecteur pPICZαA avec XbaI.................................................................102 III.12.2. Traitement du vecteur par la Phosphatase Alcaline CIP.........................................102 III.12.3. Digestion de l’ADNc par XbaI ....................................................................................103 III.13. Purification de l’ADN directement à partir des réactions enzymatiques : MiniElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen).......................................................................................................103 III.14. Ligation pPICZαA- Insert...................................................................................................104 III.15. Transformation des bactéries E. coli par les mélanges de ligation..................................104 III.16. Vérification du sens d’intégration de l’insert par digestion avec BlpI............................104 III.17. Protocole de transformation de Pichia pastoris par la méthode de choc thermique......104 III.18. Protocole d’extraction d’ADN génomique de levure : Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega)...............................................................................................................105 III.19. Protocole d’extraction d’ARN totaux à partir de cellules de Levure: RNeasy® Mini Kit (Qiagen)......................................................................................................................................106 III.20. Protocole de purification des protéines VHH22 (His6) par technique IMAC
(Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography)....................................................................107 III.21. Séparation des protéines sur gel d’acrylamide en conditions dénaturantes SDSPAGE.................................................................................................................................................109 III.21.1. Protocole de SDS-PAGE .............................................................................................109 III.21.2. Révélation au nitrate d’argent ...................................................................................110 III.22. Traitement de l’anticorps avec le Peptide N-Glycosidase F.............................................110 III.23. Technique western blot .......................................................................................................111 III.23.1. Transfert des protéines ...............................................................................................111 III.23.2. Fixation des anticorps..................................................................................................111 III.24. Test d’activité ELISA...........................................................................................................112 RESULTATS ET DISCUSSION PARTIE I. MISE AU POINT DE L’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DANS LE SYSTEME ARABIDOPSIS THALIANA Chapitre I : expression de la protéine capside L1 du papillomavirus humain de type 16 chez Arabidopsis thaliana Introduction ......................................................................................................................................116 Résultats & Discussion ....................................................................................................................119 1- Analyse de l’intégration et le nombre de copies du gène L1 dans le génome des plantes transgéniques...............................................................................................................................119 2- Synthèse de l’ADNc de L1 à partir des plantes transgéniques grâce à la RT-PCR.........120 3- Purification de la protéine recombinante et analyse par western blot .............................122 Conclusion ........................................................................................................................................123 ARTICLE 1.......................................................................................................................................125 Chapitre II : Analyse de l’expression et de la stabilité du transgène L1 chez de plantes transgéniques T2 d’Arabidopsis thaliana Introduction......................................................................................................................................137 Résultats & discussion ....................................................................................................................139 Conclusion ........................................................................................................................................140 ARTICLE 2.......................................................................................................................................141 PARTIE II. MISE AU POINT DE L’EXPRESSION D’UNE PROTEINE ANTICORPS RECOMBINANTE DE TYPE VHH DANS LE SYSTEME PICHIA PASTORIS Chapitre III : Clonage et expression d'un anticorps recombinant de type VHH chez la levure Pichia pastoris Introduction......................................................................................................................................144 Résultats & Discussion.....................................................................................................................147 1. Clonage de l’ADNc du VHH22 et transformation de la levure Pichia pastoris..............147 2. Analyse du génome des cellules P. pastoris transformées.................................................149 3. Analyse du transcriptome par RT-PCR.............................................................................151 4. Production de l’anticorps recombinant .............................................................................152 5. Analyse de l’activité de neutralisation de l’anticorps VHH22 glycosylé.........................155 Conclusion.........................................................................................................................................157 ARTICLE 3.......................................................................................................................................158 CONCLUSION GENERALE.................................................................................................................190 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...............................................................................................194
Introduction Générale Grâce aux avancées scientifiques spectaculaires des vingt dernières années en matière de génie génétique et de biologie moléculaire, il est aujourd'hui envisageable de modifier le patrimoine génétique d'un organisme vivant en lui incorporant un fragment d'ADN provenant d'une espèce différente, et de lui faire exprimer cette information génétique étrangère. Ces savoir-faire nouveaux de la génétique ont permis d'ouvrir des voies de recherche et de développement nouvelles aux perspectives considérables. Il devient alors possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces méthodologies, de reprogrammer le code génétique d'un organisme en lui insérant un gène précis, qui lui permettra de produire une protéine recombinante précieuse à usage médical ou industriel. Les biotechnologies ouvrent ainsi aujourd'hui des perspectives considérables pour le secteur de la santé. Les protéines recombinantes avec un intérêt thérapeutique occupent d'ailleurs une place primordiale dans le marché mondial des biotechnologies. Les protéines recombinantes d'intérêt thérapeutique sont le plus souvent des glycoprotéines, où la glycosylation joue un rôle essentiel dans leurs propriétés, notamment pharmacocinétiques. Toutefois, les différents systèmes d'expression de protéines utilisés ne permettent pas de reproduire le profil de glycosylation observé à la surface des protéines humaines, ce qui peut constituer un inconvénient à l'utilisation de la protéine dans une application thérapeutique chez l'Homme. La maîtrise de la glycosylation des protéines recombinantes reste un enjeu considérable pour le développement de tels systèmes de production. Les modifications (principalement glycosylation et formation des ponts disulfures) ne se produisent pas dans les bactéries. D'ailleurs, les oligosaccharides spécifiques attachés aux protéines par des enzymes de glycosylation sont dites tissu-spécifiques. Ces considérations limitent souvent le choix des cellules hôtes aux systèmes d’expression eucaryotes pour la production de protéine hétérologue. Les cellules hôtes utilisées pour la production de protéines recombinantes doivent répondre aux besoins des processus industriels de point de vue quantité et qualité. Cependant, la création des variétés de cellules recombinantes par des moyens conventionnels est un processus coûteux et parfois inefficace dû à l'imprévisibilité de l'expression du transgène par les cellules hôtes. Les méthodes exigées pour l’examen de ces variétés de cellule à haut pouvoir d’expression sont longues et chères. Il existe essentiellement cinq systèmes de production de molécules recombinantes : les bactéries, les levures, les cultures de cellules de mammifères, les animaux transgéniques et les ~1~
Introduction Générale plantes transgéniques. Les avantages reliés à la production de protéines d’intérêt commercial dans les bactéries sont la simplicité du transfert de gènes dans cet hôte et la facilité de générer rapidement un volume de production important. Par contre, les cellules bactériennes ne peuvent servir qu’à l’expression de molécules relativement simples, ne requérant pas de mécanismes de modification post-traductionnelle pour être actives, comme l’insuline, l’interféron ou l’hormone de croissance humaine, puisque ces mécanismes demeurent totalement absents chez les bactéries (Gomord et al., 2004b). Certains problèmes associés aux modifications post-traductionnelles des protéines peuvent être résolus par l’utilisation de cultures de levures (Capell et al., 2004). Par contre, l’activité de certaines molécules nécessite la présence d’un mécanisme de glycosylation similaire à celui retrouvé chez l’être humain pour assurer la fonctionnalité de ces protéines. Les systèmes animaux présentent l’avantage d’utiliser un mécanisme de glycosylation menant à l’obtention de produits identiques à la molécule d’origine (Daniell et al., 2001). Les cultures de cellules de mammifères, notamment les CHO, sont utilisées depuis des décennies pour produire la plupart des molécules recombinantes retrouvées sur le marché. Cependant, Morrow et al., 2001 estimaient que la capacité actuelle de production mondiale de cultures de cellules animales devait doubler afin d’atteindre les volumes requis uniquement pour la production des nouveaux anticorps développés. L’échéance est près d’être atteinte et la capacité de production globale des cultures de cellules de mammifères est encore loin de suffire (Gomord et al., 2004a). La plupart des anticorps recombinants actuellement approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) sont produits dans des cultures de cellules animales, telles que les CHO (Chinese Hamster Ovary). Cependant, considérant les quantités importantes d’anticorps nécessaires en immunothérapie, de l’ordre de deux à cinq grammes par patient par année, et la grande variété d’anticorps différents à produire, il est évident que les systèmes de culture de cellules animales ne peuvent suffire à la demande. En effet, l’obtention d’un rendement élevé dans un système possédant un mécanisme de glycosylation identique à l’être humain est possible par l’utilisation d’animaux transgéniques. Cependant, leur obtention est un processus extrêmement long et coûteux. De plus, la possibilité de produire une molécule recombinante contaminée par un pathogène humain endogène, tel un virus ou un prion, ou par une séquence d’ADN (acide désoxyribonucléique) oncogénique est toujours présente en utilisant un système animal (Capell et al., 2004).
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Introduction Générale Il s’avère donc indispensable que l’industrie des biopharmaceutiques se dote de systèmes de production alternatifs offrant une capacité de production importante au coût le plus bas, tout en permettant l’obtention d’un produit actif et sécuritaire (Daniell et al., 2001a). Les plantes transgéniques offrent une combinaison unique d’avantages par rapport aux autres modes de production. D’abord, la capacité de production de ce système est extrêmement élevée et peut facilement être ajustée à la demande. Ensuite, Twyman (Twyman et al., 2003) estime que les coûts de production reliés aux plantes transgéniques représentent entre 2 et 10% des coûts engendrés par l’utilisation de cultures de cellules de microorganismes en fermenteur et seulement 0,1% des coûts reliés aux CHO. Ainsi, les plantes transgéniques demeurent le mode de production le moins dispendieux. Des espèces de levure essentiellement Pichia pastoris sont particulièrement utilisées récemment par les industries pour la production d'enzymes extracellulaires. Des études ont donc été menées sur l'utilisation de ces organismes pour l'expression de protéines hétérologues. Les travaux présentés dans ce manuscrit ont été réalisés essentiellement au sein de l’Unité de Génie Biologique 99UR09-26 visant à développer des méthodes de base pour permettre la mise en place de la technologie de production des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique et industriel dans différents systèmes d’expression hétérologues principalement la levure Pichia pastoris et Arabidopsis thaliana. Chez ces deux systèmes, nous avons réussi à exprimer deux types de protéines d’intérêt thérapeutique : -
La protéine L1 de la capside du papillomavirus humain de type 16. Cette protéine ayant une forte capacité d’autoassemblage forme des particules virales non virulentes capables d’être utilisées comme des vaccins prophylactiques. Cette protéine a été exprimée avec succès chez la plante modèle dans la transgénèse végétale « Arabidopsis thaliana ».
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Un anticorps de type VHH dirigé contre la neurotoxine AahI’ du scorpion Androctonus australis hector a été exprimé chez la levure Pichia pastoris. Etant produit sous une nouvelle forme glycosylée, cet anticorps a montré plus d’efficacité vis-à-vis de la neurotoxine AahI’ considérée. Ce résultat présente une nouvelle solution pour le traitement sérologique des envenimations scorpionique avec plus de fiabilité.
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Synthèse Bibliographique
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
I. Technologie d’expression des protéines recombinantes :
Les protéines d'intérêt thérapeutique (enzymes, interférons, hormones…) étaient extraites de sources naturelles telles que le sang, le placenta ou d'autres tissus humains, voire même, dans certains cas, de tissus animaux. Toutefois, cette approche est limitée surtout par la quantité de tissus humains disponibles. Les protéines extraites à partir de telles sources présentent aussi des risques de contamination par des virus, notamment ceux du sida et de l'hépatite B, ou par des prions. Les protéines d'origine animale présentent également le risque de déclencher des réactions allergiques chez l'homme. L'avènement de la technologie de l'ADN recombinant dans les années 70, stimulée par la découverte d'outils permettant de couper (enzymes de restriction) et de lier (ligases) des fragments d'ADN (Linn et Arber 1968), accompagné de méthodes de séquençage de l'ADN (Maxam et Gilbert 1977 ; Sanger et al., 1977) a permis le développement de nouvelles approches de conception et de production de protéines, en utilisant divers systèmes d'expression. Les gènes gouvernant la synthèse des principales protéines humaines d'intérêt thérapeutique ont été identifiés et clonés, ce qui a permis une production de ces protéines en grandes quantités par des organismes hétérologues. Ces protéines recombinantes constituent alors une alternative de choix aux protéines naturelles. Aujourd'hui cette méthode est la plus utilisée pour produire des protéines d'intérêt thérapeutique. Par exemple, l'insuline, au départ isolée du pancréas de bœuf ou de porc, peut être maintenant produite, grâce à cette technologie, dans la bactérie Escherichia coli. La protéine ainsi obtenue est identique à la protéine humaine et est préparée à l'échelle industrielle, sans le risque que le produit final soit par exemple contaminé par les virus présents chez les mammifères. Cela a ainsi abouti à la commercialisation de l'insuline recombinante à intérêt thérapeutique par Eli Lilly en 1982 (Swartz, 2001). Aujourd'hui, l'insuline utilisée pour traiter le diabète provient presque exclusivement de bactéries ou de levures génétiquement modifiées. Les protéines recombinantes (d'intérêt thérapeutique ou alimentaire) sont produites à partir d'un transgène introduit dans un organisme hétérologue par génie génétique.
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Synthèse Bibliographique
I.1. Généralités sur la production des protéines recombinantes :
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
Au sens large, un système adapté à la production d'une protéine recombinante donnée, est
- l'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un virus) jouant le rôle de transporteur du gène codant pour la protéine d'intérêt, avec en amont du gène inséré une séquence de contrôle de la synthèse de la protéine (promoteur inductible), très utile lorsque le produit est toxique pour la cellule; - l'utilisation d'une cellule hôte ou d'un organisme complexe (bactéries, levures, insectes, plantes, animaux supérieurs), pour exécuter les instructions fournies par le transgène; - une phase de production proprement dite permettant de synthétiser les protéines souhaitées; - une phase de séparation et d'extraction de la protéine du milieu de culture ou du milieu intracellulaire, suivie de sa purification; - enfin, une phase de caractérisation/validation des propriétés biochimiques, biophysiques, et fonctionnelles de la molécule recombinante obtenue. Une vaste gamme de systèmes de production de protéines recombinantes est aujourd'hui disponible (Andersen et Krummen ; 2002), chacun d'eux présentant des avantages et des inconvénients. Avec une gamme de fonctions biologiques très large, les protéines sont communément utilisées de nos jours pour de multiples applications biotechnologiques ou médicales : - en recherche : enzymes isolées de microorganismes utilisées dans des techniques de biologie moléculaire (par exemple les enzymes de restriction ou les ADN polymérases); - dans l'industrie pharmaceutique: agents médicamenteux (hormone de croissance, facteur de coagulation, anticorps,…); - dans l'industrie agroalimentaire, dans les lessives. Parmi les protéines ayant des applications médicales produites sous forme recombinante, on peut citer l'insuline (traitement du diabète), le vaccin contre l'hépatite B, l'érythropoïétine (traitement de certaines formes d'anémies). D'autres procédés sont susceptibles de concurrencer ces systèmes de production de molécules à intérêt thérapeutique : - la synthèse chimique, incluant les hémisynthèses: celle-ci convient à la synthèse de peptides, avec une activité fonctionnelle équivalente aux protéines recombinantes; mais la synthèse chimique nécessite au préalable une connaissance des mécanismes d'action des protéines;
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Synthèse Bibliographique
un procédé biotechnologique qui s'appuie principalement sur :
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
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la thérapie génique: elle consiste à administrer un gène vectorisé (vecteur viral ou vecteur de
l'expérimentation clinique. Les protéines recombinantes actuellement commercialisées sont produites majoritairement par les systèmes bactériens, levures ou cellules de mammifères. De nombreuses sociétés travaillent notamment au niveau des essais cliniques sur des protéines recombinantes produites par des animaux ou des plantes transgéniques. Toutefois, à ce jour aucun de ces produits n'a achevé son développement clinique. Actuellement, le nombre de molécules recombinantes en cours d'étude clinique s'élève à plusieurs centaines.
I.2. Biosynthèse et modifications post-traductionnelles des protéines : Les protéines sont des constituants extrêmement importants des cellules vivantes, tant d'un point de vue quantitatif (puisqu'elles représentent en général plus de la moitié du poids sec des cellules), que du point de vue qualitatif. A côté des protéines dites structurales on trouve des protéines ayant un rôle biologique capital, en particulier les enzymes, catalyseurs biologiques indispensables au déroulement des réactions dans les cellules des organismes vivants.
Figure 1. Rôles biologiques des protéines dans un organisme vivant
Certaines protéines stockent et transportent une grande variété de particules et de molécules comme des électrons, des cations métalliques, de l'oxygène... En tant qu'hormones, les protéines
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Synthèse Bibliographique
synthèse) plutôt qu'une protéine; cependant, cette thérapie se situe encore au stade de
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
transmettent chez les organismes complexes l'information entre des cellules spécifiques et les
potentiels tels que les bactéries ou les virus, repose sur les propriétés de différentes protéines ancrées à la surface des cellules ou bien circulantes (les plus connues sont les anticorps), qui participent à la reconnaissance et à l'élimination de ces corps étrangers. D'autres protéines jouent un rôle dans le contrôle de l'expression des gènes en se liant à des séquences spécifiques d'acides nucléiques, régulant ainsi la transcription/traduction du gène impliqué. Elles sont aussi les composantes cruciales des muscles et d'autres systèmes qui assurent la conversion de l'énergie chimique en énergie mécanique. Finalement, de nombreuses protéines sont "simplement" structurales, impliquées dans l'architecture des cellules ou d'autres matériaux présents dans les cheveux, les ongles, les tendons ou les os. Malgré leurs fonctions biologiques très différentes, les protéines constituent une classe relativement homogène de molécules, à savoir un polymère linéaire construit à partir de combinaisons variées des mêmes 20 acides aminés. Ces macromolécules diffèrent seulement dans l'enchaînement de ces unités. Les protéines naturelles possèdent une taille et une séquence d'acides aminés qui leur sont propres, conformément à l'information stockée dans le génome. Leur diversité fonctionnelle repose en partie sur la diversité des caractéristiques chimiques de leurs acides aminés constitutifs, mais principalement sur la diversité de structures tridimensionnelles que l'enchaînement de ces derniers peut former. La biosynthèse des protéines dans les cellules eucaryotes s'effectue à partir de l'information génétique contenue dans l'ADN. Le code génétique est la clé qui permet le passage de la séquence d'acides nucléiques à la séquence d'acides aminés. Dans une phase de maturation, les protéines subissent d'abondantes modifications covalentes pendant et après leur synthèse sur le ribosome. Ces modifications co et posttraductionnelles par la suite résumées sous le terme "modifications post-traductionnelles" peuvent notamment servir en plusieurs niveaux à la régulation de l'activité des protéines; leur étiquetage pour une reconnaissance par des partenaires métaboliques ou par des systèmes de dégradation; leur ancrage dans une membrane; la participation à des cascades de signalisation; leur adressage pour qu'elles se rendent au bon endroit dans la cellule; à définir une identité immunologique (comme les groupes sanguins,…), etc.…
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Synthèse Bibliographique
organes. Notre système immunitaire, qui nous protège contre une variété d'agents pathogènes
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
Les informations relatives à ces modifications ne sont pas portées par les acides
hôte de complexes enzymatiques, et parfois de systèmes membranaires. Les modifications post-traductionnelles des protéines permettent une meilleure adaptation de la protéine à sa fonction. Il existe différents types de modifications post-traductionnelles. Le tableau 1 présente une liste partielle de celles que l'on peut rencontrer dans une protéine. Cela peut être l'ajout/retrait de groupements divers, l'acylation (ajout d'acides gras divers), l'ajout/retrait de glucides (simples ou complexes) ou de polypeptides...
Tableau 1. Exemples de modifications post-traductionnelles des protéines. La découverte, le développement, la production et les applications cliniques des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique chez l'Homme constituent un domaine de recherches scientifiques et médicales en plein essor. Cela a engendré un considérable intérêt dans l'étude des implications biologiques et thérapeutiques des modifications post-traductionnelles des protéines,
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Synthèse Bibliographique
nucléiques, mais dépendent de la nature de la séquence protéique, de la présence dans la cellule
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en particulier la glycosylation, sans doute la modification la plus sophistiquée. Dès lors, de
I.3. La glycosylation des protéines : De très nombreuses protéines, dotées ou non d'une fonction enzymatique, sont des glycoprotéines, et la présence de glucides liés à la chaîne polypeptidique accroît encore leur diversité. La plupart des glycoprotéines sont typiquement des protéines sécrétées à l'extérieur des cellules (enzymes, hormones, transporteurs, anticorps,…), des protéines localisées à la surface cellulaire ou dans la membrane plasmique. Elles sont très largement répandues dans les tissus animaux et végétaux, et également présentes chez les micro-organismes et les virus (Spiro 2002). La glycosylation des protéines est l'une des modifications post-traductionnelles les plus courantes puisque l'on estime que près de 50% des protéines produites par la cellule seraient glycosylées (Apweiler et al., 1999). Depuis la description de la liaison GlcNAc (β1-Ν)-Asn dans l'ovalbumine par Johansen et al. en 1961, de nombreuses autres liaisons sucre-protéine ont été décrites (Figure 2). 13 monosaccharides et 8 acides aminés différents participent à la formation des liaisons sucreprotéine. Sur la base de la liaison formée entre les parties peptidique et glycanique, on distingue différents types de glycosylation (Figure 2) : - les liaisons N-glycosidiques, principalement sur les chaînes latérales de l'asparagine; - les liaisons O-glycosidiques, sur les hydroxyles des chaînes latérales de la sérine, thréonine, ou d'acides aminés modifiés comme l'hydroxylysine (Hyl) et l'hydroxyproline (Hyp); - les liaisons C-glycosidiques (C-mannosylation); - les liaisons P-glycosidiques via un pont phosphodiester; - la liaison entre l'ancre GPI et l'extrémité C-terminale de la protéine. Les principaux types de glycosylation restent la N- et l’O-glycosylation. Une même protéine peut porter à la fois des structures N- et O-glycaniques. La glycosylation s'effectue en des positions déterminées de la séquence, en nombre et en structure très variables d'une protéine à l'autre. Ainsi, une même protéine peut exister sous plusieurs isoformes ou "glycoformes" (Rademacher et al., 1998) qui diffèrent seulement par leur composition en glycanes : on parle de macro- et de micro-hétérogénéité de la protéine (Cunningham et al., 1996).
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Synthèse Bibliographique
nombreuses études sont apparues dans la littérature (Kobata 1992).
Synthèse Bibliographique
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Figure 2. Représentation des 5 types de glycosylation connus des protéines (Spiro 2002). Abréviations : Ara, L-arabinose; DiAcTridH, DiActridésoxyhexose; Fuc, LFucose; FucNAc, Nacétyl-L-Fucosamine; Gal, D-Galactose; GalNAc, N-acétyl-DGalactosamine; Glc, D-Glucose; GlcNAc, N-acétyl-D-Glucosamine; Man, DMannose; P, Phosphate; Pse, acide α-Pseudaminique; Rha, L-Rhamnose; Xyl, DXylose. Les deux configurations α et β peuvent être trouvées. Dans les glycoprotéines courantes les glycanes sont répartis en courtes chaînes renfermant des unités caractéristiques qui constituent la base des communications entre cellules, entre cellules et certaines hormones, entre cellules et particules virales, … Les structures des glycanes à la surface des protéines sont très variées car elles sont spécifiques de chaque type cellulaire. Toutefois, les glycanes présentent des caractères communs. Par exemple, quelle que soit leur origine, les glycanes dits de type mucine possèdent tous le "noyau" GalNAc (α1-Ο)-Ser/Thr, et les glycanes des N-glycoprotéines contiennent tous le même "noyau" pentasaccharidique :
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Sur ces noyaux se greffent des structures oligosaccharidiques spécifiques que l'on appelle
Les protéines sont glycosylées d'une manière spécifique, déterminée notamment par leur cheminement à travers l'appareil de Golgi, où la phase essentielle des N- et O-glycosylations est effectuée. Cette modification est catalysée principalement par les enzymes de la famille des glycosyltransférases. La localisation cellulaire ordonnée et l'activité des enzymes impliquées dans la glycosylation définissent la séquence et la structure des glycanes associés à la protéine. A ce stade, la N- et la O-glycosylation sont traitées séparément du fait des différences existant dans la biosynthèse et les structures des glycanes. La N-glycosylation par exemple, schématisée ci-dessous, débute dans le réticulum endoplasmique (elle est donc en cela co-traductionnelle) mais elle se poursuit dans l'appareil de Golgi où la maturation des N-glycanes de la protéine a lieu ; elle est donc également posttraductionnelle (Hubbard et Ivatt 1981). Les N-glycanes sont tout d'abord synthétisés sous la forme d'un précurseur oligosaccharidique lié par un groupement pyrophosphate à un lipide particulier, le dolichol au niveau du réticulum endoplasmique (Abeijon et Hirschberg 1992). Le dolichol est une longue chaîne hydrocarbonée (75-105 atomes de carbone), de structure polyisoprénique, capable de traverser plusieurs fois la membrane du réticulum endoplasmique. Le résidu asparagine, site de la N-glycosylation, est situé dans une séquence particulière reconnue par le complexe OST. Cette séquence consensus (ou séquon) est constituée du tripeptide Asn-X-Ser/Thr, où X peut être n'importe quel acide aminé excepté la proline (Gavel et Von Heijne 1990) (ce dernier ne peut d'ailleurs pas être présent immédiatement après la séquence du tripeptide). Toutefois, même si la glycosylation a lieu dans le réticulum endoplasmique sur une chaîne naissante d'une protéine, la structure primaire du polypeptide n'est pas le seul facteur déterminant de la N-glycosylation de la protéine car des résidus asparagine situés dans une séquence consensus et qui entrent dans le réticulum endoplasmique ne sont pas nécessairement glycosylés. Chez les mammifères, la maturation des N-glycoprotéines dans l'appareil de Golgi conduit à la synthèse de trois principaux types d'oligosaccharides: -
les N-glycanes de type oligomannosidique;
-
les N-glycanes de type hybride;
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Synthèse Bibliographique
"antennes".
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les N-glycanes de type complexe (ou type N-acétyllactosamine).
Synthèse Bibliographique
-
Figure 3. Biosynthèse des N-glycoprotéines (Sears et Wong 1998)
La synthèse de ces trois types de N-glycanes est finement régulée par l'action (voire la compétition) de glycoside hydrolases et de glycosyltransférases. Mis à part le noyau chitobiosyle GlcNAc (β1-4) GlcNAc, les N-glycanes de type oligomannosidique contiennent presque uniquement des résidus mannose, liés entre eux par une grande variété de liaisons glycosidiques. Les N-glycanes de type complexe contiennent en plus du noyau pentasaccharidique commun à toutes les N-glycoprotéines, des résidus galactose et N-acétylglucosamine et peuvent posséder à leurs extrémités des résidus galactose, N-acétylgalactosamine, fucose et/ou des acides sialiques. Ces N-glycanes peuvent exister sous la forme de structures bi-, tri-, tétra- ou penta-antennées.
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Les N-glycanes de type hybride possèdent généralement les caractéristiques des N-glycanes de
branche Man (α1-3). Plusieurs sites de N-glycosylation sur la même protéine peuvent être glycosylés de manière différente. La séquence peptidique, mais surtout la conformation de la protéine, peut influer sur les différentes étapes réticulaires et golgiennes de la N-glycosylation en favorisant ou non l'accessibilité du substrat aux différentes glycosyltransférases. Le type de cellule ainsi que l'état physiologique de la cellule ont une influence sur la glycosylation (Goochee et Monica 1990). D'autres facteurs incluant le métabolisme des nucléotides-sucres, leur transport dans le réticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi, la localisation et le taux d'expression des différentes glycosyltransférases contribuent probablement à l'hétérogénéité des structures glycaniques observées dans les N-glycoprotéines. Les résidus glycaniques à la surface des protéines peuvent également être liés par une liaison de type O-glycosidique à la chaîne latérale d'acides aminés tels que la sérine ou la thréonine (Van den Steen et al., 1998). Dans le cas du collagène, on peut trouver également des O-glycanes liés à la chaîne latérale de l'hydroxylysine ou de l'hydroxyproline. Les liaisons O-glycosidiques sont diverses par leur structure, et sont caractérisées par leur fragilité en milieu alcalin. La N-acétylgalactosamine liée en α à la thréonine est une situation fréquente, mais ce n'est pas la seule. On la trouve par exemple dans les protéines des groupes sanguins, des globulines plasmatiques, dans les glycoprotéines membranaires. Chez les levures et les champignons, c'est souvent le mannose qui est lié à la sérine ou la thréonine. Chez les plantes, l'arabinose est souvent lié à l'hydroxyproline par une liaison plus résistante à l'hydrolyse alcaline que les liaisons O-glycosidiques communes. Les O-glycanes ne sont pas aussi faciles à classer que les N-glycanes, du fait de leur très grande variété. En effet, les structures liées aux protéines peuvent être aussi simples qu'un monosaccharide (par exemple le glucose ou la N-acétylglucosamine) ou peuvent contenir plusieurs monosaccharides. Les structures glucidiques des groupes sanguins sont un exemple d’O-glycanes. Ces derniers peuvent être des oligosaccharides riches en galactose et en Nacétylgalactosamine, où le fucose et l'acide sialique occupent des positions terminales. La Oglycosylation de type mucine reste l'une des plus courantes et donc des plus étudiées.
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Synthèse Bibliographique
type oligomannosidique sur la branche Man (α1-6) et des N-glycanes de type complexe sur la
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I.4. Les différents systèmes de production des protéines recombinantes:
La bactérie Escherichia coli fut et reste encore le premier hôte utilisé pour l'obtention de protéines recombinantes (Swartz, 2001; Andersen et Krummen 2002; Baneyx 1999). La génétique de cette bactérie est tout d'abord très bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont été construits et sont donc disponibles afin d'insérer et d'exprimer un gène étranger au sein de la bactérie. De nombreuses souches ont été améliorées afin d'optimiser l'expression de la protéine d'intérêt. Cette bactérie est facilement manipulable et se prête très bien à la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont élevés (jusqu'à plusieurs grammes de protéine par litre de culture). Toutefois, la protéine synthétisée est souvent toxique pour la bactérie, empêchant d'atteindre des cultures cellulaires de haute densité. Une alternative peut être d'effectuer la production de la protéine en deux étapes : une phase de croissance de la biomasse puis une phase d'induction de la biosynthèse par ajout de l'inducteur du promoteur inséré en amont du gène d’intérêt. D'autre part, il est souvent nécessaire de lyser la bactérie afin de récupérer la protéine qui est généralement peu ou pas sécrétée (ce qui induit des problèmes de purification, ou de solubilisation et de renaturation…, quelquefois au détriment des rendements). L'inconvénient majeur à son utilisation vient surtout du fait que E. coli n'effectue pas de modifications post-traductionnelles caractéristiques des protéines humaines (en particulier la glycosylation, la carboxylation,…) car les enzymes responsables de ces modifications ne sont pas présentes naturellement dans la bactérie. Cela peut conduire au rejet des protéines d'intérêt thérapeutique par le système immunitaire, réduire leur durée de vie dans l'organisme voire leur activité biologique. La protéine produite peut notamment ne pas être correctement repliée. Enfin E. coli étant une entérobactérie, il est nécessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protéines purifiées. D'autres systèmes de production bactériens se développent également aujourd'hui: Bacillus subtilis, Streptomyces…. Ceux-ci possèdent des capacités de sécrétion supérieures à E. coli. Cependant, leur génétique est souvent moins connue, et le niveau de production de protéines recombinantes reste dans la plupart des cas inférieur à celui obtenu avec E. coli. L'utilisation d'extraits d'E. coli in vitro est également une option qui est envisagée.
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Synthèse Bibliographique
I.4.1. Les bactéries :
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Pour pallier les limitations du système bactérien, l'utilisation d'autres organismes producteurs
d'insectes, voir de plantes ou de mammifères a été développée.
I.4.2. Les levures et les champignons : Les levures offrent les mêmes facilités expérimentales ou industrielles que les bactéries, en particulier une culture aisée en fermenteurs à haute densité cellulaire, tout en possédant une machinerie cellulaire proche de celle d'une cellule humaine. La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae est utilisée depuis des millénaires dans l'alimentation humaine. Des exemples de protéines recombinantes produites chez cet organisme sont l'antigène de surface du virus de l'hépatite B, l'insuline ou l'hirudine. Le matériel génétique de cette levure est simple et elle ne présente aucune toxicité. De bons vecteurs d'expression (nombre de copies et stabilité) sont disponibles aujourd'hui. Les taux d'expression des protéines sont relativement élevés (de l'ordre de la centaine de milligrammes par litre de culture). La levure permet la production de protéines complexes et la réalisation de modifications
post-traductionnelles
(glycosylations
simples,
carboxylations,
acylations,
formation des ponts disulfures, rupture protéolytique…). Néanmoins, les protéines synthétisées sont généralement localisées à l'intérieur du cytoplasme et une étape de lyse de la cellule est nécessaire afin de les récupérer. La sécrétion est possible, mais en général au détriment des rendements: elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour des protéines de masse moléculaire élevée. D'autre part, la présence de protéases actives entraîne la dégradation des protéines hétérologues exprimées, réduisant ainsi les rendements. Chez la levure Pichia pastoris (Cereghino et al., 2002), la surexpression des protéines est bien régulée. De hautes densités cellulaires peuvent être atteintes et la sécrétion est efficace. La fermentation de cet organisme est donc bon marché. Toutefois, les protéines peuvent être dégradées et la croissance des cellules est lente. D'autres levures sont également utilisées: Kluyveromyces lactis (production de la chymosine, enzyme alimentaire), Hanseluna polymorpha, Yarrowia lipolytica (production d'interféron-α)… Les champignons filamenteux sont des sécréteurs naturels d'un certain nombre de glycoprotéines (principalement des enzymes), souvent en quantités abondantes, et sont capables de se
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Synthèse Bibliographique
non-bactériens comme les levures ou les champignons, puis de cellules de mammifères ou
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développer sur des milieux relativement peu coûteux. Des espèces tels que Aspergillus niger,
par les industries alimentaire et papetière pour la production d'enzymes extracellulaires. Des études ont donc été menées sur l'utilisation de ces organismes pour l'expression de protéines hétérologues (Maras et al., 1999). Les levures et champignons filamenteux produisent typiquement des glycanes de type oligomannosidique, en ajoutant jusqu'à 100 résidus mannose (dans le cas des levures) au niveau du noyau penta-saccharidique (hyperglycosylation) (Tanner et Lehle 1987 ; Herscovics et Orlean 1993). Cette hypermannosylation peut engendrer parfois une immunogénicité de la protéine chez l'homme. Chez les levures, le taux de glycosylation effectué par Pichia pastoris est plus faible (chaînes plus courtes) que chez S. cerevisiae (Hamilton et al., 2003). De leur côté, les champignons filamenteux synthétisent le plus souvent des
glycanes contenant un nombre
relativement faible de résidus mannose (par comparaison avec les levures). Jusqu'à maintenant, aucun oligosaccharide de type complexe contenant des acides sialiques, du galactose, du fucose et de la N-acétylgalactosamine n'a été trouvé dans les glycoprotéines produites chez ces organismes. Le processus de N-glycosylation des protéines chez les levures et les champignons filamenteux est semblable dans les étapes initiales au niveau du réticulum endoplasmique à celui des mammifères, mais diffère de celui de l'homme au niveau de la maturation dans l'appareil de Golgi. Utilisation de la levure Pichia pastoris comme système d’expression hétérologue: Les levures offrent les mêmes facilités expérimentales ou industrielles que les bactéries, en particulier une culture aisée en fermenteurs à haute densité cellulaire, tout en possédant une machinerie cellulaire proche de celle d'une cellule humaine. La levure permet la production de protéines complexes et la réalisation de modifications posttraductionnelles (glycosylations simples, carboxylations, acylations, formation des ponts disulfures, rupture protéolytique…). Néanmoins, les protéines synthétisées sont généralement localisées à l'intérieur du cytoplasme et une étape de lyse de la cellule est nécessaire afin de les récupérer. La sécrétion est possible, mais
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Synthèse Bibliographique
Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae ou Trichoderma reesei sont particulièrement utilisées
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en général au détriment des rendements: elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels
D'autre part, la présence de protéases actives entraîne la dégradation des protéines hétérologues exprimées, réduisant ainsi les rendements. Chez la levure Pichia pastoris, la surexpression des protéines est bien régulée (Cereghino et al., 2002). De hautes densités cellulaires peuvent être atteintes et la sécrétion est efficace. La fermentation de cet organisme est donc bon marché. Le processus de N-glycosylation des protéines chez les levures, comme chez les champignons filamenteux, est semblable dans les étapes initiales au niveau du réticulum endoplasmique à celui des mammifères, mais diffère de celui de l'homme au niveau de la maturation dans l'appareil de Golgi. Jusqu'à maintenant, aucun oligosaccharide de type complexe contenant des acides sialiques, du galactose, du fucose et de la N-acétylgalactosamine n'a été trouvé dans les glycoprotéines produites chez ces organismes. La levure Pichia pastoris est un système performant de production d’une large gamme de protéines hétérologues. Plusieurs facteurs ont rendu son acceptation très rapide dans ce domaine, les plus importants sont ; (1) le promoteur puissant dérivant du gène de l’alcool oxydase I (AOXI) de Pichia pastoris comme seule élément de contrôle de l’expression des gènes exogènes, (2) la grande performance de cette levure à la respiration pendant la culture, ce qui représente un avantage physiologique qui facilite sa culture à haute densité relative à la fermentation des levures et (3) la décision de Phillips Petroleum en 1993 de la compagnie de Bartlesville Okla approuvée par RCT (Research Corporation Technologies) de rendre la levure Pichia pastoris un système d’expression dans les laboratoires de recherche universitaires, ce qui avait pour conséquence de savoir plus les bases du système comme était décrit dans différentes publications récentes. Les plasmides conçus pour l'expression de protéines recombinantes chez P. pastoris présentent plusieurs caractéristiques communes. La cassette d'expression comprend le gène de l’alcool oxydase comprenant ayant le promoteur puissant inductible AOX1, suivi d'un ou plusieurs sites uniques de restriction pour l'insertion du gène étranger, un élément de terminaison de transcription qui dirige le traitement efficace de la polyadénylation en 3' des ARNm.
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Synthèse Bibliographique
que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour des protéines de masse moléculaire élevée.
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Comme pour Saccharomyces cerevisiae, l'ADN linéaire produit des transformants stables de
homologues dans le génome (Cregg et al., 1985 ; Cregg et al., 1989). De tels intégrants montrent une stabilité extrême en l'absence de pression sélective même lors d’intégration en copies multiples. Notez que l’événement de simple crossing over (insertions) est beaucoup plus effectué que l’événement double (remplacements). Les événements d'insertion au niveau des loci AOX1 (X-33 ou GS115) ou aox1::ARG4 (KM71H) résultent d'un événement de recombinaison homologue simple entre les loci et l’un des deux régions AOX1 du vecteur pPICZ ou pPICZα : le promoteur de AOX1 ou bien la région de terminaison de transcription (TT). Cependant, les insertions multiples se produisent spontanément à environ 1-10% des événements simples d'insertion. Le phénotype d'un tel transformant est Mut+ (X-33 ou GS115) ou MutS (KM71H). La linéarisation du vecteur recombinant avec une enzyme de restriction dont le site est situé dans la région 5´AOX1, donne naissance à des transformants Mut+ ou MutS selon la souche Pichia utilisée. L’intégration de la cassette d’expression au niveau du génome de la levure P. pastoris se réalise souvent par recombinaison homologue au niveau des régions 5’AOXI (Mut+) et le gain de pAOX1, le gène d'intérêt, et le gène de résistance à la zéocine. Ceci se produit également avec le plasmide non linéarisé mais à une fréquence inférieure.
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Synthèse Bibliographique
cellules Pichia pastoris par phénomène de recombinaison homologue entre les régions
Synthèse Bibliographique
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Figure 4. Evénement d’insertion de la cassette d’expression dans le génome de Pichia pastoris Dans certains cas le phénomène de recombinaison s’effectue au niveau des deux régions 5’ et 3’ AOXI ce qui provoque le remplacement du gène AOXI en sa totalité. Pour une expression extracellulaire des protéines recombinantes, on peut distinguer des vecteurs d’expression ayant une séquence codante pour un peptide signal attaché à l’extrémité Nterminale de la protéine exprimée. Ce peptide est le facteur α de Saccharomyces cerevisiae composé de 72 acides aminés et comprenant à la fin un site de clivage reconnu par la protéase Kex2. Certaines souches de Pichia pastoris (y compris X33) produisent naturellement la protéase Kex2. La protéine destinée pour une expression extracellulaire sera mise à l’action de la Kex2 au niveau de l’appareil de Golgi le moment de son adressage vers le milieu extracellulaire. Une autre caractéristique de la levure Pichia pastoris comme étant un système performant d’expression des protéines recombinantes c’est l’augmentation du taux d’expression extracellulaire dans le cas où la protéine exprimée est N-glycosylée. En effet, Sagt et al., (2000) ont montré que l’introduction d’un site de N-glycosylation au niveau de la séquence de la protéine recombinante exprimée augmente son taux de sécrétion extracellulaire.
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TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
Ces vecteurs contiennent également un site multiple de clonage (SMC) avec plusieurs sites protéines recombinantes étiquetées en C-terminal. Dans ce cas l’identification et la purification de la protéine exprimée sera plus aisée. En cas d’obtention de copies multiples de la cassette d'expression on peut réaliser des digestions/ligations au niveau des sites BamHI/BglII présents sur les vecteurs adoptés.
Le
processus de l'addition est répété jusqu'à six à huit copies d'une cassette dans un même vecteur qui est ensuite utilisé pour transformer P. pastoris. Les vecteurs contenant un promoteur constitutif de P. Pastoris dérivé du gène de glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) sont aussi disponibles. Le promoteur de GAP est une alternative commode au promoteur AOX1 pour l'expression des gènes dont les produits ne sont pas toxiques pour P. pastoris et évite l’utilisation du méthanol qui peut être parfois problématique. La levure P. pastoris possède le pouvoir d'effectuer plusieurs modifications post traductionnelles typiquement liées aux eucaryotes supérieurs. Ceci inclus l’utilisation des peptides signal (pré et prépro-type), le repliement, la formation de ponts disulfures, et la N- et O-glycosylation. Par contre, les types de résidus de sucre ajoutés chez les eucaryotes inférieurs, y compris P. pastoris, ajoutent des O-oligosaccharides composés seulement de résidus mannose (Man). Le nombre de résidus Man par chaîne, leur façon de linkage, ainsi la fréquence et spécificité d'O-glycosylation ne sont pas encore déterminés. Plusieurs façons efficaces de manipulation du système de glycosylation de Pichia in vivo sont récemment découvertes. Citant par exemple la délétion des gènes de glycosylation chez les levures et leur remplacement par des des gènes de glycosylation humains. Il existe aussi des vecteurs d’expression (série des GlycoSwitch) qui favorisent la synthèse de petits glycans de type uniforme liés à l’Asn sur n'importe quelle glycoprotéine d'intérêt. Les glycans en résultant sont principalement Man8GlcNAc2 (GlycoSwitch-M8), Man5GlcNAc2 (GlycoSwitch-M5),
GlcNAcMan5GlcNAc2
(GlycoSwitch-M5Gn)
ou
bien
GalGlcNAcMan5GlcNAc2 (GlycoSwitch-M5GnGal). Ces glycans ont la même structure que ceux intermédiaires de la voie de N-glycosylation chez les mammifères.
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Synthèse Bibliographique
uniques de restriction pour l'insertion de gènes avec épitope 6His et myc afin d’obtenir des
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
I.4.3. Les cellules de mammifères :
B, l'hormone de croissance humaine, l'interleukine-2, l'interféron-β, l'érythropoïétine ou des facteurs de coagulation… Parmi les cellules de mammifères les plus utilisées, on peut citer les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) et BHK (Baby Hamster Kidney). Les cellules CHO se prêtent très bien à la culture de masse en bioréacteur. Un avantage important de ces cellules réside dans leur capacité à synthétiser des protéines complexes (glycosylées) de masse moléculaire élevée. Certains vecteurs d'expression permettent d'introduire et de faire exprimer des gènes humains. Toutefois les rendements sont faibles (de l'ordre de 10 mg de protéines par litre de culture au maximum). En outre les cellules CHO s'avèrent fragiles et leur culture plus onéreuse. D'autres systèmes tels que les cellules NS0 (murine myeloma) ou les cellules humaines (HeLa) (Human cervical carcinoma), Jurkat (Human lymphocyte)… sont également étudiés dans le but d'y produire des protéines recombinantes. L'équipement des cellules de mammifères les plus couramment utilisées (CHO et BHK) en enzymes impliquées dans la synthèse et le transport des nucléotides-sucres, ainsi qu'en glycosyltransférases, apparaît suffisant pour garantir une glycosylation des protéines recombinantes de type complexe avec un haut degré de sialylation α 2-3. Toutefois, ces systèmes manquent d'enzymes telles que les α 1,3/4-fucosyltransférases ou les α 2,6- sialyltransférases, qui transfèrent des motifs glycosidiques caractéristiques en position terminale des N-glycanes des tissus humains. Chez la souris, la présence de résidus tels que l'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sur les N-glycanes, dérivé de Neu5Ac potentiellement immunogénique, est une limitation à l'utilisation de ces cellules pour l'expression de protéines recombinantes. Une autre voie consiste aujourd'hui à utiliser des bioréacteurs vivants en tant que système de production de protéines recombinantes. Il s'agit ici d'animaux vivants transgéniques (lapine, chèvre, brebis, vache) produisant dans leur lait, leur sang, leur urine ou même leur sperme, une protéine humaine. Différentes techniques de transgénèse sont utilisées : micro-injection dans les pronuclei ou dans le cytoplasme de l'embryon, vecteurs rétroviraux... Les animaux transgéniques peuvent être utilisés afin de produire des protéines hétérologues: production du facteur IX de la coagulation
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Synthèse Bibliographique
Les cellules de mammifères ont permis de produire entre autres l'antigène du virus de l'hépatite
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dans le lait de brebis transgénique, de lactoferrine humaine obtenue dans le lait de vache produite dans le sang de porc… L'intérêt d'une production de protéines recombinantes dans le lait ou le sang d'animaux transgéniques se heurte cependant à des niveaux d'investissements très lourds et à des problèmes éthiques.
I.4.4. Les cellules d'insectes : L'expression de protéines recombinantes dans les cellules d'insectes (Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni par exemple) (Altmann et al., 1999) est possible via l'utilisation de vecteurs d'expression développés à partir des Baculovirus pour l'infection des cellules. Ce système présente l'avantage de permettre une bonne expression de la protéine, même si ensuite les rendements finaux restent faibles par rapport à ceux obtenus avec les bactéries ou les levures mais bien meilleurs que ceux obtenus avec les cellules de mammifères. Les protéines peuvent être obtenues correctement repliées. Les cellules d'insectes cultivées en suspension, sont capables de sécréter la protéine recombinante et d'effectuer des opérations posttraductionnelles (similaires à celles effectuées dans les cellules de mammifères), notamment la glycosylation de la protéine. Le coût de production, même s'il est plus important que pour des systèmes d'expression dans des bactéries ou des levures, reste plus abordable que la production dans des cellules de mammifères. Toutefois, il est difficile de travailler avec ce système sensible. Il présente l'inconvénient d'être un système lytique, avec une protéolyse possible de la protéine cible, limitant ainsi les rendements. La glycosylation dans les cellules d'insectes conduit à des structures glycaniques proches des structures d'origine humaine (type complexe) mais elle reste tout de même incomplète (types oligomannosidique et hybride), avec l'absence ou le très faible niveau de galactosyltransférases et de sialyltransférases dans les cellules. L'incapacité des cellules d'insectes à synthétiser une forme d'acide sialique reste un sujet de controverse (Marchal et al., 2001). Dans certaines lignées d'insectes, il est possible de trouver des résidus Fuc (α1-3) qui s'avèrent être immunogènes chez l'homme, limitant l'utilisation de ce système pour la production de protéines thérapeutiques. Enfin, la présence d'une activité N-acétylglucosaminidase indésirable a été détectée dans ces cellules.
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Synthèse Bibliographique
transgénique, d'hormone de croissance humaine dans le lait de souris, d'hémoglobine humaine
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Les industriels misent de plus en plus sur les plantes pour produire des protéines recombinantes, car elles présentent de nombreux avantages (Giddings et al., 2000 ; Larrick et Thomas 2001 ; Fischer et al., 2004). Les cellules végétales étant des cellules eucaryotes, elles disposent d'une machinerie cellulaire complexe et sophistiquée qui leur permet de produire des protéines ayant des propriétés thérapeutiques équivalentes aux protéines humaines. Les différentes plantes utilisées peuvent être : Arabidopsis thaliana, le tabac, la luzerne, le colza, le maïs, le carthame, le soja, le riz ou la pomme de terre. Le feuillage ou la graine sont les cibles préférentielles de l'expression du transgène. La mise au point de plantes transgéniques à partir de végétaux permet de produire une variété de protéines recombinantes précieuses ("moléculture") : interféron, interleukine, facteur VIII de la coagulation, hirudine, anticorps ("planticorps")… Les cellules végétales transformées peuvent être multipliées in vitro dans des bioréacteurs, mais elles sont de plus en plus cultivées dans des conditions qui permettent la régénération de plantes mûres, constituant ainsi l'usine de production. Malgré leur extrême diversité apparente, les plantes utilisent en grande partie les mêmes fonctions, codées par des gènes semblables d’une espèce à une autre. Les connaissances acquises sur une plante modèle peuvent donc être transposées aux plantes de grande culture, avec d’autant plus de succès qu’elles sont proches du modèle. La première plante modèle choisie par la communauté internationale pour l’inventaire des gènes végétaux est une petite crucifère, cousine du colza et du chou, c’est l’arabette ; Arabidopsis thaliana. Elle ne possède aucune qualité agronomique, mais son génome de 125 millions de nucléotides est très compact, comparé à ceux du maïs ou du blé, respectivement 20 et 160 fois plus grands. Par ailleurs, A. thaliana est parfaitement adaptée au travail de laboratoire : elle est si petite qu’elle peut être cultivée en tube à essais, et une seule plante peut donner en quelques semaines plusieurs dizaines de milliers de graines. Le séquençage des cinq chromosomes d’A. thaliana, commencé en 1996 et achevé à la fin de l’année 2000, a reposé sur une collaboration internationale de laboratoires publics avec la contribution du centre de recherche Français Génoscope.
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Synthèse Bibliographique
I.4.5. Production des protéines recombinantes chez les plantes transgéniques :
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Toutefois, l’inventaire des gènes de l’arabette peut encore être amélioré par le séquençage Le Genoscope, en collaboration avec l’Unité de Recherche en Génomique Végétale à Evry (INRA) et la société Invitrogen, est engagé dans l’un des trois programmes de séquençage d’ADNc d’A. thaliana. Les protéines recombinantes produites chez les plantes transgéniques possèdent une très bonne qualité pharmacologique, les cellules végétales disposant des enzymes nécessaires à la maturation des protéines. Les modifications post-traductionnelles des protéines réalisées dans des cellules de mammifères diffèrent toutefois de celles réalisées dans une cellule végétale, ce qui nécessite quelques ajustements pour éviter les risques d'allergie. Contrairement au développement et à l'élevage d'animaux transgéniques, très coûteux, il est possible d'obtenir avec les plantes, de grandes quantités de biomasse dans des conditions économiques très compétitives (coût de production des protéines thérapeutiques réduit). En effet, l'extension de la culture des plantes productrices avec les infrastructures agricoles existantes permet une montée en puissance rapide et économique des capacités de production. Les plantes ne sont pas porteuses des agents pathogènes couramment associés aux infections humaines. Il n'existe pas, en l'état actuel des connaissances, de pathogènes végétaux capables d'infecter l'animal ou l'homme. La synthèse de la protéine médicament peut être orientée dans les organes/tissus de la plante les plus faciles à stocker et pour lesquels les procédés d'extraction sont déjà bien maîtrisés dans le secteur agroalimentaire. Ainsi, lorsque la protéine peut être administrée oralement, il est possible d'orienter sa synthèse dans les organes comestibles de la plante : les semences de céréales, d’haricot ou de pois, les tubercules de pomme de terre, les racines de carottes ou de betterave, mais également les fruits des bananiers par exemple. Restent donc principalement à résoudre les problèmes de niveau d'expression des protéines (rendements faibles), ainsi que d'extraction et de purification. Les plantes transgéniques pourraient alors représenter un moyen de production efficace et peu coûteux. La N-glycosylation des protéines chez les plantes (Lerouge et al., 2000) est semblable à celle des protéines humaines dans ses premières étapes. Les structures glycaniques de type complexe sont possibles. Toutefois, comme chez les cellules d'insectes, la glycosylation reste incomplète (présence des types oligomannosidique et hybride). L'addition de résidus Xyl (β1-2) et Fuc (α13) est caractéristique des N-glycanes des protéines chez les plantes. Ces deux résidus sont
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Synthèse Bibliographique
d’ADN complémentaires (ADNc), issus de la transcription des gènes de la plante.
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fortement immunogènes chez l'homme et compromettent donc l'utilisation de protéines
protéines chez les plantes.
I.4.5.1. Les techniques de transformation génétique des végétaux : a- Les méthodes directes : Les principales techniques de transformation directe sont la biolistique, la microinjection, l’électroporation, et le transfert utilisant le PEG (Poly Ethylène Glycol). La biolistique a été mise au point pour permettre la transformation génétique de plantes monocotylédones, plus difficiles à transformer par les méthodes indirectes que les dicotylédones. Dans la biolistique ou bombardement de particules (Klein et al., 1987; Sanford, 1988), des cellules végétales sont bombardées par des particules de tungstène ou d’or sur lesquelles est adsorbé l’ADN à transférer. Quand un de ces projectiles atteint le noyau, l’ADN porté y est introduit, s’intègre dans le génome et peut exprimer ses gènes. Cette technique nécessite l’utilisation d’un appareil capable d’accélérer les particules métalliques ou canon à particules. Il est possible de transférer des organites subcellulaires et de l’ADN grâce à la microinjection. Le transfert d’ADN dans des protoplastes issus de cellules de mésophylle de tabac a permis d’obtenir 14% de transformant sans avoir recours à la sélection (Crossway et al., 1986). L’électroporation de protoplastes et de cellules intègres (Fromm et al., 1985; Lörz et al., 1985; Fromm et al., 1986; Arencibia et al., 1995) est basée sur la capacité qu’ont les macromolécules présentes dans le milieu extracellulaire d’être acceptées à l’intérieur de cellules vivantes après un cours choc électrique (Neumann et al., 1982). 2+
Le transfert en présence de Ca /PEG a été utilisé pour la première fois par Uchimiya et ses collaborateurs (Uchimiya et al., 1986).
b- Les méthodes indirectes Les méthodes indirectes utilisent des agents pathogènes tels que les virus ou les bactéries. Les souches pathogènes les plus souvent utilisés sont les Agrobactéries: Agrobacterium tumefaciens (responsable de la galle du collet ou crown gall), et rhizogenes (responsable de la prolifération du chevelu racinaire ou ‘hairy roots’). Les transformations utilisant Agrobacterium tumefaciens présentent beaucoup d’avantages sur les méthodes directes. Le nombre de copies du transgène ~ 26 ~
Synthèse Bibliographique
thérapeutiques d'origine végétale. Enfin, les acides sialiques ne sont pas présents dans les
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transféré à la plante est réduit, ce qui diminue le risque potentiel de co-supression et d’instabilité ce qui évite ainsi l’obtention de plantes chimères comme c’est très souvent le cas en transformation directe (Enriquez-Obregon et al., 1997; Enriquez-Obregon et al., 1998).
Figure 5. Mécanismes et principaux gènes impliqués dans le transfert de l’ADN-T dans les cellules végétales. La plante blessée émet des composés phénoliques et des sucres qui sont perçus grâce au complexe virA/virG. Leur phosphorylation déclenche l’activation des gènes de virulence d’Agrobacterium tumefaciens. L’attachement de la bactérie à la surface de la cellule végétale se fait grâce à ses gènes chromosomiques (chv et att). Une copie simple brin de L’ADN-T est synthétisée grâce au complexe virD1/virD2, puis, elle est conduite dans la cellule végétale grâce aux protéines virD2. Les protéines virF et virB établissent un canal entre la cellule bactérienne et la cellule végétale. Le complexe T formé de l’ADN-T et des protéines virD2 (en 5’ de l’ADNT) et virE2 (le long de la séquence) entre dans la cellule végétale, où VIP1 facilite leur migration dans le cytoplasme. Puis, il se dirige vers le noyau de la cellule végétale et l’ADN-T s’intègre dans le génome végétal notamment grâce à H2A-1. (Gelvin, 2003) Dans le cas de la transformation génétique des plantes par un ADN-T modifié, il a été démontré que l’ADN-T est parfois rejeté du génome-hôte, y laissant quelques empreintes de son intégration passée (Marton et al., 1994). Cette instabilité semble cependant être limitée au
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Synthèse Bibliographique
du transgène (Hansen et al., 1997). C’est aussi un système où une cellule unique est transformée,
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processus d’intégration, puisqu’une fois intégrée dans le génome des plantes, l’ADN-T réagit
transposons comme transgène fait toutefois exception, puisque, par nature, ils se déplacent dans le génome au cours des générations. Dans le cas de plantes transgéniques destinées à la commercialisation, les semenciers font des tests de stabilité afin de vérifier la stabilité du transgène, le but étant d’obtenir des lignées stables.
Figure 6. Modèle simplifié représentant l’intégration de l’ADN-T dans une séquence d’ADN génomique végétale d’après Tinland, 1996. (a) L’extrémité 3’ de l’ADN-T se fixe sur l’ADN génomique par homologie, (b) puis l’extrémité 5’, associée à virD2, se lie à l’ADN génomique par une homologie restreinte de un à quelques nucléotides. (c) Il y a une digestion enzymatique d’une partie de l’ADN végétal, puis, la machinerie cellulaire synthétise le brin complémentaire en prenant l’ADN-T comme matrice. (d) L’ADN-T est intégré dans le génome végétal. La transgénèse végétale utilisant la bactérie Agrobacterium repose généralement sur la stratégie binaire de transfert des gènes. Cette stratégie met en évidence deux plasmides. L’un porteur des gènes de virulences nécessaires pour le transfert de l’ADN-T vers le génome de la plante (exemple pMP90 présent dans la souche GV3101 d’Agrobacterium), l’autre est un plasmide binaire qui porte l’ADN-T avec ses deux bordures droite et gauche et contenant le gène d’intérêt au milieu. Cette stratégie est généralement adoptée dans le cas de la transformation des plantes par technique in planta (Clough et Bent 1998).
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Synthèse Bibliographique
comme l’ADN hôte et est transféré dans la descendance (Tinland, 1996). L’utilisation des
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I.4.5.2. Transformation génétique in planta :
transformer des plantes pour lesquelles la culture in vitro et la régénération sont difficiles. Le principe de cette méthode consiste à l’inoculation de la plante dans une suspension de bactéries Agrobacterium contenant le vecteur binaire recombinant, ceci va permettre la transformation de certaines zones (exemple les ovules) qui seront à l’origine de lignées germinales. Certains des descendants seront donc transformés avec le gène d’intérêt. L’inoculation avec Agrobacterium se fait soit sur les organes reproducteurs, soit sur de jeunes pousses, ce qui permet de distinguer deux types de protocole. Ces protocoles sont faciles à utiliser, ne nécessitent aucun savoir-faire complexe et permettent l’obtention rapide de plantes transgéniques. Néanmoins, peu d’espèces végétales peuvent être transformées avec ces techniques (Bent, 2000). Jusqu’alors, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris L., quelques autres brassicacées (Bent, 2000), Medicago truncatula (Trieu et Harrison, 2000), le sarrasin (Kojima et al., 2000) et l’arachide (Rohini et Sankara Rao, 2000) ont pu être transformées par cette approche. Le faible nombre d’espèces pouvant être transformées par ce type de méthode peut certainement s’expliquer en partie par un manque de compréhension du phénomène de transformation génétique. I.5. Comparaison des différents systèmes d’expression des protéines recombinantes: Il est généralement reconnu qu'il n'y a pas de système d'expression universel disponible pour la production (biopharmaceutique) de protéines, et que la sélection d'un système d'expression de protéines hétérologues dépend d'un certain nombre de critères. Tout d'abord, il y a les contraintes liées à la protéine exprimée: qualité de la protéine recombinante (repliement, modifications), ciblage cellulaire (réticulum endoplasmique, membrane cellulaire…), immunogénicité de la protéine. Ensuite il y a des contraintes d'ordre expérimental: facilité de purification, coût/rendement du système, cellules hôtes (densité de culture, temps de génération), vecteurs (stabilité, nombre de copies, promoteurs).
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Synthèse Bibliographique
Plusieurs protocoles de transformation in planta ont été décrits. Cette approche permet de
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Figure 7. Critères de choix des systèmes d'expression des protéines recombinantes.
Les problèmes majeurs dans le choix du système restent le rendement, la protéolyse, la toxicité de la protéine envers la cellule hôte, les modifications post-traductionnelles et le repliement de la protéine. Aucun système d'expression ne satisfait tous les besoins, et la production d'une protéine X n'aura rien de comparable avec la production d'une protéine Y. Un des plus importants critères à considérer dans le choix d'un système d'expression est de savoir si la protéine d'intérêt a besoin d'être (correctement) glycosylée pour son application thérapeutique (Cumming 1991; Jenkins et Curling 1994). En effet, la glycosylation module de nombreuses caractéristiques de la protéine: repliement, sécrétion, fonction biologique, temps de demi-vie, antigénicité... Pour un certain nombre de glycoprotéines, la présence de sites spécifiques N-glycosylés est importante, mais la structure précise des glycanes n'influence apparemment pas directement la fonction biologique de la protéine. Le glycane va donc influer dans le choix de l'hôte (Tableau 2) (Jenkins et al., 1996). Si la glycosylation n'a pas d'influence sur les fonctions biologiques de la protéine, alors l'expression chez la bactérie E. coli est préférée. Si la glycosylation n'est pas indispensable pour les fonctions
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biologiques mais peut aider à stabiliser la protéine, alors la levure sera choisie (utilisation de
Synthèse Bibliographique
souches mutées pour éviter toutefois des chaînes oligomannosidiques trop longues).
Tableau 2. Caractéristiques des profils de N-glycosylation des différents systèmes d'expression de protéines hétérologues. (a : Comparées avec le profil de glycosylation des protéines humaines)
Dans le cas où la glycosylation est nécessaire à l'activité biologique de la protéine ou à l'augmentation de sa durée de vie plasmatique, les cellules de mammifères seront préférées. Pour l'instant, les bactéries (E. coli) et les levures (P. pastoris et S. cerevisiae) restent les systèmes de choix. Cependant certaines protéines, pour être actives, doivent présenter une glycosylation plus complexe et ne peuvent être produites que dans des organismes supérieurs, des animaux (cellules CHO), ou des végétaux. Jusqu’au milieu des années 90, la bactérie était l’hôte de choix pour produire une protéine recombinante. Cette position dominante découlait essentiellement de ses propriétés de croissance rapide, de son faible coût de production, de sa génétique très étudiée, et des règles de sécurité imposées pour la manipulation de l’ADN recombinant. Actuellement, avec le développement des technologies de cultures cellulaires à grande échelle, environ 60% à 70% des protéines d’intérêt pharmaceutique sont produites dans les cellules animales.
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L’autre raison de ce changement est l’accroissement de la demande pour les anticorps
Synthèse Bibliographique
recombinants humains ou humanisés (Brekke et al., 2003), qui sont fréquemment peu produits dans la bactérie.
Figure 8. Critères de choix entre les différents systèmes d’expression Raskin et al., 2002
Le choix du système d’expression est principalement guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active. Bien qu’il existe des techniques permettant le transfert rapide des gènes clonés entre différents systèmes d’expression, le vecteur génétique utilisé pour exprimer le gène recombinant, doit être adapté à l’hôte choisi. De même, il est important de connaître le compartiment cellulaire dans lequel la protéine d’intérêt se replie ou
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exerce son activité biologique naturelle. Selon que cette protéine est cytoplasmique, contenir des séquences spécifiques permettant l’adressage correct de la protéine.
Figure 9. Voies de repliement cellulaire des protéines. Dans son contexte cellulaire, le repliement des protéines est plus complexe que dans un tube à essais. La compartimentation cellulaire, qui est une source de complexité rarement mimée dans les études de repliement in vitro, impose un contrôle précis du repliement des protéines qui doivent s’insérer ou franchir une membrane lipidique au cours de leur biogenèse. À ce stade, l’utilisation d’outils informatiques prédictifs facilite l’analyse de la structure primaire des protéines en apportant des indications quant à sa localisation cellulaire. Ainsi, la présence d’une hélice hydrophobe indique que la protéine est insérée dans une membrane, ou doit éventuellement la traverser au cours de sa biosynthèse pour atteindre un compartiment cellulaire différent du cytoplasme dans lequel elle est synthétisée. La construction du vecteur génétique devra donc tenir compte de tous ces éléments indispensables à l’adressage correct de la protéine dans l’hôte cellulaire, surtout en cas d’expression hétérologue. La glycosylation des protéines oriente, évidemment, vers une production extra-cytoplasmique dans les systèmes d’expression eucaryote bien documentés, comme les levures (Gerngross et al., 2004), les cellules de mammifères (Wurm 2004) ou encore les cellules végétales (Hellwig et al., 2004). Cependant, une modification post-traductionnelle souvent négligée au sein des structures protéiques est la
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Synthèse Bibliographique
membranaire ou se replie dans un compartiment extra cytoplasmique (Figure 1), le vecteur devra
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formation des ponts disulfures. Indépendamment du système utilisé, procaryote ou eucaryote, il
protéine est produite dans un compartiment cellulaire inapproprié ne permettant pas cette modification. La formation des ponts disulfures est catalysée par un complexe enzymatique d’oxydoréductases présent dans un compartiment métaboliquement oxydant, qui est soit le périplasme (Ritz et Beckwith 2001) pour les bactéries Gram-négatives, soit le réticulum endoplasmique (Wilkinson et Gilbert 2004) pour les cellules eucaryotes. Les protéines possédant des ponts disulfures sont généralement actives dans un milieu extra-cytoplasmique, et cette liaison covalente est le plus souvent nécessaire à leur stabilité. Par conséquent, la production des protéines à ponts disulfures dans l’environnement réducteur du cytoplasme conduit le plus souvent à des problèmes de repliement. À côté du choix eucaryote versus procaryote, une troisième possibilité a été apportée récemment par l’amélioration des systèmes acellulaires qui, fondés sur le couplage des réactions de transcription et traduction in vitro, ont aujourd’hui des rendements de synthèse élevés (Spirin 2004). Bien qu’ils soient onéreux, ces systèmes permettent la production de protéines toxiques et offrent une flexibilité incomparable, par rapport aux systèmes cellulaires, pour manipuler les paramètres d’expression (Betton 2003). Enfin, le choix d’un système d’expression repose sur d’autres critères comme sa simplicité d’utilisation, le coût de production et de purification de la protéine, la capacité de contrôler le produit final et les modifications introduites, le temps requis du clonage du gène à la protéine purifiée, et les contraintes réglementaires.
I.6. Etudes sur le repliement des protéines recombinantes : I.6.1. Formation des corps d’inclusion : Pour remplir leur fonction, les protéines doivent adopter une conformation tridimensionnelle précise, l’état natif, acquise au cours du repliement cellulaire. La synthèse des protéines au niveau des ribosomes est un processus universellement conservé, ce qui permet à une bactérie de produire des protéines humaines (Braun et al., 2002), par exemple. Cependant, de nombreuses protéines ne sont pas produites dans leur état natif, mais s’agrègent dans un état le plus souvent biologiquement inactif, que l’on appelle corps d’inclusion. Ce phénomène d’agrégation est le principal obstacle à la production de protéines et, contrairement à ce qui est couramment admis,
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Synthèse Bibliographique
n’est pas rare de trouver dans la littérature des essais de production infructueux, dans lesquels la
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la formation des corps d’inclusion n’est pas l’apanage des systèmes bactériens, mais s’observe Le mécanisme moléculaire de l’agrégation des protéines recombinantes suggère que les chaînes polypeptidiques naissantes, adoptant des conformations partiellement repliées et instables (les intermédiaires de repliement), peuvent emprunter deux voies alternatives et compétitives, selon une partition cinétique (Kiefhaber et al., 1991): le repliement correct, qui conduit à la forme native, ou le repliement incorrect, qui conduit à l’agrégation. Les corps d’inclusion sont des agrégats protéiques non ordonnés (Fink 1998), relativement homogènes et denses ; ils sont de plus en plus considérés comme des systèmes en équilibre dynamique (Carrio MM, Villaverde 2002) entre association et dissociation d’espèces partiellement ou incorrectement repliées (Figure 2).
Figure 10. Formation des corps d’inclusion. Illustration, à partir d’une chaîne polypeptidique naissante, des différentes réactions conduisant à la distribution cellulaire des protéines entre les états repliés, agrégés ou dégradés. La concentration très élevée des chaînes polypeptidiques naissantes dans une cellule recombinante favorise les réactions d’agrégation aux dépens de la réaction productive vers l’état natif. Dans le contexte cellulaire, le repliement est facilité par un ensemble d’acteurs : les chaperons, qui assistent les protéines en cours de repliement des catalyseurs, qui interviennent sur les étapes lentes de ce processus, les oxydoréductases, qui catalysent la formation des ponts
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Synthèse Bibliographique
également dans des cellules eucaryotes.
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disulfures, et les peptidyl-prolyl isomérases, qui catalysent l’isomérisation cis-trans des liaisons
En agissant sur les conformations intermédiaires, les protéines chaperons contrôlent directement le processus de repliement, en collaboration avec les protéases cellulaires. En effet, les protéines incorrectement repliées sont également les substrats cellulaires de systèmes de dégradation en assurant l’élimination rapide (Wickner et al., 1999). Dans certains cas, l’agrégation résulte de la disponibilité limitée des chaperons et induit une réponse au stress dans la cellule qui produit des quantités non physiologiques d’une protéine inutile. Cependant, la formation des corps d’inclusion peut avoir un effet bénéfique en protégeant la protéine recombinante de la dégradation par les protéases cellulaires.
I.6.2. Renaturation des protéines in vitro : Bien qu’il n’existe pas d’approche universelle favorisant le repliement correct des protéines qui s’agrègent, plusieurs techniques permettant l’obtention d’une forme native sont couramment utilisées, avec des taux de succès très variés. Parmi elles, on distingue celles qui visent à renaturer la protéine in vitro à partir des corps d’inclusion purifiés (Middelberg 2002) et celles qui interviennent directement sur l’expression cellulaire afin de minimiser les réactions d’agrégation (Baneyx et Mujacic 2004). La purification des corps d’inclusion est rarement une étape critique, dans la mesure où ces agrégats sont facilement isolés par centrifugation après lyse cellulaire et contiennent la protéine recombinante à un degré de pureté très élevé. L’étape suivante de solubilisation est en revanche souvent plus délicate, car elle nécessite la dénaturation chimique complète de la protéine agrégée par des dénaturants forts comme l’urée 8M ou la guanidine 6M, éventuellement en présence d’un agent réducteur. Enfin, intervient l’étape critique d’élimination du dénaturant qui, réalisée par dialyse ou forte dilution, favorise la renaturation de la protéine. À cette étape, certaines petites molécules peuvent être additionnées à la solution de renaturation, comme des détergents, des alcools, des amides, ou de l’arginine (Clark 1999). En général, ces additifs, dont le mécanisme d’action est souvent peu documenté, diminuent l’agrégation des protéines en inhibant leurs interactions intermoléculaires. De même, les paramètres de température et de concentration de protéine sont contrôlés pour favoriser le repliement correct aux dépens de l’agrégation. Pour les protéines possédant une
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Synthèse Bibliographique
peptidiques (Fischer 1996).
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séquence polyhistidine, la chromatographie de chélation métallique constitue un troisième
2002). Cette méthode permet une séparation physique des protéines lors de la renaturation sur la colonne, et limite donc les réactions d’agrégation. Les inconvénients de ces diverses techniques de renaturation in vitro sont souvent les faibles taux de renaturation obtenus, les difficultés d’optimisation des conditions expérimentales spécifiques de chaque protéine et la précipitation de la protéine renaturée. Pour ces raisons, il est souvent souhaitable d’intervenir en amont, sur le système d’expression ou sur le gène codant pour la protéine, afin de promouvoir le repliement cellulaire. I.6.3. Minimiser l’agrégation in vivo : Les méthodes d’optimisation du repliement productif des protéines recombinantes peuvent être schématiquement présentées en deux catégories. Dans la première, les facteurs cellulaires et les paramètres de culture qui influencent l’expression et le repliement des protéines sont systématiquement testés. Parmi ceux-ci, citons le contexte génétique de la cellule recombinante, la composition du milieu culture, la température de croissance des cellules, le nombre de copies du gène recombinant par cellule et son niveau de transcription ou de traduction, la surexpression des chaperons et l’inactivation des gènes codant pour les protéases. En règle générale, l’élévation de température augmente la vitesse d’agrégation, puisque cette réaction multimoléculaire est dominée par les interactions hydrophobes. En diminuant la température de croissance et le niveau de production, le repliement correct de la protéine sera donc favorisé. La variation de ces deux paramètres donne souvent des résultats encourageants. Cependant, la manipulation de ces facteurs extrinsèques n’est pas toujours suffisante, et l’on peut recourir à une stratégie qui modifie génétiquement la séquence de la protéine recombinante, par l’ingénierie des protéines. La première approche, utilisée le plus souvent pour faciliter leur purification, est la construction d’une protéine de fusion. Il est fréquemment observé qu’une protéine fusionnée à une protéine d’intérêt par son extrémité N-terminale a une influence positive sur le repliement de cette dernière. Pour cette application, les systèmes de protéines de fusion les plus utilisées sont la protéine affine du maltose (MBP), la glutathion S-transférase ou encore NusA pour l’expression chez E. coli. Cette stratégie augmente la stabilité intracellulaire de la protéine recombinante et
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Synthèse Bibliographique
moyen permettant l’élimination du dénaturant tout en maintenant la protéine fixée (Middelberg
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simplifie sa purification, qui est réalisée en une simple étape chromatographique sur une colonne ces propriétés bénéfiques n’est pas toujours assurée après purification et clivage du partenaire de fusion. Une seconde approche est de rechercher, à l’aide des techniques d’évolution moléculaire dirigée, des variants de la protéine d’intérêt qui ne s’agrègent plus. Les grands programmes internationaux de protéomique structurale, dans lesquels le nombre de protéines cibles étudié est important, ont considérablement contribué aux développements de cette approche qui requiert des débits de criblage élevés. Bien sûr, les systèmes d’expression bactérienne se prêtent plus facilement à ce type d’approche expérimentale.
Figure 11. Principe d’une fusion par la GFP (Green Fluorescent Protein) pour tester le repliement cellulaire des protéines recombinantes. La fluorescence spécifique de la GFP est acquise uniquement à partir de sa structure tertiaire correctement repliée. Si le repliement d’une protéine test, fusionnée à la GFP, conduit à sa structure native, les bactéries produisant la fusion seront fluorescentes. Au contraire, si la protéine test s’agrège au cours du repliement, la formation des corps d’inclusion (visualisés par microscopie électronique) bloquera le repliement de la GFP, et les bactéries ne seront pas fluorescentes. Le principe est relativement simple et repose sur une propriété fonctionnelle spécifique de la protéine de fusion utilisée, indépendante de la protéine cible. Dans ces approches, la protéine de fusion la plus documentée est la protéine à fluorescence verte (GFP), dont les propriétés de fluorescence sont acquises par sa structure native et peuvent être directement reliées à la solubilité intracellulaire des protéines (Waldo et al., 1999).
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Synthèse Bibliographique
d’affinité contenant le ligand immobilisé de la protéine de fusion. Cependant, la conservation de
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En effet, si une protéine d’intérêt fusionnée à la GFP s’agrège, elle entraînera dans les corps
pas cette fluorescence verte caractéristique. À l’inverse, si la protéine d’intérêt se replie correctement, la fluorescence spécifique de la GFP native sera émise par la cellule qui produit cette fusion. À partir d’une banque de mutants du gène cible, contenant des mutations ponctuelles, les variants fluorescents, donc solubles, seront ainsi isolés. Généralement, les substitutions d’acides aminés qui accélèrent le repliement vers la forme native de la protéine sont localisées en surface, et contribuent à une plus forte solubilité de la protéine sans toutefois modifier sa fonction. Très récemment, cette technique a été améliorée par l’introduction d’un système de deux fragments complémentaires dans la GFP qui élimine un grand nombre d’artéfacts inhérents à la technique originale (Cabantous 2005).
I.6.4. Contrôle conformationnel des protéines : La production d’une protéine ayant pour objectif d’obtenir celle-ci dans une conformation proche de son état natif, il est important de pouvoir contrôler le produit final. Ce contrôle final revêt un caractère essentiel dans les cas où la protéine recombinante est purifiée après renaturation des corps d’inclusion, ou dans le cas d’une application thérapeutique (Chirino AJ, Mire-Sluis 2003), l’obtention d’une protéine soluble ne signifiant pas toujours qu’elle est dans un état natif. Un ensemble de techniques biochimiques comme l’électrophorèse et la chromatographie par gel filtration, ou biophysiques comme la spectrométrie de masse et le dichroïsme circulaire, sont conduites pour tester l’intégrité, l’homogénéité et la qualité des structures protéiques. Si la protéine est produite afin de déterminer sa structure tridimensionnelle, par cristallographie aux rayons X ou par résonance magnétique nucléaire, l’obtention de cette structure est une excellente validation du processus complet. Mais les tests d’activités biologiques qui dépendent de la protéine d’intérêt, et qui sont par nature très variés, représentent la meilleure sonde de la structure native. L’évolution moléculaire dirigée est une méthode expérimentale qui mime, de façon accélérée, le processus d’évolution naturelle. La première étape consiste à créer un grand ensemble de mutations génétiques, par des techniques de mutagenèse aléatoire, comme la PCR de basse fidelité (error prone PCR) ou la recombinaison de fragments de gènes (DNA shuffling). Puis on
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d’inclusion la GFP qui sera incapable de se replier: la cellule exprimant la fusion ne présentera
TECHNOLOGIE D’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES
recherche dans la banque de variants, par sélection ou criblage, les protéines qui présentent la L’accroissement des connaissances aussi bien sur les principes gouvernant le repliement correct et incorrect des protéines que sur le développement d’outils sophistiqués pour modifier le patrimoine génétique des cellules ou l’automatisation des méthodes d’évolution moléculaire sont autant de voies suivies ouvrant les perspectives les plus encourageantes dans ce domaine. De même, la possibilité récente de modifier génétiquement la bactérie pour qu’elle réalise la glycosylation des protéines recombinantes (Zhang et al., 2004), qui était hier encore une utopie, est devenue un pari technologique accessible.
I.7. La purification des protéines : I.7.1. Démarche globale de purification des protéines recombinantes : Ce sont ses caractéristiques intrinsèques, celles qui rendent une protéine unique et qui permettent sa séparation de ses congénères cellulaires. Une protéine possède une masse, une forme, des structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire; elle a une certaine charge à un pH donné, elle présente une certaine densité; elle possède un certain degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité. Elle a peut-être des isoformes suite à un épissage alternatif. Elle se retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée. Elle a peut-être été nantie, par génie génétique, d’un quelconque marqueur facilitant son identification, on cite comme exemple l’His6-Tag, la GST-Tag…tout dépendant du choix du vecteur au départ. En effet, les techniques de séparation utilisent différents aspects physico-chimiques des protéines, telles que leur charge (chromatographie d'échange d'ions), leur masse (filtration sur gel, gradients de densité) et leur solubilité (précipitation différentielle au sulfate d'ammonium). En cas de l’ajout d’une séquence Tag, on est dirigé vers la caractéristique de l’affinité utilisant des colonnes de résines spéciales ou des billes magnétiques ayant des marqueurs d’affinité. L’équipement disponible dans le laboratoire est l’un des facteurs les plus importants dans le choix de cette stratégie. On n’est pas obligé d'utiliser tous les paramètres en même temps. Toutefois, les techniques et les méthodes d’extraction et purification des protéines recombinantes varient aussi en fonction du compartiment cellulaire où la protéine est exprimée.
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Synthèse Bibliographique
propriété désirée, comme le caractère soluble de la protéine recombinante.
Synthèse Bibliographique
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Diagramme montrant la procédure générale de purification des protéines recombinantes à partir de cellules en culture. Les séquences d’adressage dirigent la protéine vers une expression extracellulaire ou bien membranaire. En l’absence de ces derniers la production de la protéine est intracellulaire. En général, la procédure de purification des protéines recombinantes est présentée par le diagramme ci-dessus. I.7.2. Chromatographie d’affinité : En cas de purification de protéines recombinante exprimée en fusion avec un marqueur protéique (étiquette) on a recours à la chromatographie d’affinité.
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Synthèse Bibliographique
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Figure 12. Principe de la chromatographie d’affinité Cette méthode repose sur l’utilisation d’un type spécifique de résine ou de billes magnétiques qui fixent les protéines d’intérêt par adsorption. Un lavage avec du tampon va éliminer tout le matériel non fixé. En dernière étape, la protéine d’intérêt est récupérée par élution avec un agent compétitif qui détache les protéines fixées pour prendre leur place. I.7.3. Chromatographie d’échange d’ions : En cas d’absence de séquences de fusion on peut se baser sur le fait que chaque protéine présente son propre pHi, la séparation s’effectue donc en fonction de la charge globale qui varie selon le pH du milieu tampon. Le principe de cette méthode repose sur le fait de passer un extrait brut sur une colonne contenant un tampon de pH bien déterminé. A ce pH la charge des protéines d’intérêt doit être l’opposé de celle de la résine pour qu’elle s’adsorbe à sa surface. Un lavage avec du tampon est nécessaire pour débarrasser des protéines non fixées et des contaminants, puis on passe un gradient de sel pour éluer et collecter les protéines fixées. Les fractions collectées sont par la suite analysées pour identifier la protéine d’intérêt. Ainsi les fractions gardées sont celles qui contiennent la protéine d’intérêt la plus pure possible.
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Synthèse Bibliographique
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Une fois la concentration d’élution est connue, l’élution de la protéine d’intérêt peut s’effectuer directement avec un tampon de pH précis sans passer par un gradient.
Figure 13. Principe de la chromatographie d’échange d’ions I.7.4. Chromatographie d’exclusion/diffusion (Gel filtration) : Une autre variante de chromatographie qui se base sur la séparation selon la masse des protéines est le gel filtration, appelée aussi technique de séparation par diffusion/exclusion. Généralement cette étape vient après l’échangeuse d’ions en dernière étape de purification.
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Synthèse Bibliographique
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Figure 14. Principe de la Gel filtration
Plusieurs méthodes de dosage des protéines ont été décrites dans la littérature ; parmi lesquelles on peut citer la méthode Bicinchoninic acid (BCA) (Smith et al., 1985) et la méthode de Bradford qui présentent une sensibilité de détection importante. La séparation et identification des protéines se réalise sur des gels d’acrylamide en conditions natives ou dénaturantes (PAGE-Native ou PAGE-SDS). Ainsi la révélation des protéines est effectuée généralement par les méthodes de coloration au bleu de coomassie ou au nitrate d’argent. Les protéines recombinantes produites sont identifiées et analysées grâce à différentes techniques à partir du western blot utilisant les anticorps spécifiques pour détecter la présence de la protéine une fois exprimée passant par les techniques d’HPLC, d’électrophorèse 2D, la spectrométrie de masse jusqu’à la technique de dichroïsme circulaire qui permet de déterminer le mode de repliement des protéines synthétisées et leurs structures secondaires. Les techniques de purification sont très diverses en se basant sur la nature et les caractéristiques physico-chimiques des protéines produites qui sont en effet sujettes de plusieurs études allant du fondamental jusqu’à l’appliqué et des fins structurales.
I.8. L'évolution des protéines : Dans certains cas, il est nécessaire de modifier une enzyme afin d'améliorer ses performances. De telles modifications peuvent être introduites pour des objectifs divers: augmenter sa stabilité
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et sa solubilité, accroître sa résistance aux variations de pH et températures ou à des agents
Les premiers essais de modifications des protéines étaient basés sur des approches chimiques ou enzymatiques, mais plus tard l'introduction des outils d'ingénierie génétique a permis de réaliser des modifications au niveau du gène, rendant possible des changements précis tels que les substitutions, délétions ou insertions/extensions d'acides aminés seuls ou de larges séquences. La Figure 15 regroupe différents exemples d'ingénierie des protéines à la disposition du chercheur. On distingue les modifications par des voies chimiques ou enzymatiques, et les modifications effectuées par génie génétique. Une percée majeure dans le domaine de la modification de protéines a été le développement de méthodes de mutagénèse dirigée au niveau du gène codant pour la protéine, en utilisant des oligonucléotides synthétiques (Hutchison et al., 1978). La PCR ("Polymerase Chain Reaction" ou amplification en chaîne par polymérase) a permis aux chercheurs d'amplifier de petites quantités d'ADN (Saiki et al., 1985). Des variations de la méthodologie décrite à l'origine ont eu un grand impact comme outils pour l'introduction de mutations spécifiques ou aléatoires dans la séquence d'ADN (Ling et al., 1997). Ces outils génétiques sont utilisés en routine aujourd'hui pour la conception et la production de mutants des protéines par ingénierie. L'arsenal des outils disponibles est en perpétuelle augmentation, avec la mise au point de méthodes de synthèse de peptides et de petites protéines artificielles (Merrifield, 1963), l'introduction d'acides aminés non-naturels (Noren et al., 1989 ; Bain et al., 1989) (qui peuvent ensuite subir des modifications chimiques) et la création de mutations distribuées aléatoirement le long de la séquence du gène. L'ingénierie des protéines peut impliquer l'une et/ou l'autre des approches suivantes. Dans la première, les informations structurales et mécanistiques sont utilisées pour identifier les changements nécessaires à l'obtention d'une protéine possédant les propriétés souhaitées. Dans une seconde approche, l'emploi de méthodes aléatoires permet d'effectuer des recherches de nouvelles fonctions sans avoir une connaissance très précise des modifications requises. Dans certains cas, l'approche aléatoire peut être combinée avec la conception rationnelle pour réduire la taille de la séquence d'ADN sur laquelle l'évolution est effectuée en réalisant des substitutions, des insertions et/ou des délétions d'acides aminés seuls ou de séquences plus importantes, voire de domaines entiers.
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Synthèse Bibliographique
agressifs ou encore améliorer son activité vis-à-vis d'un substrat d'intérêt.
Synthèse Bibliographique
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Figure 15. Exemples de principes d'ingénierie des protéines disponibles à l'heure actuelle. GA, glutaraldéhyde; P, phosphate; PEG, polyéthylène glycol.
Des connaissances sur la protéine étudiée sont nécessaires pour déterminer les modifications nécessaires à effectuer. La croissance rapide du nombre de structures tridimensionnelles résolues par cristallographie des rayons X ou par RMN (Berman et al., 2000), la protéine étant seule ou en complexe avec d'autres molécules, a contribué énormément à la compréhension des relations structure/fonction des protéines. Les informations structurales peuvent permettre d'identifier des
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résidus ou régions importants impliqués dans la catalyse, les liaisons au substrat ou au ligand, et
stabilité, sa solubilité et/ou altérer d'autres propriétés, notamment sa spécificité de substrat. Dans le cas où des données structurales ne sont pas disponibles, la méthode appelée "scanning mutagenesis" peut être une option. Les zones qui peuvent être importantes sont analysées par substitution d'un acide aminé à la fois, suivie par une analyse fonctionnelle des mutants exprimés pour explorer l'effet de la substitution. L'alanine est un des acides aminés le plus souvent utilisé comme substitut; on parle "d'alanine scanning". En effet, l'alanine est considéré comme un bon résidu de substitution car il ne modifie pas l'orientation de la chaîne peptidique, contrairement à la glycine ou la proline, et ne possède pas de caractéristiques stériques ou électrostatiques particulières (Cunningham et Wells, 1989). Cette méthode peut également être utilisée pour analyser la contribution de chaque acide aminé potentiel impliqué dans une fonction spécifique. Différentes approches de conception rationnelle sont disponibles à l'heure actuelle : - la mutagénèse dirigée : une ou plusieurs substitutions, identifiées par des méthodes très diverses (modélisation moléculaire par exemple), sont réalisées; - les extensions ou les troncatures : cela comprend la construction de protéines de fusion ou de mutants possédant des domaines délétés; - la conception de novo de protéines. Les altérations de la séquence peptidique sont principalement ciblées sur des positions au niveau ou proches des régions directement reliées à la fonction étudiée, tel que le site actif des enzymes. Toutefois, des effets dramatiques sur la fonctionnalité peuvent aussi avoir lieu grâce à des modifications au niveau de régions éloignées de la partie active de la protéine. Mais de telles substitutions seraient très difficiles à prédire par une simple approche rationnelle. C'est à ce niveau qu'intervient l'évolution dirigée des protéines. L'évolution dirigée réunit un ensemble de méthodes qui tentent de mimer au laboratoire les processus de l'évolution naturelle, dans un laps de temps très court. Les développements récents de la biologie moléculaire permettent de reproduire efficacement dans un tube à essai les deux moteurs de l'évolution que sont la mutation et la recombinaison. Combinées à des stratégies de criblage de plus en plus puissantes et sophistiquées, ces méthodes aboutissent en quelques cycles à faire évoluer une protéine dans la direction définie par l'expérimentateur.
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Synthèse Bibliographique
de faire des prédictions pour modifier la protéine dans le but, par exemple, d'augmenter sa
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Les premiers champs d'application de ces méthodes concernent les biocatalyseurs et les
l'évolution naturelle a sélectionné des fonctions selon une logique biologique, qui ne répond pas forcément aux critères des biotechnologies. Pour réaliser une telle évolution dirigée des protéines, il faut donc : - une stratégie efficace d'évolution; - un système d'expression dans lequel l'enzyme modifiée sera exprimée sous forme fonctionnelle; il peut s'agir de l'organisme d'origine, d'un organisme recombinant ou même d'un système in vitro; en général les bactéries ou les levures sont utilisées; - un crible ou une méthode de sélection adaptée à la propriété recherchée. Les sources de diversité à la disposition du chercheur sont nombreuses. L'étape commune à toutes les stratégies employées est la création d'une banque de gènes à partir desquels seront produites les protéines. Selon le projet et la classe de protéines étudiés, de telles banques peuvent être générées à partir de diverses sources naturelles et/ou la variabilité génétique peut être générée par l'homme in vivo ou in vitro par des techniques d'ingénierie génétique très sophistiquées. Parmi les méthodes de mutagénèse aléatoire, on peut citer la mutagénèse chimique, l'irradiation UV, la recombinaison homologue, la mutagénèse aléatoire par cassette. L'utilisation de souches mutatrices inactivées au niveau de leur système de réparation de l'ADN permet d'obtenir des plasmides comportant des mutations. La PCR mutagène, ou sujette à erreurs ("error prone PCR"), repose sur l'infidélité d'ADN polymérases (notamment la polymérase Taq); les erreurs sont introduites pendant l'amplification de l'ADN et peuvent varier en nombre selon la concentration en ions magnésium ou manganèse dans le milieu ou par abaissement de la concentration d'un nucléotide. Le réarrangement d'ADN ou redistribution de l'ADN ("DNA shuffling"), développé en 1994 par Stemmer et al. 1994, consiste à fragmenter de multiples copies d'un gène (avec plus ou moins de mutations introduites) puis à les réassembler aléatoirement. Ces méthodes de mutagénèse aléatoire peuvent générer un très grand nombre de mutants qui doivent ensuite être étudiés pour la nouvelle propriété recherchée. L'identification des mutants avec la propriété cible peut être effectuée selon deux approches : le criblage (examen de chaque mutant séparément pour une propriété précise) et/ou la sélection (seuls les mutants possédant la nouvelle propriété survivent). Pour cela, de nombreuses méthodes d'analyse sont disponibles
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Synthèse Bibliographique
anticorps, domaines où la diversité naturelle peut sembler immense, mais pour lesquels
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pour tester les fonctions des protéines produites, souvent adaptées à chaque protéine. Ensuite, L'amplification et le séquençage de l'ADN étant faciles à mettre en œuvre, de nouvelles méthodes ont été développées afin de lier physiquement chaque protéine produite à sa séquence d'ADN correspondante, autrement dit des techniques où le phénotype et le génotype sont liés (Lin et al., 2002). On peut citer par exemple des techniques telles que le "phage display" (présentation de phage) ou le "cell surface display" (présentation à la surface des cellules).
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Synthèse Bibliographique
l'étape suivante est la détermination des mutations introduites dans la séquence protéique.
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
Parmi les 10 millions des cas de cancer développés chaque année dans le monde, plus que 15% sont estimés à être attribués aux agents infectieux (Pisani et al., 1997). L’infection par les papillomavirus (PVH) compte à peu près 30% de ces infections; soit environ 5% du total des cancers. Les PVH infectent les strates de l’épithélium squameux de la peau et des muqueuses où ils causent des lésions bénignes dont quelques-unes peuvent se développer en cancers invasifs (Lowy et Howley, 2001; Zur Hausen, 2002; Bosch et al., 2003). Pour établir l’infection, il est possible que l’érosion se produit au niveau des couches externes de l’épithélium
afin d’aboutir à la couche basale, où se trouvent les cellules souches. Les
traumatismes prennent place vers les derniers mois ou années de l’invasion puisque le génome viral parasite toute la couche externe de cellules, ainsi le virus évite le système immunitaire par la limitation de l’expression de la majorité des gènes virales et la réplication dans les couches cellulaires supra basales. C’est pour cela que la plupart des infections se limitent vraisemblablement à cause de la réussite de la réponse immunitaire. Les lésions bénignes induites par PVH englobent les verrues de peau urogénitales et non génitales, les papillomes orales et laryngales et les condylomes mucorales et anogénitales qui sont en générale sexuellement transmissibles. Une longue durée d’infection par un type de Papillomavirus peut induire une tumeur anogénitale maligne, citant les cancers de l’anus, du penis, du vagin et du cerveau (Frisch, 2002; Gillison et Shah, 2003 ; Schiffman et Kjaer, 2003). Une proportion des cancers buccogénitaux est contribuée aux PVH (Gillison et Lowy, 2004 ; Szentirmay et al., 2005) mais occasionnellement avec le cancer de l’œsophage et de la peau (Gillison et Shah, 2003 ; Pfister, 2003) parmi les cancers attribués aux infections par PVH, le cancer cervical a reçu la plus grande attention (Yang et al., 2004). En effet, il compte environ 10% des cas de cancers chez les femmes dans le monde. C’est la seconde cause de cancer mortel chez les femmes après le cancer des seins. L’intervalle entre l’acquisition de l’infection par le virus et la progression maligne est généralement de 10 ans et c’est fréquemment plus longtemps (Schiffman et Kjaer, 2003 ; Snijders et al., 2006). Les incidents augmentent progressivement pour les femmes plus que 25 ans et elles sont plus importantes au-delà de l’âge de 40 ans.
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Synthèse Bibliographique
II. Les Papillomavirus Humains :
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
premièrement parce qu’ils manquent de programmes d’identification d’une qualité élevée de cancer cervical pour la détection d’anormalités via « Pap smear testing » ou pour la présence d’ADN de PVH (Wright et al., 2002). Pratiquement tous les cas des cancers cervicaux sont attribués à l’acquisition d’une infection sexuelle par le PV (Bosch et al., 2002), bien que cette infection présente une proportion variable (les deux tiers) des autres tumeurs dont le virus est impliqué étiologiquement. La plupart des infections génitales par PVH sont bénignes, supra cliniques et autolimitées. Aussi une proportion importante des infections associées aux dysplasies cervicales de faible degré encore régressent spontanément (Schiffman et Kjaer 2003 ; Baseman et Koutsky, 2005). Par contre, les types oncogéniques, essentiellement types 16 et 18, présentent un facteur de risque pour une dysplasie de haut degré (Khan et al., 2005) et c’est un type de lésion qui est reconnu comme précancéreux et qui doit être traité pour arrêter le développement d’un cancer invasif (John Doorbar, 2005). Ce type de cancer peut être induit par n’importe quel virus des 15 types oncogéniques de PVH, mais les types 16 et 18 prédominent avec environ 50 et 20%, respectivement (Munoz et al., 2004). Ces deux types présentent aussi un rôle important dans l’induction des cancers génitaux et mucorales (Gillison et Shah, 2003). Ainsi, les études statistiques ont conduit à penser que l’infection génitale par PVH sera la plus commune des infections virales sexuellement transmissibles avec une prévalence estimée à 20-40% des femmes sexuellement actives à l’âge de 20 ans. II.1. Généralités sur l’infection génitale à PVH : Les papillomavirus sont extrêmement répandus. Il en existe plus d'une centaine de types qui présentent un tropisme cutanéo-muqueux. Des PVH sont retrouvés dans près de 100% des cancers du col de l'utérus. L'association entre ce cancer et la présence de PVH (16 ou 18) est de 50 fois plus élevée que celle entre tabagisme et cancer du poumon. Ce cancer, à évolution lente, met plus de 10 ans à se développer depuis la première infection jusqu'aux différentes lésions histologiques précancéreuses accompagnant la persistance de l'infection. Donc, précédé de nombreuses lésions précancéreuses curables, ce cancer est un candidat idéal au dépistage, mais un grand pourcentage de femmes échappent à ce dépistage,
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Synthèse Bibliographique
Environ 80% des cancers cervicales sont localisés dans les pays moins développés,
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
conduire au développement de lésions malignes. L’infection à HPV est responsable, chaque année, de plus de 470 000 cas de cancer du col de l’utérus dans le monde et d’environ 190 000 décès dont 35 000 aux États-Unis et en Europe (Ferlay et al., 2002).
Figure 16 : Etude épidémique des infections par le papillomavirus humains Même si le dépistage réduit le risque de cancer cervical, il n’empêche pas le développement des lésions précancéreuses et le taux de couverture de la population est très insuffisant, particulièrement dans les pays en voie de développement mais également dans certains pays développés. L’infection par les PVH génitaux est une infection sexuellement transmissible, touchant principalement les jeunes femmes entre 20 et 30 ans, acquise très précocement lors de la vie sexuelle (40% dans les deux ans qui suivent le premier rapport). En France, 18% des adolescentes de 15 ans auraient eu des relations sexuelles, avec un âge moyen des premiers rapports à 17ans (Bozon 2003). Actuellement, environ 25 à 30 millions de femmes seraient porteuses de PVH génitaux en Europe. Une étude française portant sur 3832 patientes donne une
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Synthèse Bibliographique
surtout dans les pays en voie de développement. Par conséquence, la persistance du virus peut
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
risque de contracter une infection à HPV durant une vie entière serait de 80%. Cette infection est à l’origine de condylomes mais elle est aussi responsable des lésions au niveau du col avec des frottis anormaux, des lésions intra-épithéliales et des cancers invasifs (Bosch et al., 1995).
Figure 17. Histoire naturelle de l’infection au PVH et du cancer du col de l’utérus.
Les condylomes sont des lésions bénignes dues à des papillomavirus. Parmi les génotypes de PVH à bas risque oncogénique, les types 6 et 11 seraient retrouvés dans près de 90% des lésions (condylomes et LSIL). On estime qu’en France surviennent chaque année 300.000 à 600.000 nouveaux cas de condylomes, ce qui place l’infection à PVH en tête des infections sexuellement transmissibles, avec un coût psychologique et économique important. Des papillomavirus sont retrouvés, selon une étude mondiale, dans près de 100% des cancers du col (Walboomers et al., 1999). En France par exemple, le cancer du col de l’utérus aurait une incidence de 3400 nouveaux cas et serait à l’origine de 1000 décès féminins par an (Figure 29). Quant aux génotypes d’HPV à haut risque oncogène impliqués dans le développement du cancer du col, les types 16, 18, 31, 33, et 45 sont à 83% au niveau mondial. La prédominance d’un tel génotype ou autre peut varier selon les pays. Les types 16 et 18 représentant plus de 70% des cas
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Synthèse Bibliographique
prévalence globale des PVH de 14,32% dans la population générale (Boulanger et al., 2004). Le
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
de cancer du col en Europe occidentale (Bosch 2003). Mais la répartition génotypique n’est pas
Synthèse Bibliographique
à ce jour connue en France.
Figure 18. Épidémiologie des infections à PVH et du cancer du col de l’utérus en France (données présentées par l’Institut National de Veille Sanitaire, 2003). Les papillomavirus sont également impliqués dans le développement d’autres cancers des muqueuses génitales (anus, vulve et pénis) et à l’origine d’un pourcentage élevé de cancer de l’oropharynx, du larynx ou encore de la cavité buccale. Une vaccination contre les papillomavirus pourrait ainsi prévenir 15% des cancers de la femme et 10% des cancers de l’homme.
II.2. Morphologie et structure des Papillomavirus : Les papillomavirus appartiennent à la famille des Papillomaviridae, ceux sont des virus à capside icosaédrique de 45 à 55 nm de diamètre, formée de 72 capsomères. Leur génome (8Kb) se présente sous forme d’ADN bicaténaire circulaire dont un seul brin est codant. Parmi les neuf protéines codées, L1 et L2 forment la capside protéique (L1 étant la plus majoritaire) tandis que E6 et E7 sont impliquées dans la transformation maligne des cellules épithéliales en se liant, respectivement, aux protéines p53 et p105Rb (Fig. 19).
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Synthèse Bibliographique
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
Figure 19 : Organisation des gènes et protéines virales du PVH D’après des études de l’Institut Pasteur de France (Mai 2008), ils existent actuellement environ 200 types de papillomavirus susceptibles d'infecter l'homme. Certains de ces virus affectent la peau, d'autres les muqueuses buccales, anales ou génitales. Parmi les PVH à tropisme muqueux, on distingue ceux à bas risque oncogène dont la présence peut conduire au développement de lésions de bas grade (condylome ou LSIL [Low grade Squamous Intraepithelial Lesion]) et d’autres à haut risque oncogène impliqués dans le développement de lésions de haut grade (HSIL [High grade Squamous Intraepithelial Lesion]) ou de cancer.
II.3. Les protéines virales de PVH: II.3.1. Les protéines précoces : Ces protéines se présentent en 7 types nommées E1 à E7 ayant chacune une fonction bien déterminée. La protéine E1 est impliquée dans la réplication virale. C’est une phosphoprotéine nucléaire avec une fonction hélicase nécessaire à la réplication virale et au maintien du génome viral sous forme épisomique. Cette protéine représente avec la protéine E4 une structure de fusion E1E4 qui s’associe avec les tonofilaments et joue un rôle dans la destruction des assemblages de kératine dans les cellules hautement différenciées, permettant ainsi la libération des particules virales (C. Mougin et al ; 1998).
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LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
La voie d’action de cette protéine virale passe par la dégradation de la protéine anti-oncogène p53 via le système de l’ubiquitine entraînant alors la dégradation cellulaire des protéines. Ainsi la protéine E7 possède la capacité de se lier avec le gène suppresseur de tumeur du rétinoblastome avec la protéine p21 qui intervient dans la régulation du cycle cellulaire. Elle coopère avec la protéine E6 pour l’immortalisation des cellules épithéliales et des kératinocytes, et participe à leur transformation lorsque les cellules sont transfectées par les gènes v-ras et cmyc. La protéine E7 peut également transformer des cellules de rongeurs NIH3T3 sans être associée à la protéine E6.
II.3.2. Les protéines tardives : a- La protéine L1 : La protéine L1 dont la masse moléculaire varie de 55 à 60 KDa selon le type de papillomavirus considéré. Elle est la protéine structurale majeure de capside puisqu’elle représente 80% des protéines de la capside. Une analyse de la séquence primaire a permis de définir 4 sites de N-glycosylation dont le rôle n’est toute fois pas clairement défini, ainsi que deux signaux fonctionnels de localisation nucléaire (NLS) situés en position C-terminale. La protéine L1 seule, possède la capacité de s’auto assembler in vivo pour former des capsides virales lorsqu’elle est exprimée dans différents systèmes d’expression, et in vitro dans des conditions stringentes définies. La protéine L1 a par ailleurs la capacité de fixer l’ADN par l’intermédiaire d’un domaine correspondant aux 11 acides aminés de la région C-terminale. Ce domaine de liaison identifié initialement à partir de la protéine L1 du PVH 11 n’a cependant pas été retrouvé sur la protéine L1 du HPV 16. b- La protéine L2 : La protéine L2, protéine mineure de la capside virale, a un poids moléculaire de 70 KDa. Deux signaux de localisation nucléaires situés en positon N et C-terminale ont été décrits. Elle possède également un domaine très conservé, riche en lysine et arginine, qui correspond aux 11 acides aminés N-terminaux lui conférant des propriétés de liaison à l’ADN. Par ailleurs, la protéine L2 joue un rôle important dans l’encapsidation de l’ADN viral.
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Synthèse Bibliographique
La protéine E6 des PVHs à haut risque possède des propriétés immortelles et de transformation.
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la capside virale. c- Assemblage de la capside des papillomavirus : La capside icosaédrique des papillomavirus est composée de 72 capsomères. L’analyse en microscopie électronique a montré l’existence de 12 pentons et 60 exons disposés selon un angle de triangulation T=7. La capside est ainsi constituée par l’assemblage de 360 protéines L1 et 12 protéines L2. La présence de la protéine L2 ne modifie pas la structure des capsomères. L’expression des protéines L1 et L2 dans différents systèmes d’expression a permis d’étudier leurs rôles respectifs au sein de la capside et de déterminer les séquences indispensables pour la formation de la capside virale (H. Warzecha et al ; 2003). Des capsides recombinantes (VLPs)des papillomavirus ont été obtenues par expression de la protéine L1 seule ou bien L1 associée à la protéine L2 dans différents systèmes d’expression eucaryotes comprenant l’utilisation de baculovirus, de virus de la vaccine, de virus de la forêt de Semliki et de levures recombinantes.
Figure 20. Structure d’une particule virale de Papillomavirus (E1 à E7 : gènes précoces ; L1 et L2 : gènes tardifs).
Quand la protéine L2 est co-exprimée avec la protéine L1 dans les cellules eucaryotes, celle-ci est incorporée de façon stable dans les capsides avec un rapport d’une protéine L2 pour 30 L1.
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Synthèse Bibliographique
De point de vue morphologie, les protéines L1 et L2 sont semblables et forment toutes les deux
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L1 associée à la protéine L2.
II.3.3. Classification des Papillomavirus : Les Papillomavirus représentent un très vaste groupe de virus qui étaient reconnus et identifiés chez plus de 20 différentes espèces de Mammifères, aussi bien que chez les oiseaux et reptiles. Vue l’importance médicale de ces virus, ils ont été largement étudiés et plus que 100 différents types sont à présent identifiés (Bernard, 2005). Bien que la classification des papillomavirus soit basée sur l’homologie des séquences nucléotidiques, la différence entre les groupes évolués est reflétée à un certain point que les différences biologiques sont tranchantes.
Figure 21: Différences de l’organisation des cycles de vie durant l’évolution des types variés de PVH. Lors de la comparaison avec les PVH du supergroupe A exemple PVH2 ou PVH11 (fig A), ceux du supergroupe E exemple PVH1 ou 63 (fig B) débutent leur cycle de vie à partir de la ligne cellulaire basale. Dans le cas des lésions causées par ces types de PV, il n’existe pas de compartiment séparant les protéines E7 et E4, et l’amplification du génome viral débute à partir des lignées cellulaires basales (Peh et al., 2002). Les PVH transmis par voie génitale appartiennent au super-groupe A (connus aussi papillomavirus de type alpha), (De Villiers et al., 2004; Myers et al., 1994) les virus pathogènes à bas risque et les plus transmis parmi ce groupe sont les types 6 et 11 qui affectent environ 1%
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Synthèse Bibliographique
Les VLPs (Virus Like Particles) sont constituées soit de la protéine L1 seule, soit de la protéine
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les organes génitaux où ils s’accompagnent de formation d’un papillome bénigne. Par contre, les virus à haut risque de ce groupe A comme les PVH de types 16 et 18 causent des lésions mucorales qui peuvent évoluer chez certaines personnes en néoplasie de haut grade et cancer (Bosch et al., 2002; Walboomers et al., 1999). Bien que les virus du super groupe A incluent ceux à premier tropisme cutané, exemple PVH 2 et 10, ils présentent un cycle de vie différent de celui des autres PV des autres groupes (Middleton et al., 2003; Peh et al., 2002). Le second groupe majeur de PVH est présenté par le super-groupe B. les virus du sous-groupe B1 tel que PVH5 (béta papillomavirus) (De Villiers et al., 2004; Myers et al., 1994) causent des infections inapparentes ou latentes dans la population en général, mais peuvent se transformer en un grand problème d’individus immunosuppresseurs ou pour individus ayant un déficit héréditaire (Ramoz et al., 2002). Par contre, les virus du sous-groupe B2 exemple PVH4 (aussi connu les Gamma papillomavirus (de Villiers et al., 2004) causent des irritations cutanées qui ressemblent superficiellement à celles provoquées par les PVH du super groupe A. Le reste des PVH sont classés dans le super-groupe E (Myers et al., 1994) (aussi classés Mu et Nu-papillomavirus (de Villiers et al., 2004). II.4. Mécanismes de l’infection par les Papillomavirus: Les PVH pénètrent les épithéliums cutanés ou muqueux à la faveur de microlésions et infectent les cellules basales, siège du renouvellement permanent de l’épithélium, en se liant à un récepteur encore inconnu à ce jour. L’ADN viral (sous forme épisomale) se réplique en même temps que le génome cellulaire dans les cellules basales. Durant leur migration dans les couches supérieures de l’épithélium, les cellules filles infectées continuent leur différenciation qui conditionne la fin du cycle de multiplication virale et en particulier l’expression des protéines tardives L1 et L2 formant la capside des papillomavirus. Ces protéines vont s’auto-assembler pour former des particules dans lesquelles l’ADN circulaire viral est encapsidé. Les virions néoformés seront libérés et le virus pourra se propager ainsi au sein d’un même épithélium ou être transmis à un autre individu par contact direct.
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Synthèse Bibliographique
des populations sexuellement actives (Brentjens et al., 2002). Ces virus peuvent aussi infecter
Synthèse Bibliographique
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Figure 22. Organisation du cycle de vie et production des protéines infectieuse durant l’infection par les PVH. La réplication clonale du virus dans les cellules infectées et la stimulation de la croissance cellulaire par les protéines virales précoces sont à l’origine de l’acanthose et de la prolifération bénigne caractéristique du papillome (Hebner, 2006). Près de 100% des cancers du col contiennent de l'ADN de PVH haut risque mais une infection virale chronique par un PVH, si elle est nécessaire, n'est pas suffisante au développement du cancer; des cofacteurs endogènes et exogènes sont également impliqués. Si le processus tumoral est très complexe, il est très généralement plurifactoriel, il met en jeu des modifications de l'ADN de la cellule-hôte, modifications telles que l’échappement des cellules tumorales au contrôle de la multiplication cellulaire. Parmi les cofacteurs liés au développement du cancer cervical il y a : le type du virus, variant, intégration ; système immunitaire de l’hôte, type HLA ; à l’environnement (Tabac, hormones, parité, nutrition…) L’infection par un tel type de PV peut évoluer selon deux modes : clairance virale ou latence (Dalstein et al., 2003). La majorité évolue dans le sens d’une clairance virale qui aboutit à la guérison spontanée de l’infection. Cependant, dans certains cas (dépendants de l’hôte ou du type viral), l’ADN viral peut soit persister sous forme épisomale à l’état latent, soit évoluer vers une infection productive lors d’une réactivation, soit persister sous forme intégrée au génome cellulaire et entraîner ensuite l’apparition de lésions précancéreuses ou cancéreuses.
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crêtes de coq, qui sont des excroissances de peau (verrues génitales externes). Les condylomes sont des petites tumeurs (augmentation du volume d'un tissu) douloureuses mais bénignes au niveau de la sphère anogénitale. Une grande partie de ces lésions passe inaperçue. Elles peuvent aussi se produire chez le sexe mâle; les condylomes acuminés génitaux externes affectent garçons et filles dans les mêmes proportions; la prévalence de la maladie est estimée à 8-10% entre 15 et 25 ans; souvent extensive, récidivante et difficile à traiter, elle affecte donc le couple et cause un nombre de désagréments y compris psychologique. Parmi les lésions histologiques, selon le degré d'atteinte dans l'épaisseur de l'épithélium utérin, on peut classer les néoplasies cervicaux intra épithéliales, ou CIN: (le diagnostic des CIN se fait par le dépistage). Selon certaines études, 1% des CIN1, 5% des CIN2 et 12% des CIN3 évoluent vers un cancer. Parmi les anomalies cytologiques, on distingue les HSIL et les LSIL: Les HPV à haut risque oncogène peuvent conduire à des Lésions à Haut Grade, HSIL pour High grade Squamous Intraepithelial Lesion, en français: lésion malpighienne intraépithéliale de haut grade.
Figure 23. Evolution des Néoplasies cervicales intra épithéliales. CIN1 de bas grade, les lésions occupent le tiers basal de l'épithélium. CIN2 de grade intermédiaire, les lésions occupent les deux tiers de l'épithélium. CIN3 de haut grade, tout l'épithélium est concerné par la lésion. Les Lésions à bas grade sont appelées LSIL pour Low grade Squamous Intraepithelial Lesion, en français: lésion malpighienne intraépithéliale de bas grade.
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Synthèse Bibliographique
L'infection au PVH se manifeste par l'apparition de verrues, condylomes plats ou acuminés,
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différentes dysplasies sont 2 maladies différentes: une dysplasie de bas grade qui régresse dans plus de 60% des cas, et progresse dans 8.5% des cas, alors qu'une dysplasie à haut grade régresse dans moins de 40% des cas et progresse dans également 40% des cas. Cette capacité à évoluer vers une lésion à haut grade caractérise le PVH 16.
II.5. Du virus HPV au vaccin à VLP : II.5.1. Principe du vaccin prophylactique : Les Papillomavirus Humains comportent dans leur structure différentes protéines dont leur expression varie avec l’évolution de l’infection. On distingue: - les protéines de capside dont L1 qui a fourni la base des vaccins Gardasil et Cervarix, - protéines d'expression plus précoces (Early) dont les gènes E6 et E7 sont impliquées dans la transformation maligne des cellules de l'épithélium infesté en se liant aux protéines p53 et pRb (protéines de régulation du cycle cellulaire). La très forte corrélation entre la présence de PVH et l’apparition d’un cancer du col a rendu envisageable le développement d’un vaccin contre les infections à papillomavirus en général et contre le cancer du col en particulier. Parmi les différentes approches envisagées, la vaccination à l’aide de pseudo-particules virales constituées de la protéine L1 de la capside donne des résultats très encourageants à la lumière des essais cliniques réalisés depuis quatre ans par les laboratoires qui ont mis au point ces vaccins. L'incidence mondiale du cancer du col de l'utérus évaluée à 500000 nouveaux cas par an et la mise en évidence quasi constante des PVH dans ces lésions cancéreuses justifient pleinement le développement de vaccins efficaces. La mise au point de ces nouveaux outils qui sont les VLP a considérablement modifié les perspectives vaccinales et permis leur mise au point. Le cancer du col de l'utérus est la conséquence d'une infection virale par un papillomavirus, et les vaccins contre de nombreuses maladies virales (poliomyélite, rougeole ou variole) sont efficaces: pourquoi ne pas prévenir le cancer du col par une vaccination antivirale. Malgré les mécanismes mis en jeu par le virus pour assurer sa persistance et lutter contre la réponse immunitaire de l'hôte, plus de 90% des infections à PV guérissent spontanément, ce qui laissait espérer le développement de vaccins prophylactiques et de vaccins thérapeutiques curatifs.
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Synthèse Bibliographique
Une lésion précancéreuse peut régresser, persister ou progresser. Pour certains auteurs, ces
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des cancers et que plus de la moitié des lésions contiennent PVH16 et un grand nombre HPV18. C'est donc principalement contre ces 2 génotypes que l'effort de recherche a porté. Il existe 2 approches vaccinales, l'une préventive, l'autre thérapeutique.
Figure 24. Principe de la prévention contre le PVH utilisant un vaccin prophylactique
Le vaccin prophylactique vise à protéger préventivement l'individu contre l'infection en lui faisant produire des anticorps tournés contre le PVH. Le vaccin thérapeutique correspond à une stratégie plus récente qui consiste à augmenter les réponses immunitaires de l'individu contre une infection déjà en place (augmentation de la réponse immunitaire à médiation cellulaire). Le vaccin thérapeutique vise à faire régresser les infections persistantes et leur évolution en cancer invasif, ce qui repose sur l'induction d'une immunité cellulaire par des lymphocytes T cytotoxiques dirigée contre les cellules exprimant les oncoprotéines virales. Au stade où les cellules infectées ne sont pas encore transformées, la thérapie viserait à agir sur la réplication virale en induisant une réponse immunitaire contre les protéines E1 et E2 dont la rupture des gènes lors de l'insertion de l'ADN viral dans l'ADN cellulaire est impliquée dans le passage au stade cancéreux, ou contre les protéines L1 et L2 de la capside du virus. ~ 63 ~
Synthèse Bibliographique
Les travaux des 20 dernières années montrent que différents génotypes sont présents dans 99%
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disponibles, Cervarix et Gardasil. Les anticorps produits sont principalement dirigés contre les protéines L1, protéines majeures de la capside virale.
Figure 25. Etapes de la synthèse des VLPs (le système de baculovirus est utilisé par la firme GSK).
II.5.2. Comment développer une mémoire immunitaire? Les vaccins vivants atténués restent potentiellement trop oncogènes, interdisant leur utilisation à titre préventif chez les individus en bonne santé. PVH pose la difficulté de ne pas pouvoir se développer en culture cellulaire et les premières tentatives visant à produire cette protéine à partir de bactéries ont échoué: la protéine purifiée était le plus souvent malformée et n'induisait pas une production suffisante d'anticorps neutralisant dans les modèles animaux. Le développement a porté sur les VLP (Virus Like Particule). Les protéines L1 sont les protéines majeures de la capside virale et elles sont capables de s'autoassembler en pseudovirions d'HPV, pseudo-particules virales nommées VLP, ayant une morphologie voisine de celle du HPV, dépourvues de matériel génétique, non oncogènes mais très immunogènes lorsqu'elles sont associées à un adjuvant adéquat.
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Synthèse Bibliographique
C'est l'approche prophylactique qui a débouché sur le développement des 2 vaccins récemment
Historique sur les vaccins contre HPV : 1982 à 1998
1991
Découverte de HPV16 et Premières HPV18, démonstration de VLP l'activité oncogène et produites études sur le cancer du col de l'utérus
1995 à 2001 Etudes prospectives sur les néoplasies induites par HPV
1999
2001
HPV est reconnu Essais et nécessaire au preuves développement du d'efficacité cancer du col. début des essais cliniques utilisant des vaccins VLP
Quelques exemples de VLP produites HEV: Virus de l'hépatite E HPV: Human Papilloma Virus SIV-HIV: Virus de l'immunodéficience simienne-humaine HCV: Virus de l'hépatite C BTV: Virus bluetongue (fièvre catharrale maligne du mouton)
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2006 et 2007 autorisation de mise sur le marché de deux vaccins à base de VLP
Synthèse Bibliographique
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
Synthèse Bibliographique
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
Bertrand Bellier, CNRS UMR7087, Hôpital Pitié-Salpétrière, Paris
Deux options vaccinales anti-papillomavirus ont été choisies (Munoz et al., 2004) : un vaccin VLP bivalent (types 16 et 18) ciblant la protection contre le cancer du col puisque les HPV 16 + 18 sont responsables en Europe de 70 % des cancers du col et un vaccin VLP quadrivalent (types 6, 11, 16 et 18) permettant de protéger à la fois contre le cancer du col et contre les condylomes acuminés (les HPV type 6 et 11 seraient impliqués dans environ 90% des condylomes), tous deux administrables par voie intramusculaire. Des études d’immunogénicité ont surtout été menées sur des femmes de 15 à 25 ans ; mais les hommes sont eux aussi répondeurs. Actuellement, deux vaccins prophylactiques contre papillomavirus répondant chacun à une de ces deux options vaccinales, en étude de phase III. Tous deux utilisent des VLP de la protéine de capside L1 obtenus par génie génétique et nécessitent trois injections intramusculaires sur six mois (zéro–un–six ou zéro–deux–six mois). Le vaccin de Sanofi Pasteur MSD (Gardasil®) est produit sur levures et cible le cancer du col (HPV 16 + 18) et les condylomes (HPV 6 + 11). Il contient comme adjuvant de l’hydroxyde d’aluminium. Le vaccin de GSK (Cervarix®) est
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LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
l’hydroxyde d’aluminium et du MPL (3-deacyclated monophosphoryl lipid A). La vaccination prophylactique a pour but d’induire la synthèse d’anticorps neutralisants dirigés contre la protéine de capside L1 de l’HPV (Schiller et Lowy, 2004). L’approche choisie pour le développement d’un vaccin préventif est fondée sur l’utilisation de pseudo-particules virales ou VLP (Virus Like Particles) non infectieuses, produites par génie génétique suite à l’introduction du gène L1 dans différents vecteurs d’expression eucaryotes permettant la synthèse de l’antigène viral. Cette approche a été envisagée à la suite de la découverte de la propriété que possède la protéine L1 des HPV de s’autoassembler en pseudoparticules virales lorsqu’elle est produite en cellules eucaryotes et en grande quantité (Hagensee et al., 1993). De plus, ces VLP possèdent une morphologie presque identique à celle des virions et sont capables d’induire la production de hauts titres d’anticorps neutralisants contre des épitopes conformationnels du virus (Rose et al., 1994). II.5.3. Points forts portant sur l’efficacité du vaccin : A partir des deux études pivots ayant inclus plus de 17500 femmes âgées de 16 à 26 ans : - le vaccin Gardasil® est associé à une prévention de 100% des lésions cervicales de haut grade (CIN 2/3) et des adénocarcinomes in situ associés à l’infection par les HPV 16 et 18 dans la population. - Gardasil® est également efficace contre 99 % des condylomes et des lésions vulvaires de haut grade liées aux HPV 6, 11, 16 et 18. En revanche, dans la population « générale » qui inclut des sujets qui peuvent être déjà infectés par les génotypes contenus dans le vaccin lors de la 1ère injection vaccinale, l’efficacité vaccinale est nettement moindre (39%) contre les CIN2/3 ou adénocarcinomes in situ associés aux infections par les HPV 16 et 18. Le profil de sécurité d’emploi de Gardasil® a été évalué sur plus de 11000 sujets exposés au Gardasil® et âgés de 9 à 26 ans. L’analyse de l’ensemble des données de tolérance suggère une tolérance globale satisfaisante avec une prédominance de réactions au site d’injection et de réactions fébriles transitoires. Aucun risque grave n’a été identifié durant la phase de développement clinique du Gardasil®.
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Synthèse Bibliographique
produit sur baculovirus et cible le cancer du col (HPV 16 + 18). Il contient comme adjuvant de
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
détecter aussi précocement que possible et de traiter tout signal d’effets indésirables nouveaux lorsque le vaccin sera dans les conditions réelles d’utilisation y compris chez la femme enceinte. En résumé, le vaccin Gardasil® anti-HPV 6, 11, 16 et 18 est un vaccin préventif et ne peut être utilisé à visée thérapeutique. Il est dirigé contre certains HPV oncogènes (16 et 18) et ne protège pas contre les infections par les autres HPV oncogènes, son efficacité est de 100 % contre les lésions cervicales de haut grade liées à l’infection par les sérotypes 16 et 18 chez les sujets n’ayant pas été en contact avec ces HPV. Une couverture vaccinale de 100 % ne confèrerait une protection que contre 70 % des cancers du col de l’utérus. Pour toutes ces raisons, la vaccination doit s’accompagner du maintien du dépistage y compris chez les populations vaccinées, ainsi de la mise en place d’un plan de gestion des risques. Cependant, il est à signaler que les effectifs sont insuffisants pour pouvoir détecter des effets indésirables rares et très rares. Les données préliminaires ont montré la stabilité des titres en anticorps jusqu’à 60 mois chez des jeunes femmes. Cependant certains points ne sont à établir comme la persistance à long terme de cette immunité chez les adolescents des deux sexes de 9-15 ans, la capacité de protection croisée contre d’autres génotypes d’HPV, l’immunogénicité de ce vaccin dans les populations d’immunodéprimés, à haut risque d’infection évolutive à HPV et l’interférence éventuelle avec d’autres vaccins, autres que le vaccin hépatite B, administrés concomitamment.
II.6. CONCLUSION : Depuis les années 1970, le dépistage des anomalies cytologiques du col utérin par frottis cervicovaginal et par colposcopie constituait la seule démarche préventive du cancer du col mais le taux de couverture de cet examen est encore de très loin insuffisant et l’interprétation parfois délicate nécessite une lecture par un cytopathologiste entraîné. À la fin des années 1990, des progrès décisifs ont été réalisés dans le domaine de la vaccination préventive contre les HPV. Les premiers essais cliniques des vaccins prophylactiques disponibles sont en faveur d’une efficacité et d’une innocuité de ces vaccins chez l’Homme. Avec le recul dont on dispose, il semble qu’ils confèrent une immunité sur plus de cinq ans et probablement dix ans. La stratégie vaccinale proposée comporte une vaccination en trois injections selon un schéma zéro–un–six ou zéro–deux–six mois.
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Synthèse Bibliographique
Néanmoins, il a été décidé la mise en place d’un plan de gestion des risques adapté afin de
LES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
à l’aide de la technique des frottis, en combinant celle-ci à la recherche et au typage des HPV génitaux, restera indispensable. La surveillance épidémiologique devra porter sur la répartition des génotypes impliqués dans les condylomes et les lésions de haut grade avant vaccination puis après la mise en place de celle-ci chez les vaccinées et les non-vaccinées. Si le taux de couverture est élevé, on peut penser que, grâce à une immunité de masse, on assistera à une redistribution de la circulation des HPV y compris chez les non-vaccinées. La mise au point et l’évaluation de vaccins anticancéreux tel le vaccin anti-papillomavirus est enthousiasmant et doit permettre, sur le plan théorique avec une couverture vaccinale importante, de prévenir la quasitotalité des cas du deuxième cancer le plus fréquent chez la femme.
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Synthèse Bibliographique
Parallèlement à la mise en place de cette vaccination, la poursuite du dépistage du cancer du col
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
III. Les Nanobodies un nouveau concept dans l’ingénierie des anticorps:
La technologie des anticorps recombinants a été rapidement progressée durant les deux dernières décennies, principalement à cause de leur intérêt dans le domaine de la thérapie humaine. La possibilité de sélectionner des anticorps spécifiques humains par la technologie « phage display » et de prouver leur affinité, stabilité et la quantité exprimée par évolution moléculaire a poussé considérablement ce domaine. La technologie de l’hybridome de souris décrite par Köhler et Milstein en 1975 a représenté une étape importante dans le développement de la technologie des anticorps et a ouvert la voie à la thérapie par les anticorps monoclonaux pour émerger (AcsM) (Köhler and Milstein, 1975). En 2005, 18 types d’anticorps monoclonaux produits ont été sur le marché et plus que 100 autres dans le procès clinique ; il été claire que les anticorps produits par ingénierie sont devenus des produits biopharmaceutiques. En effet, à partir de 2008, l’ingénierie des anticorps est prédite à plus que 30% des revenues totales des produits mis sur le marché et qui sont approuvés par l’organisation de « Food and Drug Administration (FDA) » pour l’usage clinique, la majorité de ces produits sont présentés sur le site de la FDA : http://www.fda.gov (Holliger and Hudson, 2005; Pavlou and Beslsey, 2005; Reichert and Pavlou, 2004). Les anticorps sont des molécules complexes constituées généralement de chaines lourdes et de chaines légères. Elles contiennent des oligosaccharides attachés par des liaisons N-glycosidiques au domaine constant de la seconde chaine lourde (CH2) qui est nécessaire pour la fonction effectrice de l’anticorps et pour retenir un temps de demi-vie plus long dans le sérum. Bien que les chaines lourdes (Utsumi and Karush 1964) et légères (Yoo et al. 1967) peuvent retenir leurs capacités de neutraliser les antigènes, leurs affinités et leurs solubilités diminuent considérablement (Ward et al. 1989). Par contre, les extrémités N-terminales des domaines variables des chaines lourde (VH) et légère (VL) ; sont suffisantes pour la neutralisation des antigènes (Sundberg and Mariuzza 2002). De tels anticorps peuvent être produits sous forme de fragment monovalent (Fab) ou bien sous forme de simple chaine Fv (scFv) dont les domaines VH et VL sont rejoins par un peptide de liaison. Leurs production dans les cellules microbiennes est souvent lourde, surtout lors de la production de formes multivalentes et ceci à cause du domaine d’association.
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Synthèse Bibliographique
III.1. Introduction :
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
Récemment, des fragments recombinants de moindre taille, par exemple fragments monovalents
les anticorps simple domaine) sont à présent produits comme alternatives crédibles. Ces fragments retiennent la spécificité de neutralisation de la totalité de l’anticorps monoclonal mais peuvent être produits d’une manière plus économique et peuvent posséder d’autres propriétés et capacités pour une gamme d’applications de diagnostique ainsi que thérapeutiques (Holliger and Hudson, 2005). Les fragments simple chaine Fvs représentent une forme populaire dans laquelle les domaines VH et VL sont rejoints par un polypeptide linker flexible empêchant leur dissociation. Les anticorps de type Fab et scFv comprenant les deux domaines VH et VL retiennent habituellement leur spécificité et leurs affinités par rapport à l’IgG correspondant, bien qu’ils présentent une pharmacocinétique améliorée de pénétration dans les tissus (Harmsen and De Haard, 2007; Holliger and Hudson, 2005). Un grand intérêt est repris pour l’ingénierie des anticorps lors de la découverte chez deux types d’organismes ; les camélidés (Camel et llamas) et les poissons cartilagineux (exemple le requin), d’un domaine variable à affinité évoluée appelé VHH ou Nanobody pour les camélidés (Figure 1b) et V-NAR pour les requins (Figure 1c) qui surmontent une structure équivalente au domaine constant Fc comme un composant intégratif et crucial pour leur système immunitaire (Hamers-Casterman et al., 1993; Harmsen et De Haard, 2007; Holliger et Hudson, 2005; Roux et al., 1998). Les « Nanobodies » représentent les plus petits fragments intacts neutralisant les antigènes, avec seulement 15 KDa de masse moléculaire et 2.5nm de diamètre et environ 4nm de hauteur (Cortez–Retamozo et al., 2004; Revets et al., 2005). Ces fragments d’anticorps possèdent des avantages très significatifs pour des applications biotechnologiques et médicales. Ils sont exprimés en grande quantités chez les microorganismes et possèdent une grande stabilité et solubilité. En outre, ils sont très répondus dans la construction de plus grosses molécules et les systèmes de sélection comme les phages, les levures, et ribosomes display (Harmsen et De Haard, 2007).
III.2. Structure des VHH ou « Nanobodies » : Les anticorps conventionnels sont constitués de deux chaines lourdes et deux autres légères identiques deux à deux reliées entre elles par des ponts disulfures. Pour le type le plus abondant des anticorps circulants, Immunoglobuline G, la région charnière est de structure étendue du a sa
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Synthèse Bibliographique
classiques (Fab, scFv et des variant recombinants comme les diabodies, triabodies, minibodies et
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
richesse en proline, ainsi elle est vulnérable au attaques protéolytiques. En fait, cette molécule fixation d’antigène, et un troisième fragment Fc qui manque de spécificité aux antigènes (Roitt et Delves, 2001) Figure 1a. Les anticorps IgG des Camelidés (comme Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca and Lama vicugna) forment une exception étonnante à ce paradigme de leur sérum qui contient aussi une fraction considérable d’anticorps à chaine lourde (AcsHc).
Figure 26. Représentation schématique de différentes formes d’anticorps, montrant la molécule d’IgG intacte classique et les immunoglobulines VHH-Ig des camélidés et le Ig-NAR de requins. La structure des VhH-Ig des camélidés et le Ig-NAR de requins ressemble à celle des immunoglobulines comprenant une paire d’homodimère de deux chaines des domaines V-like et C-like, dans lequel le domaine variable est actif indépendamment tout seul. Les Ig-NARs comprennent un homodimère de chaine variable (V-NAR) et cinq domaines constants C-like (C-NAR). Une variété de fragments d’anticorps sont représentés ; Fab, scFv, simple domaine VH, VhH, V-NAR et d’autres formes multimériques comme les minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies et les chimioconjugués Fab’ (les tailles en kilodaltons sont approximatives).
Philipp H. and Peter J.H. (2005) Nature Biotechnology. Les AcsHc des Camelidae possèdent une structure unique comprenant un seul domaine variable (VHH ou Nanobody), la région charnière et les deux domaines constants (CH2 et CH3) Figure 22. Ces derniers présentent une grande homologie avec la région Fc (CH2-CH3) des anticorps ~ 72 ~
Synthèse Bibliographique
peut être facilement partagée in vitro en deux fragments Fab identiques chacune avec un site de
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
classiques (Muyldermans et al., 2008). Ces AcsHc sont dépourvus du premier domaine de la d’épissage de l’ARNm. L’absence du domaine CH1 explique l’absence de chaine légère dans l’AcsHc, au niveau de ce domaine se repère le lieu d’ancrage de la chaine légère. Par conséquent, l’AcsHc évolue naturellement pour conférer plus de spécificité pour la neutralisation des antigènes et la grande affinité par les trois CDRs de l’anticorps conventionnel ou de ses dérivés (Muyldermans, 2001 ; Revets et al., 2005). III.3. Donc, c’est quoi les Nanobodies ? Les Nanobodies ou VHH sont les plus petits fragments intacts capables de neutraliser les antigènes, seulement 15 kDa, comprenant la totalité de la capacité de neutralisation des antigènes évoluée pour être fonctionnelle en absence totale de chaines légères (Cortez-Retamozo et al.,
S11
L11
2004 ; Revets et al., 2005).
Figure 27. Représentation schématique des différences entre VH et VHH basées sur la comparaison de séquences de clones d’ADNc. La position de la CDR entre les cadres de lecture est indiquée. La CDR1 et CDR3 du VHH sont plus longues que celles pour les VH, et sont généralement connectés par un pont disulfure (ligne en orangée). Les substitutions d’acides aminés au niveau des régions Framework 1 et 2 sont représentées. Les nombres référant les positions des acides aminés le long de la séquence correspondent à la numération de Kabat (Kabat et al., 1991).
Ils ont été découverts à la fin de l’année 1980 au niveau le sang de dromadaire par le professeur Raymond Hamers de l’université de Vrije à Bruxelles (Belgique) (De Haard, 2008). Les ~ 73 ~
Synthèse Bibliographique
région constante (CH1) qui est présente dans le génome mais elle est excisée durant le processus
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
structures en solution et cristallines de plusieurs Nanobodies ont été résolues et montrent que d’ancrage des VH des immunoglobulines conventionnels (Ahmadvand et al., 2008 ; Revets et al., 2005). Lorsqu’on observe les structures des boucles de neutralisation d’antigène des Nanobodies on trouve qu’elles dévient énormément de ce qu’on connait pour les anticorps humains et de souris. Cette découverte fournit une évidence pour dire que les boucles des Nanobodies possèdent un répertoire de structure plus large que celui observé pour les anticorps conventionnels VH. En plus, les régions CDR3 des Nanobodies sont en moyenne plus longues que celles du VH pour 12 à 9 acides aminés, respectivement, tandis que pour les Nanobodies dérivés du dromadaire une chaine de 16 à 18 acides aminés est fréquemment observée, bien que pour les lamas, une fraction considérable des Nanobodies semble avoir un CDR plus réduit de moins de 6 acides aminés. La séquence des Nanobodies contient aussi des substitutions d’acides aminés au niveau du cadre de lecture qui ne sont pas observés pour les domaines VH qui se fixent aux VL. Ces substitutions ont évolué pour compenser l’absence du domaine VL au niveau du site de fixation de l’antigène et elles confèrent probablement une flexibilité plus importante pour le VH. Les substitutions des acides aminés hydrophobes en acides aminés hydrophiles (V37F ou V37Y, G44E, L45R et W47G) dans la 2ème ORF sont accessibles chez les Nanobodies (les résidus de cette région du VH interagissent avec le domaine VL et sont très bien conservés durant l’évolution). Par conséquent, ils sont assignés pour améliorer leurs solubilités (Harmsen, 2007; Muyldermans, 2001; Revets et al., 2005; Riechman and Muyldermans, 1999; Roovers, 2007).
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Synthèse Bibliographique
leurs structures de base est représentées par deux chaines α similaires au niveau du point
Synthèse Bibliographique
LES « NANOBODIES » UN NOUVEAU CONCEPT DANS L’INGENIERIE DES ANTICORPS
Figure 28. Réarrangement des gènes VDJ pour la formation des anticorps VHH
Il était démontré que les Nanobodies possèdent une grande homologie (approximativement 90%) avec le carde de lecture des VH humains et pour l’utilisation dans la thérapeutique, peuvent être humanisés jusqu’à 99% en effectuant quelques petites substitutions dans la région Framework 2 (Harmsen et De Haard, 2007 ; Vaeck 2004). Cette homologie entre les Nanobodies et les Framework de VH humains ouvre la voie de production d’anticorps simple domaine contenant le minimum de résidus non humains formant à partir desquels des agents de la thérapie (Davies et Riechmann, 1994 ; Tanha, 2001).
III.4. Propriétés biochimiques et fonctionnelles des Nanobodies : Les anticorps conventionnels possèdent plusieurs propriétés importantes, exemple leur grande affinité et leur sélectivité pour les cibles, leur facilité de découverte et la faible toxicité cellulaire (Ablynx, 2005). Les Nanobodies sont devenus alors plus meilleurs parce que, en plus de ces caractéristiques, ils possèdent d’autres avantages technologiques et biophysiques qui leur permettent d’être plus performants que les anticorps conventionnels dans différents cas (Ablynx, 2005 ; Revets et al., 2005).
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Premièrement, les VHH sont de petites protéines ayant le dixième de la taille des anticorps avec plus d’efficacité et peuvent neutraliser des cibles inhabituelles ou des épitopes cachés. En deuxième lieu, les différents types de Nanobodies sont plus homogènes ne montrant aucun signe de dimérisation spontanée au contraire des scFv qui dimérisent souvent en scFv2. En plus, le simple domaine mature du petit VHH rend de cet anticorps le meilleur candidat pour produire des anticorps bispécifiques ou immuno-conjugués par l’établissement d’une jonction entre les gènes codant pour les VHH, une enzyme ou bien une toxine au niveau de l’unité d’expression. Ces anticorps sont naturellement solubles dans les solutions aqueuses et n’ont pas de tendances pour agrégation, probablement du à la substitution des résidus hydrophobes par des résidus hydrophiles dans la région Framework 2 par comparaison aux VH des anticorps conventionnels qui interagissent au niveau des régions hydrophobes avec les domaines CH1 et VL. Comme conséquence, l’expression séparée des domaines VH permettent tout simplement de former des corps d’inclusion ou bien à des domaines repliés exposant des pièces hydrophobes qui les rendent cohésives (Muyldermans, 2001). D’autre part, les anticorps VHH sont hautement stables à la température, ainsi ils retiennent 80% de leur activité de neutralisation après une semaine d’incubation à 37°C en indiquant que les VHH possèdent une durée de demi-vie importante. Ainsi, leurs points de fusion varient entre 67 et 78°C (De Genst et al., 2006). En plus de leur résistance à la température, les Nanobodies présentent une grande stabilité face à l’effet dénaturant des agents chao-tropiques en présence des protéases et aux pH extrêmes. Donc, ce type d’anticorps est considéré capable de rester actif dans les conditions extrêmes comme celles au niveau de l’estomac et de l’intestin créant des opportunités pour l’administration orale de ces anticorps pour traiter des maladies gastro-intestinales (Ablynx, 2005; Harmsen and De Haard, 2007; Revets et al., 2005). Ainsi, la combinaison de telles caractéristiques est propre aux anticorps VHH et non pour d’autres.
III.5. Production des anticorps VHH recombinants : Le clonage d’un répertoire de fragments d’anticorps à partir d’un animal immunisé dans un vecteur phagique et sélection par technique de phage display, est devenue une méthode de routine dans la dernière décennie pour sélectionner des molécules ciblant des antigènes bien
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Synthèse Bibliographique
conventionnels (De Genst et al., 2006; Harmsen and Haard, 2007), ils pénètrent dans les tissus
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spécifiques (Muyldermans, 2001 ; Revets et al., 2005). A nos jours, par l’application de la cellules B antigène-spécifique. Généralement, l’ADNc est préparé à partir de lymphocytes récupérés de sang de périphériques, isolés à partir de dromadaire immunisé ou de lamas (Ablynx, 2005).
Figure 29. Alignement des séquences d’acides aminés au niveau des chaines variables d’anticorps conventionnel (VH), chameau (VHH) et de requin (V-NAR). Mêmes couleurs attribuées pour les différentes régions de CDR que les figures précédentes. En rose : motif hydrophile dans le FR2. Les séquences sont déduites de domaines VH anti-lysozyme (mAbVH), VHH (cAb Lys3), et V-NAR qui sont représentés dans la figure a, b et d. VHH s+16a est un anticorps bloquant une enzyme, dérivé de Lama immunisé avec des cellules T murines ecto-enzyme AR T2.2. Par conséquence, le répertoire de Nanobodies complètement mature in vivo chez un animal immunisé peut être amplifié par une seule paire d’amorces. Une technique de Nested PCR est nécessaire pour produire plus de matériel et pour inclure des sites de restriction pour des buts de clonage (Muyldermans, 2001). Après le clonage des fragments d’anticorps générés dans le vecteur d’expression approprié, une banque de Nanobodies contenant le répertoire des sites de reconnaissance intacts est obtenue sous forme mature (Arbabi Ghahroudi et al., 1997). A cause de la maturation in vivo des AcsCH, de petites banques d’environ 106-107 gènes de Nanobodies individuels sont obtenues habituellement lors de son isolement avec des affinités de nano molaire pour leurs antigènes (Arbabi Ghahroudi et al., 1997 ; Cortez-Retamozo, 2004 ; Muyldermans, 2001).
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Synthèse Bibliographique
technologie de nano clonage, il est possible de cloner directement les Nanobodies à partir de
Synthèse Bibliographique
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Figure 30. Diagramme schématique du domaine VHH des chaines Lourdes des anticorps de camélidés. a : les trois CDRs (Complementarity Determining Regions) du paratope de neutralisation de l’antigène sont représentées comme boucles colorées : CDR1 rouge, CDR2 vert, CDR3 bleue. b : le pont disulfure canonique connecte les régions Framework 1 et 3 (FR1 et FR3) dans les deux feuillets β du domaine de l’immunoglobuline indiqué en jaune. Plusieurs anticorps de camélidés contiennent un pont disulfure (S-S) additionnel connectant les régions CDR3 et CDR1 (chameaux) ou le début de CDR2 (lamas). H : (Hinge) région charnière, M : domaine transmembranaire de l’isoforme de membrane, G : site de Glycosylation, S : codon Stop de l’isoforme secrétée. Wesolowski et al., (2009) Med Microbiol Immunol. L’affinité des anticorps simple domaine peut souvent être prouvée par imitation in vitro, par exemple grâce à la méthode de mutagenèse dirigée des sites des régions CDR et des ponts plus éloigné de l’antigène immobilisé sous des conditions de faibles stringences (températures ~ 78 ~
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élevées, concentrations faibles ou importantes de sels, des bas ou hauts pH, et de faibles
(hcAbs) sont exprimés et purifiés à partir du périplasme de bactéries E. coli à des niveaux plus importants que ceux d’anticorps conventionnels. Les sdAbs disposent généralement d’une stabilité importante et peuvent être produits dans les levures, plantes et cellules de mammifères (Harmsen et De Haard 2007) Les sdAbs recombinants présentent plusieurs avantages en comparaison avec les anticorps conventionnels et les fragments simples chaines variables (scFv) telles que la grande stabilité, la capacité importante de repliement, et leurs pénétration importante dans les tissus in vivo (Muyldermans 2001 ; Cortez-Retamozo et al., 2002 ; Dumoulin et al., 2003) qui plaident pour l’utilisation des Nanobodies dans les différentes applications biotechnologiques et médicales. En plus de ces caractéristiques, les anticorps simple domaine peuvent être clonés et exprimés sous différentes formes par la fusion avec d’autres protéines ou peptides, ainsi pour étendre leur utilisation pour certains diagnostics et/ou applications thérapeutiques (Conrath et al., 2001). Par exemple, leur fusion à des protéines fluorescentes pour les utiliser comme sondes (Fluorobody) afin de suivre le chemin vers l’antigène dans les cellules (Rothbauer et al., 2006 ; Olichon et Surrey 2007). Le clonage en tandem de deux molécules sdAbs connectées par un peptide linker donne naissance à un bivalent de plus haute affinité pour l’antigène (Conrath et al., 2001). Le bivalent produit peut être aussi exprimé à l’état couplé à un domaine Fc d’un anticorps conventionnel, exemple d’un IgG1 humain ou de souris. En raison de leur capacité de repliement et leur grande stabilité dans des conditions environnementales différentes, des sdAbs également ont été dirigés avec succès vers le cytosol en éliminant le peptide signal (Gueorguieva et al., 2006) et aux vésicules intracellulaires telles que les chloroplastes (Jobling et al., 2003) ou le réticulum endoplasmique (Serruys et al., 2009) par génétique de fusion pour viser le trajet de la protéine. Le succès remarquable des anticorps anti-TNF-α conventionnels (Tumor Necrosis Factor) dans la thérapie du rhumatisme articulaire et d'autres maladies inflammatoires (Feldmann 2002) ont alimenté la recherche pour d'autres outils thérapeutiques basés sur l’utilisation des anticorps. Beaucoup de nouveaux réactifs basés sur les anticorps ont été par conséquent autorisés pour le traitement des maladies auto-immunes et des allergies, aussi bien que pour l’immunothérapie des cancers (Lonberg 2008).
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Synthèse Bibliographique
concentrations d’antigènes). Les Acs simple domaines dérivant des camélidés et des requins
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Les Nanobodies sont produits habituellement à des quantités de 10mg/l lorsqu’ils sont exprimés ainsi que des systèmes d’expression autre que la bactérie peuvent être utilisés. De plus grandes quantités de Nanobodies produites par des champignons (joosten et al., 2005) et des souches de levures ont été obtenues (Frenken et al., 2000 ; Rahbarizadeh et al., 2006; Thomassen et al., 2002), avec une sécrétion chez Saccharomyces cerevisiae à des quantités >100 mg/l à partir de simples cultures et >1g/l à partir de fermentation à fed batch. Soit >1Kg de Nanobodies sont obtenus de 15m3 de fermentation (Harmsen et De Haard, 2007 ; Muyldermans, 2001).
III.6. Applications biotechnologiques et médicales des Nanobodies : Les Nanobodies sont distingués des autres anticorps conventionnels par leurs propriétés uniques de taille, solubilité, stabilité intrinsèque, reconnaissance d’épitopes inhabituels ou cachés, pénétration dans différentes cavités et sites actifs de cibles d’enzymes, facilité et rapidité de découverte et fabrication de médicaments…. Ces caractéristiques vont surement conduire à des applications médicales et biotechnologiques importantes dont les Nanobodies doivent surpasser les autres types d’anticorps (Revets et al., 2005). A nos jours, plusieurs laboratoires les Nanobodies sont utilisés comme des thèmes de recherche et dans différentes applications thérapeutiques ou de diagnostic (Muyldermans et al., 2008). Plusieurs maladies ont été efficacement traitées par des Nanobodies ; ainsi ils ont été utilisés comme cibles pour des enzymes toxiques ou pour bloquer des interactions moléculaires spécifiques. Les Nanobodies peuvent être utiles pour différentes applications biotechnologiques. Par exemple, le criblage et le traçage d’antigène dans des cellules vivantes peuvent être réalisés grâce à de Nanobodies fluorescents spécifiques de protéines endogènes, mais leurs modifications post-traductionnelles et les composés non protéiques restent invisibles et ne peuvent pas être étudiés. Récemment, des protéines de fusion appelées « Chromobodies » comprenant un Nanobody spécifique d’un antigène lié à une protéine fluorescente sont synthétisés pour surmonter ce problème. Ces chromobodies peuvent reconnaitre et cibler l’antigène dans les différents compartiments subcellulaires durant la phase S de synthèse chromatinienne et la mitose (Rothbauer et al., 2006).
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Synthèse Bibliographique
chez E. coli (Arbabi Ghahroudi et al., 1997). Le processus de production peut être plus important
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Malgré tous ces étranglements de détermination des structures à travers la cristallographie et
Synthèse Bibliographique
diffraction aux rayons X, la production actuelle de cristaux reste la plus critique.
Figure 31. Structure en 3D de l’action d’inhibition de l’enzyme par l’anticorps sdAbs dérivé de chameau et par le hcAbs de requin. Image générée par le programme PyMOL. Trois boucles CDR colorées comme pour la figure 30. a : lysozyme de poulet en complexe avec un hcAbsV-NAR inhibiteur de requin (pdb code 1t6v). Le V-NAR se trouve en contact avec l’enzyme seulement par les régions CDR1 et CDR3, ce dernier se prolonge et bloque le site actif. b : lysozyme de poulet en complexe avec un sdAbs inhibiteur de chameau (pdb code 1mel). Le CDR3 se prolonge à l’intérieur du site actif et le bloque. c : lysozyme de poulet en complexe avec son substrat (pdb code 1 lsz). d: lysozyme de poulet en complexe avec VL et VH domaines d’un anticorps monoclonal de souris (pdb code 1 mlc). La surface plane d’interaction avec l’anticorps conventionnel est située loin du site actif de l’enzyme.
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Dernièrement, des techniques variées ont été développées pour dépasser cet obstacle majeur. Des stabilisation de la protéine d’intérêt et par la création de plusieurs surfaces de contact. Récemment, la cristallisation de l’Epsl : Epsl pseudopilin (qui forme la partie centrale du pseudopilus du système de sécrétion sophistiquée type 2 de la bactérie, hétéro dimère de Vibrio vulnificus), a été beaucoup accélérée par l’utilisation du Nanobody (Lam et al., 2009). Le VHH-pigFc est un anticorps à chaine lourde composé d’isotype de Fc de porc lié à un Nanobody, cet anticorps chimérique est utilisé pour générer des anticorps monoclonaux contre des isotypes d’IgG de porc (Muyldermans et al., 2008). Donc, les Nanobodies avec leurs petites tailles qui leurs permettent une particularité de neutralisation des antigènes dans des régions obstruées telles que les tumeurs, ainsi avec leurs immunogénicité très faibles et leurs affinités très importantes doivent être idéalement placés comme nouvelle classe d’anticorps pour des applications médicales et thérapeutiques.
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Synthèse Bibliographique
protéines naturelles peuvent efficacement prouver la probabilité d’obtenir des cristaux par la
Matériel & Méthodes
SYSTEMES D’EXPRESSION ET CELLULES HOTES
I. LES SYSTEMES D’EXPRESSION UTILISES : I.1. Le système Levure « Pichia pastoris » : Pendant les deux dernières décennies, la levure Pichia pastoris fut un système d’expression de grand intérêt dans la production des protéines hétérologues surtout de petite taille. Plusieurs souches mutantes de Pichia pastoris sont disponibles pour l’expression des protéines recombinantes (GS115, KM71, S1186). La souche utilisée dans ce travail est la souche sauvage X33. C’est une souche qui produit la protéase Kex2 responsable du clivage du peptide signal d’adressage extracellulaire au moment de la maturation de la protéine recombinante. Elle contient le gène sauvage de l’alcool oxydase I (AOXI) et permet d’obtenir des transformants de type Mut+. Les vecteurs plasmidiques désignés pour l’expression des protéines hétérologues dans cette levure possèdent des caractéristiques communes. La cassette d’expression est l’une des caractéristiques les plus intéressantes de ce système ; elle contient dans l’ordre ; un promoteur fort inductible qui est le promoteur du gène AOXI suivi par un ou plusieurs sites de restriction nécessaires pour l’insertion des gènes d’intérêt et la séquence de terminaison de transcription du gène AOXI de P. pastoris et qui dirige la polyadénylation en 3’ chez les ARNm. Des caractéristiques additionnelles présentes dans certains vecteurs d’expression dans Pichia et qui dirigent des fonctionnalités spécifiques selon la nécessité. Pour la sécrétion extracellulaire des protéines recombinantes, il y a des vecteurs spéciaux qui possèdent une construction spéciale de d’ADN immédiatement après le promoteur AOX1 et qui codent pour un peptide signal de sécrétion. Le peptide le plus adopté est la pré-pro séquence signal du facteur α de S. cerevisiae. Une série de vecteurs utilisés pour l’expression dans Pichia c’est la série des pPICZ, contenant le gène Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus. Ce gène confère la résistance au antibiotique zéocine chez E. coli, les levures et autre organismes eucaryotes. Ces vecteurs donnent aussi le choix pour l’expression de protéines couplées à une étiquette Histidine grâce aux His6 et myc épitopes qui peuvent être ajoutés à l’extrémité C-terminale des protéines exprimées.
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Matériel & Méthodes
MATERIEL :
SYSTEMES D’EXPRESSION ET CELLULES HOTES
I.2. Le vecteur d’expression pPICZαA : place de larges gammes de vecteurs d’expression y compris les vecteurs pPICZ et pPICZα pour l’expression de protéines chez les souches X33 et GS115 de Pichia. Ces vecteurs sont conçus pour le clonage avec une construction simple ou multiple de la cassette, l'expression à haut niveau, ainsi que la détection et la purification rapides de la protéine recombinante. Ces vecteurs contiennent le gène de résistance à l’antibiotique zéocine pour le choix direct des souches résistantes ayant intégré le transgène. L'augmentation du nombre de copies du gène d'intérêt au niveau des cellules recombinantes peut avoir comme conséquence le niveau d'expression plus important.
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Matériel & Méthodes
Pour faire le choix entre les souches de Pichia pastoris à utiliser, la firme Invitrogen a mis en
SYSTEMES D’EXPRESSION ET CELLULES HOTES
-
Un promoteur AOX1 inductible pour l'expression à niveau élevé dans Pichia pastoris ;
-
Un épitope c-myc pour la détection correspondante avec l'anti-myc anticorps ;
-
Une étiquette poly histidine du côté C-terminal (6xHis) pour la purification rapide avec la résine de nickel-chélation et la détection avec des anticorps anti-His ;
-
Résistance à la Zeocine™ pour le choix direct des clones intégrants plusieurs copies;
-
La série des vecteurs pPICZα comportent également le peptide signal de sécrétion du facteur-α pour le transport efficace des protéines vers le milieu extracellulaire.
I.3. Le système plante « Arabidopsis thaliana »:
- Classification classique : Règne : Plantae Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Ordre : Capparales Famille : Brassicaceae Genre : Arabidopsis - Nom binomial: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., 1842
Arabidopsis thaliana C’est une plante herbacée de 10 à 15cm de hauteur à l’état adulte. Elle est formée d’une rosette de feuilles de 2 à 5 cm de diamètre situées au ras du sol. Les fleurs de quelques mm de couleur blanche sont typiques des crucifères avec quatre sépales et quatre pétales disposés en croix, quatre étamines et un pistil. Le mode de reproduction est principalement l’autofécondation. Chaque fleur se transforme en un fruit qui est une capsule allongée appelée silique. Chaque silique contient de 30 à 50 minuscules graines. Cette plante est un organisme modèle pour la recherche génétique dans le monde végétal, ce fut le premier génome végétal séquencé ; les raisons de ce choix sont nombreuses :
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Matériel & Méthodes
Les vecteurs pPICZ et pPICZα offrent les dispositifs suivants :
SYSTEMES D’EXPRESSION ET CELLULES HOTES
- Taille réduite de la plante même à l’état adulte ce qui permet la culture d’un millier de
- Cycle de développement relativement court qui ne dure que deux mois pour passer graineplante-graine. - Plante très prolifique ; un plant produit environ 40000 graines. - Son génome est considéré parmi les plus petits génomes connus dans le monde végétal. - Absence d’intérêt économique sur cette espèce, ce qui facilite la diffusion des informations entre laboratoires. I.4. Vecteur binaire d’expression :
Figure 32: Vecteur Binaire pBI121 Conformément à la constitution des plasmides binaires, le vecteur binaire pBI121 comporte, outre que les fonctions de mobilisation dans E. coli et Agrobacterium tumefaciens deux systèmes de sélection dans les bactéries et dans la plante grâce à la présence du gène nptII, codant pour la néomycine phosphotransférase de type II et conférant la résistance à la kanamycine. Ce gène est encadré par le promoteur et le terminateur de la nopaline synthase (nos). Dans la plante, une copie synthétisée à partir de l’ADN-T flanqué par les bordures droite (RB) et gauche (LB) va être transférée vers le génome de la plante au moment de la transformation. Ce fragment comprend deux gènes placés en tandem comprenant au milieu le SMC (Site Multiple de Clonage).
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Matériel & Méthodes
pieds sur un mètre carré dans le laboratoire ;
SYSTEMES D’EXPRESSION ET CELLULES HOTES
Un gène gus A (uidA), codant pour la -glucuronidase, contrôlé par le promoteur du CaMV35S
I.5. Les souches bactériennes : Escherichia coli : utilisées dans les étapes de clonage pour le maintient et la multiplication des plasmides intacts et recombinants. - TOP10F’ : {lacIq, Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. - NEB5α : fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80Δ (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17. (Plus d’informations sur les génomes bactériens sont fournies dans la partie Annexe)
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Matériel & Méthodes
et servant comme gène rapporteur.
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
II. MILIEUX DE CULTURE SOLUTIONS ET PRODUITS UTILISES : -
Hypochlorite de Sodium : 50 % Tween 20 : 0.1 % H2O stérile : 49.9 %
Le milieu de culture des graines d’Arabidopsis utilisé est le milieu MS/2 additionné d’antibiotiques nécessaires dans le cas de sélection de graines transformées. Ce milieu est fourni par SIGMA sous le nom de Murashige and Skoog basal Salt mixture avec des vitamines en poudre (1000X).
II.2. Les antibiotiques :
Kanamycine
Eau
Concentration finale utilisée dans le milieu (g/ml) 50
Rifampicine
Méthanol
50
Gentamicine
Eau
40
Carbenicilline
Eau
250
Zéocine
Eau
25 (bactéries) 100 (Levures)
Antibiotique
Solvant
Les solutions d’antibiotiques sont stockées à -20°C. Elles sont additionnées aux milieux de culture dans des conditions d’asepsie. Les milieux de culture additionnés d’antibiotiques sont conservés à +4°C pour une durée maximale de 15 jours. II.3. Milieux LB (Lauria et Bertoni) pour de culture d’E. coli : Peptone pancréatique : 1% Extrait de levure : 0.5% NaCl : 1%
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Matériel & Méthodes
II.1. Solution de stérilisation des graines :
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Ajuster le pH à 7.2 avec une solution de NaOH 1M puis autoclaver.
II.4. Milieux de culture pour Pichia pastoris : Milieu YPD(A) pour culture et sélection des cellules de levure :
Extrait de levure 1% Peptone 2% Dextrose 2% Agar 2% pour milieu solide YPDA
10X D (20% Dextrose): Dissoudre 200g de D-glucose dans 1L d’eau puis autoclaver pendant 15 minutes ou bien filtrer pour stériliser. La durée de validité de cette solution est approximativement une année. Milieu BMGY (Buffered Minimal Glycerol medium for Yeast) pour induction de la Biomasse :
Extrait de levure : 1% Peptone : 2% Phosphate de Potassium : 100mM pH6 Yeast Nitrogen Base (YNB): 1.34% Biotine: 4x10-5% Glycérol: 0.5%
Pour 1L de milieu BMGY, autoclaver 700ml de YP. Ajouter ensuite : 100ml Tampon Phosphate de Potassium 1M pH6 ; 100ml YNB 10X ; 2ml Biotine 500X et 100ml Glycérol 10X. Garder le milieu BMGY à +4°C pour un maximum de 2 mois. Les solutions séparées peuvent être stockées à +4°C pendant une année. N.B: 500X B (0.02% Biotine): Dissoudre 20 mg de biotine dans 100 ml d’eau puis filtrer pour stériliser. Conserver à 4°C. La durée de validité de cette solution est approximativement une année. 10X GY (10% Glycérol): mélanger 100 ml de glycérol avec 900 ml d’eau. Stériliser par filtration ou bien par autoclavage. Conserver à température ambiante. La durée de validité de cette solution est approximativement une année. 10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) dans l’eau puis filtrer pour stériliser. Conserver à 4°C. La durée de validité de cette solution est approximativement une année.
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Matériel & Méthodes
Pour obtenir un milieu solide LBA ajouter 1.5% d’agar avant l’autoclavage.
Milieu BMMY (Buffered Minimal Methanol medium for Yeast) pour l’induction du promoteur AOXI et expression du gène:
Extrait de levure : 1% Peptone : 2% Phosphate de potassium : 100mM pH6 Yeast Nitrogen Base (YNB): 1.34% Biotine: 4x10-5% Methanol: 0.5%
Pour 1L de milieu BMMY, autoclaver 700ml de YP. Ajouter ensuite : 100ml Tampon Phosphate de Potassium 1M pH6 ; 100ml YNB 10X ; 2ml Biotine 500X et 100ml Méthanol 10X. Garder le milieu BMMY à +4°C pour un maximum de 2 mois. Les solutions séparées peuvent être stockées à +4°C pendant une année. N.B : 10X M (5% Méthanol): mélanger 5ml de Méthanol avec 95ml d’eau. Stériliser par filtration. Conserver à 4°C. La durée de validité de cette solution est approximativement deux mois. II.5. Solutions d’extraction d’ADN plasmidique par méthode de lyse alcaline : Solution I : -
Glucose 50 mM Tris-HCl 25 mM (pH 8) EDTA 10 mM (pH 8) Lysozyme 4 mg/ml Solution II :
-
NaOH 200 mM SDS 1% Solution III : Acétate de potassium 5M (pH 4.8)
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Matériel & Méthodes
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
-
Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM
II.6. Tampon de charge pour protéines : 1M Tris-HCl (pH6.8), 0,5M 2-ß mercaptoéthanol, 50% v/v glycérol, 10% SDS, 0,5% Bleu de bromophénol.
II.7. Gels de polyacrylamide pour PAGE-SDS: Gel de concentration : 5% polyacrylamide (avec un rapport de 29/1 en acrylamide/bisacrylamide) - 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 ; 0,1% (p/v) SDS ; 0,1% (p/v) APS ; 0,05% (v/v) TEMED. Gel de séparation : polyacrylamide 5 à 15% (avec un rapport de 29/1 en acrylamide/bisacrylamide) - Tris-HCl 0,275 M pH 8,8 - SDS 0,1% (p/v) - APS 0,1% (p/v) - TEMED 0,05% (v/v). Tampon Laemmli : Tris-HCl 25 mM pH 8,3 - glycine 0,25 M - SDS 0,1% (p/v)
II.8. Solutions pour technique western blot : Tampon de transfert (stock 10X) : - 14.4% Glycine - 3.03% Tris - 0.1% SDS - 20% Ethanol (à ajouter au moment de faire la solution 1X) Tris-Buffer-Salt solution pH 8 (TBS 10X) - 8.76% NaCl - 1.21% Tris - 0.4% HCl TBS-TWEEN 0.1% - 10% de solution stock TBS 10X - 0.1% TWEEN 20
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Matériel & Méthodes
Le tampon TE (pH8):
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Tampon de stripping pH 6.7:
Matériel & Méthodes
- 62.5mM HCl - 2%SDS - 100mM β-mercaptoéthanol Révélateur: - 109ml révélateur Kodak - 391ml eau Ultra pure Fixateur : - 109ml fixateur Kodak - 391ml eau Ultra pure
II.9. Enzymes et réactifs de biologie moléculaire : Enzymes de restriction : XbaI, BlpI, PmeI
New England Bio Labs
Les ADN Polymérase: Go Taq DNA polymerase
Promega
Taq DNA polymerase
New England Bio labs
Pfu DNA Polymerase
Bio Basic Inc. (Canada)
Reverse Transcriptases: MuMLV Reverse Transcriptase
Invitrogen
Autres enzymes: Phosphatase alcaline (CIP)
New England Bio Labs
RNase A
Bio Basic Inc. (Canada)
DNase I
Takara
T4 DNA Ligase
Promega
La P-NGase F
New England Bio Labs
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Marqueurs de Poids Moléculaire :
Matériel & Méthodes
Marqueurs pour ADN :
1kb DNA Ladder (BioBasic Inc) sur gel d’agarose à 0.8%
100pb DNA Ladder (BioBasic Inc.) sur gel d’agarose à 1.5%
1Kb DNA Ladder (Promega) sur gel d’agarose à 0.8%
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* MagicMark™ Western Protein Standard (Invitrogen)
MagicMark™ Standard séparé sur Gel NuPAGE® 4-12% Bis-Tris et ensuite transféré sur membrane de nitrocellulose. Le blot a été mis en contact avec 1:5000 dilution d’anticorps primaire spécifique de souris et la détection a été réalisée par des anticorps secondaires anti-IgG de souris couplés à la phosphatase alcaline et utilisant le WesternBreeze® Chromogenic Kit.
MagicMark™ Standard
* Dual Color Protein standard (BioRad)
Marqueur de taille de protéines standard séparées sur PAGE-SDS à 10%.
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Matériel & Méthodes
Marqueurs de Masse Moléculaire pour protéines :
MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
- Mini Elute Gel Extraction kit
Qiagen
- MiniElute Reaction Cleanup Kit
Qiagen
- QIAprep® Spin Miniprep Kit
Qiagen
- RNeasy® Mini Kit
Qiagen
- Wizard Genomic DNA purification kit
Promega
- SV Total RNA Isolation System
Promega
- ECL Plus Western Blotting Detection Reagents
Amersham
Autres réactifs: - Ni-NTA Sephrose
Qiagen
- Rabbit IgG anti 6His
Sigma
- Polyclonal anti-Rabbit IgG
Sigma
- Murashige & Skoog basal salt mixture (MS)
Sigma
- Murashige & Skoog Vitamin powder (1000X)
Sigma
- Agarose
Invitrogen
- Glycérol
SIGMA
- Lysosyme (from Chicken White Egg)
Bio Basic Inc.
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Matériel & Méthodes
Kits de biologie moléculaire :
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
PARTIE I. UTILISATION DE LA PLANTE ARABIDOPSIS THALIANA COMME SYSTEME D’EXPRESSION DE LA PROTEINE L1 DE LA CAPSIDE DU HPV16: III.1. Stérilisation des graines d’Arabidopsis thaliana : Mettre les graines d’Arabidopsis dans un tube eppendorf additionnées de 1ml de la solution de stérilisation vortexer pendant 2mn et centrifuger 30s à 10000rpm. Pipeter stérilement le surnageant et effectuer 4 cycles de lavage pour les graines dans des conditions d’asepsie. Chaque cycle consiste à ajouter 1 ml d’eau stérile, vortexer pendant 2 mn pour éliminer les traces du détergent, centrifuger 30s à 10 000rpm et jeter le surnageant. A la fin des étapes de lavage, récupérer les graines dans 1 ml d’eau stérile et stocker à +4°C.
III.2. Germination des graines sur milieu MS : Couler le milieu enrichi stérile (MS/2, saccharose à 1.5% et Agar à 0.8%) additionné de kanamycine à 50µg/ml dans des boites de pétri. Déposer les graines en suspension dans l’eau sur les boites, tout en veillant à les espacer pour que deux systèmes racinaires de deux plantes voisines ne s’entremêlent pas. Incuber à +4°C pendant 1 à 2 jours afin de synchroniser la germination et éliminer une éventuelle dormance. Placer les boites dans la chambre de culture réglée à une température de 22°C 3 sous éclairage continu (10000 Lux, lumière blanche). Dans les conditions optimales, la germination des graines se réalise dans 3 à 4 jours.
III.3. Culture des plantes sur terreau : Imbiber le terreau dans de l’eau puis l’essorer ; il ne doit pas être trop humide, puis le disposer dans des pots de culture de plantes. Les plantules d’environ 1cm (2 à 3 rosettes de feuilles) y sont transférées délicatement en évitant d’altérer les racines. Les pots sont placés dans la chambre de culture à une température de 22°C ±3 et sous éclairage de 10000 Lux selon une photopériode J/N de 16h/18h, une longue photopériode favorise la floraison.
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Matériel & Méthodes
III. METHODES:
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
pendant une heure chaque jour) et quelques fois avec la solution de fertilisation de manière à garder le terreau humide jusqu’à ce que les siliques deviennent brunes. III.4. Extraction d’ADN génomique de la plante Arabidopsis thaliana : Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) Broyer le matériel végétal (feuilles et tiges) dans un mortier utilisant de l’azote liquide jusqu’à obtenir une poudre. Peser 40mg dans un tube eppendorf stérile de 1.5ml puis ajouter 600µl de « Nuclei Lysis Solution », bien vortexer 1 à 3s et incuber 15mn à 65°C (Etape de lyse des cellules végétales). Laisser refroidir 5mn le lysat, puis ajouter 3µl d’RNase. Agiter pour homogénéiser ensuite incuber à 37°C pendant 15mn (Elimination des ARN totaux présents dans l’extrait). Ajouter 200µl de solution de précipitation des protéines et vortexer pendant 20s puis centrifuger 3mn à 13000rpm (Précipitation et élimination des protéines). Pipeter soigneusement le surnageant et le mettre dans un autre tube contenant 600µl d’isopropanol. Bien agiter par inversions puis incuber 10mn à température ambiante (Précipitation de l’ADN génomique). Centrifuger 1mn à 13000rpm, décanter doucement le tube et laver le culot par 200µl d’éthanol 70% (faire attention le culot est très lâche). Centrifuger 1 mn à 13 000rpm puis enlever l’éthanol doucement. Bien sécher le culot puis resuspendre le culot dans 100µl de solution de réhydratation et incuber 1h à 65°C ou bien laisser à +4°C pendant une nuit. Conserver l’ADN à 2-8°C.
III.5. Amplification du fragment spécifique du gène L1 de HPV16 (450pb) par PCR: Après broyage et extraction de l’ADN génomique des plantes, des amplifications PCR ont été réalisées à partir de 50ng d’ADN génomique, en présence de 15µmoles de dNTP, 10 pmoles de chaque amorce (MY09 et MY11) et 2.5U de l’enzyme GoTaq DNA polymerase. Le volume réactionnel est ajusté à 50µl avec du H2O dépourvue de nucléases. Le programme d’amplification effectué comporte 35 cycles (Dénaturation 1mn à 94°C, Hybridation 1mn à 42°C, Elongation 1mn à 72°C) précédés par une étape de dénaturation pendant 5mn et suivis d’une étape d’élongation pendant 10mn. Les produits PCR sont par la suite analysés sur gel d’agarose à 1.2% ~ 98 ~
Matériel & Méthodes
Arroser les plantes quotidiennement avec de l’eau (les pots sont placés dans 1 à 2 cm d’eau
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
III.6.1. Extraction des ARN totaux de plante Arabidopsis thaliana: SV Total RNA Isolation System (Promega) Protocole conçu pour une quantité de plante ≤ 30mg : Peser 30mg de poudre de matériel végétal broyé dans l’azote liquide et le mettre dans un tube eppendorf stérile. Ajouter 175µl de RNA Lysis Buffer et agiter 5 à 6 fois, ne pas vortexer ; puis additionner 350µl de RNA Dilution Buffer. Mélanger par inversions et centrifuger à 13000rpm pendant 10 mn. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 200µl d’éthanol absolu. Bien mélanger par pipetage puis transférer dans la colonne montée sur le tube collecteur. Centrifuger 1 mn à 13000 rpm, vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Ajouter 600µl de la SV RNA Wash Solution, centrifuger 1mn à 13000rpm puis vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Préparer ex-temporairement le milieu réactionnel de la DNaseI {40µl de Yellow Core Buffer, 5µl de MnCl2 (0.09M) et 5µl DNase I (10U/µl)} et le garder dans la glace. Déposer les 50µl de la solution de DNase I directement sur la colonne et incuber 15 mn à température ambiante. Ajouter 200µl de la solution DNase Stop et centrifuger 1 mn à 13000 rpm. Ajouter 600µl de SV RNA Wash solution et Centrifuger 1 mn à 13000rpm. Vider le tube et y remettre la colonne. Ajouter ensuite 250µl de SV RNA Wash solution, centrifuger 2 mn à 13000rpm puis transférer la colonne dans un tube eppendorf stérile et éluer l’ARN dans 100µl de Nuclease Free Water par une centrifugation de 1mn à 13000rpm. Stocker l’ARN à -70°C. III.6.2. Synthèse de l’ADNc par la Reverse Transcriptase : 0,25µg d’ARN totaux on est utilisés directement dans une réaction de synthèse d’ADNc. Cet ARN a été incubé avec 0,5µg d’oligodT à 80°C pendant 20mn pour créer une zone d’amorçage de la synthèse de l’ADNc. 5U de MuMLV (RT) avec le tampon à 1X, 15µmoles de dNTP sont incubés à 37°C pendant une heure. Le même protocole est appliqué dans le cas de plantes transgéniques que de plantes non transgéniques. A partir de 5µl du mélange réactionnel, on réalise l’amplification de l’ADNc en présence de 10µmoles de dNTP, 20nmoles de chaque amorce (MY11 et MY09) et 2.5U d’enzyme GoTaq DNA polymerase. Le volume réactionnel est de 50µl. ~ 99 ~
Matériel & Méthodes
III.6. Synthèse d’ADNc à partir des ARN totaux de plantes :
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
décrites précédemment. Ainsi les produits d’amplification ont été visualisés sur gel d’agarose à 1,2%.
III.7. Analyse des génomes des plantes Arabidopsis thaliana par Southern blot : Le nombre d’intégrations du gène L1 dans le génome de plantes Arabidopsis thaliana a été identifié grâce la technique Southern blot. Cette analyse a été effectuée utilisant l’ADN génomique de plantes suivant les instructions de Sambrouk et al. 1989. L’ADN génomique a été isolé à partir de 150mg de plantes transgéniques broyées et de génération T1 utilisant le kit Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). 10µg d’ADN génomique de chaque lignée transgénique ont été digérés avec l’enzyme XbaI puis séparés sur gel d’agarose à 0.8%. L’ADN est ensuite transféré sur filtre de nylon et fixé par exposition à la lumière UV pendant 5mn. Comme contrôle négatif on a utilisé l’ADN de plante non transgénique dans les mêmes conditions. Pour préparer la sonde radioactive, 25ng de produit PCR L1 (450pb) on été marqués à chaud avec le α-[32P] 2’-déoxycytidine 5’-triphosphate utilisant l’enzyme kleenow pendant 60mn à 37°C suivant la méthode d’amorçage au hasard (Amersham, Buckinghamshire, UK). III.8. Protocole d’extraction des protéines totales à partir de plante : 100µg de poudre de plantes transgéniques fraiches broyées ont été utilisés pour extraire les protéines totales. Ajouter 500µl de tampon d’extraction [50mM Tris–HCl (pH 6.8), 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM EGTA (Ethylen Glycol bis (2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-Tetraacetic Acid), 5mM β-Mercaptoéthanol, 1.5mM PMSF (Phenyl Methane Sulfonyl Fluoride) et 15% glycérol] et bien broyer avec un pilon. Vortexer pour bien mélanger. Les extraits ont été centrifugés pendant 5mn à 10000rpm et à 4°C. Un volume du surnageant a été additionné avec du tampon d’échantillon contenant le SDS. Après dénaturation à la température, 10 à 30µg de protéines totales ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12% (SDS-PAGE) puis transférées sur membrane de nitrocellulose (Hybond C; Amersham Pharmacia Biotech, Braunschweig, Germany).
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Matériel & Méthodes
40 cycles PCR ont été effectués selon le programme de la PCR réalisée dans les conditions
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
L’EXPRESSION DE L’ANTICORPS VHH22 : III.9. Extraction d’ADN plasmidique pPICZαA: On peut extraire les plasmides à partir des bactéries grâce à deux techniques différentes : la première repose sur une lyse alcaline et précipitation par l’éthanol, la deuxième utilise un kit d’extraction. III.9.1. Mini préparation par lyse alcaline : Le protocole suivant est optimisé pour extraction à partir de 1.5ml de culture bactérienne en phase stationnaire Préparer une culture bactérienne de nuit en inoculant 2ml de milieu LB additionné de zéocine à 25µg/ml avec une colonie bactérienne contenant le plasmide pPICZαA. Centrifuger 1.5 ml de la culture dans un tube eppendorf pendant 2mn à 10000rpm, resuspendre le culot obtenu dans 200l de TE et centrifuger une autre fois 2mn à 13000rpm (éliminer le LB contenu dans le culot bactérien qui contient des inhibiteurs des réactions enzymatiques). Resuspendre le culot dans 150µl de la solution I contenant le lysozyme, vortexer et incuber 5 mn sur glace (Etape de pré lyse). Ajouter 150µl de la solution II et mélanger doucement par inversions; la solution devient claire et visqueuse (Lyse des cellules bactériennes). Ajouter 350 µl de la solution III et inverser doucement pour mélanger ; la solution flocule (Etape de neutralisation des débris cellulaires et l’ADN génomique). Centrifuger 10mn à 13000rpm puis transférer le surnageant clair dans un nouveau tube contenant 600µl d’isopropanol froid (v/v) ; mélanger par inversions et incuber au moins 30 mn à température ambiante. Centrifuger 5mn à 10000rpm, laver le culot avec l’éthanol 70% puis sécher le culot sous la hotte. Suspendre le culot dans 30µl de TE. Garder le plasmide à -20°C.
III.9.2. Mini préparation de plasmides utilisant un système de purification sur colonne de silice : QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen) (Ce protocole est désigné pour la purification de plus que 50µg de plasmide à partir de 1-5ml de culture bactérienne de nuit). Centrifuger la culture bactérienne dans des tubes eppendorf pendant 2mn à 13000rpm puis resuspendre le culot dans 250µl de Tampon P1. Ajouter 250µl de Tampon P2 et mélanger par
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Matériel & Méthodes
PARTIE II. UTILISATION DE LA LEVURE PICHIA PASTORIS POUR
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
solution devient de couleur bleue. Ajouter 350µl de Tampon N3 et mélanger immédiatement par inversions. La solution flocule et revient incolore. Centrifuger 10mn à 13000rpm puis prendre le surnageant et le déposer sur la colonne mise dans le tube collecteur ; centrifuger 1mn à 13000rpm puis vider le tube collecteur. Recommandation : si la bactérie utilisée est de génotype endA+, ou bien une souche à haute activité nucléasique, laver la colonne avec 500µl de Tampon PB et centrifuger 1mn à 13000rpm. Laver la colonne avec 750µl de Tampon PE et centrifuger 1mn à 13000rpm, vider le tube collecteur et refaire une centrifugation d’une minute pour enlever le tampon résiduel. Pour éluer le plasmide, transférer la colonne dans un tube eppendorf et ajouter 100µl de tampon EB, incuber 1 mn à température ambiante puis centrifuger 1mn à 13000rpm. III.10. Amplification de l’ADNc du VHH22 par PCR utilisant des amorces spécifiques : La matrice utilisée dans cette réaction était un plasmide recombinant fourni par Dr. Balkiss Bouhaouala Zahar de l’Institut Pasteur de Tunis. 50ng de cette construction a permis d’amplifier la séquence correspondante en présence de 20pmoles de chaque amorce (sens et anti sens), 10µmoles de dNTP, et 2,5U d’enzyme High Phusion DNA polymerase dans un volume réactionnel de 50µl. Le programme de la PCR effectuée comprend ; une étape de dénaturation primaire à 95°C pendant 30s suivie de 35 cycles composés de : Dénaturation à 95°C pendant 6s, 20s d’hybridation à 57°C et 15s d’extension à 72°C. Une étape d’extension finale a été réalisée pendant 7mn à 72°C. III.11. Purification de l’ADN sur colonne de silice à partir du gel d’agarose : MiniElute Gel Extraction (Qiagen): Ce kit est conçu pour la purification d’un maximum de 5µg d’ADN double brin ayant une taille de 70pb-4Kb. Faire migrer les échantillons sur gel d’agarose à 1% à voltage moyen pour bien séparer les bandes du mélange analysé. Découper la bande d’ADN d’intérêt avec un scalpel propre nettoyé à l’alcool. Peser la bande du gel dans un tube vide et ajouter 3V de tampon QG pour 1V de gel ~ 102 ~
Matériel & Méthodes
inversions 4-6 fois. Dans le cas d’utilisation de la solution LyseBlue, s’il y a lyse bactérienne la
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
inversions chaque 2 à 3mn durant l’incubation. Pour un gel >2%, augmenter le temps d’incubation. Vérifier que la couleur jaune de l’échantillon n’a pas changé. Si la couleur vire vers l’orangé ou le violet, ajouter 10µl d’acétate de sodium 3M de pH 5.0 et mélanger. Ajouter 1V du gel en isopropanol, mélanger puis placer une colonne dans le tube collecteur et déposer le mélange là-dessus. Centrifuger 1mn à 13000 rpm (le maximum de la colonne est de 800µl). Déposer 500µl du tampon QG sur la colonne et centrifuger 1mn à 13000rpm. Vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Réaliser le lavage de la colonne avec 750µl du tampon PE ; centrifuger 1mn à 13000rpm. Si l’ADN purifié va être utilisé dans une réaction sensible aux sels, laisser l’échantillon en incubation avec le tampon PE pendant 2-5mn avant de centrifuger. Réaliser une autre centrifugation 1mn à 13000rpm pour la colonne vide pour éliminer le maximum de tampon PE. Placer la colonne dans un tube eppendorf stérile pour éluer l’ADN ; ajouter 10 à 30µl de tampon EB sur la colonne, laisser incuber 2-5mn à température ambiante puis centrifuger 1mn à vitesse maximale. Vérifier l’élution sur gel d’agarose à 1% en présence de BET. III.12. Traitement enzymatique de l’ADN : III.12.1. Digestion du vecteur pPICZαA avec XbaI : Dans un mélange réactionnel de 20µl, on a réalisé la linéarisation du vecteur pPICZαA (3µg) moyennant 15U d’enzyme XbaI et 1/10ème du volume en BSA. La digestion enzymatique est réalisée à 37°C pendant 1h30mn. Vérifier la réaction de digestion sur gel d’agarose à 1%. Pour inactiver l’enzyme, incuber 20mn à 65°C.
III.12.2. Traitement du vecteur par la Phosphatase Alcaline CIP : La déphosphorylation du vecteur linéarisé a été effectuée pour empêcher la recircularisation du vecteur au moment de la ligation. Dans un volume réactionnel de 25µl, le vecteur linéarisé (2,5µg) a été mis en incubation avec 15U de CIP (Calf Intestinal alcaline Phosphatase) à 37°C pendant une heure. ~ 103 ~
Matériel & Méthodes
(100mg). Incuber à 50°C pendant 10mn (jusqu’à dissolution totale du gel). Mélanger par
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Reaction Cleanup Kit et une fraction est vérifiée sur gel d’agarose.
III.12.3. Digestion de l’ADNc par XbaI : 2.5µg de produit PCR (ADNc de VHH22) ont été digérés par 15U d’enzyme de restriction XbaI dans un volume réactionnel de 25µl pendant 3h à 37°C. Cette digestion permet de libérer les sites de restriction des deux extrémités du produit PCR. Le produit de digestion est purifié ensuite sur colonne de silice et une fraction est vérifiée sur gel d’agarose. III.13. Purification de l’ADN directement à partir des réactions enzymatiques : MiniElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen) Ce kit est conçu pour la purification d’un maximum de 5µg d’ADN double brin ayant une taille de 70pb-4Kb. Ajouter 300µl de tampon ERC au mélange réactionnel et mélanger. (Si le volume de la réaction enzymatique est plus que 100µl aliquoter dans des tubes différents et ajouter à chacun 300µl de Tampon ERC). Vérifier que la couleur jaune de l’échantillon n’a pas changé. Si la couleur vire vers l’orangé ou le violet, ajouter 10µl d’acétate de sodium 3M de pH 5.0 et mélanger. Placer une colonne dans le tube collecteur et déposer le mélange là-dessus, centrifuger 1mn à 13000rpm. Déposer 500µl du tampon QG sur la colonne et centrifuger 1mn à 13000rpm. Vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Réaliser le lavage de la colonne avec 750µl de tampon PE et centrifuger 1mn à 13000rpm. Réaliser une deuxième centrifugation 1mn à 13000rpm pour la colonne vide pour éliminer le maximum de tampon PE. Placer la colonne dans un tube eppendorf stérile pour éluer l’ADN ; ajouter 10 à 30µl de tampon EB sur la colonne, laisser incuber 2-5mn à température ambiante puis centrifuger 1mn à 13000rpm. Vérifier l’élution sur gel d’agarose à 1% en présence de BET.
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Matériel & Méthodes
Le mélange réactionnel est ensuite purifié directement sur colonne de silice utilisant le MiniElute
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Selon la formule de calcul des rapports de quantité de vecteur et insert pour le clonage des gènes (voir Annexe), on a réalisé une ligation avec un rapport 2/1 Insert/Vecteur dans les conditions suivantes : Ligation contrôle Vecteur 0.45µg 0.45µg Insert 0.3µg T4 Ligase (20U/µl) 1µl Tampon 10X 1µl H2O Qsp 10µl > Incuber 1h à 16°C
III.15. Transformation des bactéries E. coli par les mélanges de ligation : Ajouter stérilement l’ADN plasmidique (10 à 100ng) à 50µl de bactéries compétentes NEB5α et mélanger doucement par le bout du doigt puis incuber le mélange pendant 20mn dans la glace. Réaliser le choc thermique par transfert du tube de la glace directement vers un bain marie réglé à 42°C pour une durée exacte de 30s puis de nouveau dans la glace pendant 5mn. Ajouter 950µl de milieu LB préchauffé, mélanger et incuber 1h sous agitation à 37°C. Etaler 10 et 100µl de la suspension bactérienne sur LBA additionné de l’antibiotique zéocine à 25µg/ml et incuber O/N à 37°C. III.16. Vérification du sens d’intégration de l’insert par digestion avec BlpI : Environ 1.5µg de vecteur recombinant ont été digérés avec 10U d’enzyme de restriction BlpI dans les conditions standards de la réaction avec un volume final de 25µl. Incuber pendant 30mn à 37°C puis visualiser le 10ème du volume réactionnel sur gel d’agarose à 1%.
III.17. Protocole de transformation de Pichia pastoris par la méthode de choc thermique : (Manuel technique: Easy Select Pichia expression Kit; Invitrogen) Ajouter ~3µg de vecteur recombinant linéarisé par PmeI à 50µl de levure compétente. Additionner 1ml de la solution II et agiter ;
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Matériel & Méthodes
III.14. Ligation pPICZαA- insert:
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
directement au choc thermique à 42°C pendant 10mn. Diviser la solution sur 2 tubes (525µl dans chaque tube) et ajouter 1ml de milieu de culture YPD. Incuber à 30°C pendant 1h pour favoriser la résistance à l’antibiotique zéocine puis centrifuger 5mn à 5000rpm et à température ambiante ; Jeter les surnageant et resuspendre les culots chacun dans 500µl de solution III. Combiner les deux suspensions dans un seul tube et centrifuger 5mn à 5000rpm. Resuspendre le culot dans 100 à 150µl de solution III et étaler les cellules sur milieu YPDA additionné de zéocine à 100µg/ml. III.18. Protocole d’extraction d’ADN génomique de levure : Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega) Dans un milieu YPD contenant la zéocine à 100µg/ml, mettre en culture des cellules de levure Pichia pastoris pendant 20h à 30°C sous agitation continue de 220rpm. Centrifuger 1ml de cette culture dans un tube eppendorf pendant 2mn à 13000rpm. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 293µl d’EDTA à 50mM. Ajouter 7.5µl de lyticase à 20mg/ml et pipeter délicatement pour mélanger. Incuber l’échantillon à 37°C pendant 30 à 60mn pour favoriser la digestion de la paroi cellulaire puis laisser reposer à température ambiante. Centrifuger l’échantillon à 13000rpm pendant 2mn et jeter le surnageant. Resuspendre délicatement le culot dans 300µl de solution de lyse (Nuclei Lysis Solution). Ajouter 100µl de solution de précipitation de protéines et vortexer vigoureusement pendant 20s. Laisser l’échantillon reposer pendant 5mn puis centrifuger 3mn à 13000rpm. Transférer le surnageant contenant l’ADN dans un nouveau tube eppendorf contenant 300µl d’isopropanol ; éviter de toucher le culot. Mélanger doucement par inversions jusqu’à obtention de précipité d’ADN visible puis centrifuger pendant 2mn à 13000rpm. Eliminer soigneusement le surnageant et laver le culot avec 300µl d’éthanol 70%. Centrifuger 2mn à 13000rpm puis aspirer le surnageant et sécher sous la hotte. Resuspendre le culot d’ADN dans 50µl de solution de réhydratation et incuber 1h à 65°C ou bien over night à 4°C. Pour éliminer l’ARN, ajouter 1,5µl d’RNase et incuber pendant 15mn à 37°C. Stocker l’ADN à 2-8°C. ~ 106 ~
Matériel & Méthodes
Incuber pendant 2h dans un bain marie à 30°C en mélangeant chaque 15mn ensuite procéder
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Kit (Qiagen) Avant de débuter la manipulation, préparer ex temporairement les solutions suivantes : Ajouter 10µl de β-mercaptoéthanol (β-ME) par ml de solution RLT. Préparer le tampon Y1 (1M Sorbitol + 0.1M EDTA pH 7.4) additionné de 0.1% β-ME et 50U Lyticase/Zymolase pour ≤ 5x107 cellules strictement avant utilisation. Récupérer les cellules (≤ 5x107 cellules) dans un tube de 15ml par centrifugation 5mn à 1500rpm et à 4°C. Enlever totalement le surnageant par aspiration, resuspendre le culot dans 2ml de tampon Y1 fraichement préparé puis incuber 10 à 30mn à 30°C en mélangeant de temps en temps. Centrifuger 5mn à 500rpm et enlever le surnageant délicatement. (Le surnageant résiduel va inhiber la lyse et diluer le lysat). Ajouter 350µl de tampon RLT et mélanger vigoureusement pour lyser les cellules. S’il ya du matériel insoluble, centrifuger 2mn à vitesse maximale et utiliser juste le surnageant pour terminer les étapes suivantes. Ajouter 1V (généralement 350µl) d’éthanol 70% au lysat et mélanger par pipetage. Ne pas centrifuger. Des précipités peuvent apparaitre à cette étape. Procéder immédiatement à l’étape suivante. Transférer l’échantillon (~700µl) sur la colonne RNeasy placée dans un tube collecteur. Fermer avec le bouchon et centrifuger 15s à 10000rpm. Si le volume de l’échantillon excède les 700µl faire des aliquotes. Etape Optionnelle : En cas de traitement avec DNase sur colonne, réaliser les étapes suivantes : a. Ajouter 350µl de tampon RW1 sur colonne et centrifuger 15s à 10000rpm pour laver la colonne b. Mettre 10µl de solution stock de DNase I avec 70µl de tampon RDD mélanger puis faire un coup de centrifugation pour récupérer le mélange. Ce dernier doit être déposé directement au milieu de la colonne (80µl) et incubé à 20-30°C pendant 15mn. c. Laver la colonne avec 350µl de tampon RW1 et centrifuger 15s à 10000rpm. Ajouter 700µl de tampon RW1 et centrifuger 15s à 10000rpm pour laver la colonne (cette étape peut ne pas être réalisée si le traitement DNase sur colonne est réalisé). Ajouter 500µl de tampon RPE et centrifuger 15s à 10000rpm pour laver la colonne. Laver la colonne une deuxième fois avec 500µl de tampon RPE et centrifuger 2mn à 10000rpm. ~ 107 ~
Matériel & Méthodes
III.19. Protocole d’extraction d’ARN totaux à partir de cellules de Levure: RNeasy® Mini
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Laisser incuber 2 à 5mn puis centrifuger 1mn à 10000rpm. Performer une deuxième élution dans les mêmes conditions que la précédente. La quantité obtenue sera 15 à 30% plus faible que celle obtenue dans la première.
III.20. Protocole de purification des protéines VHH22 (His6) par technique IMAC (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography) :
En 1967, Porath invente une méthode de couplage des protéines à des gels d'agarose et démontre que la chymotripsine fixée sur ce gel conserve son activité. Plus tard, les travaux de Porath et Sulkowski posent les fondations de ce qui est devenu quelques années plus tard une méthode de routine dans les laboratoires de biologie moléculaire (Porath et al 1975, Sulkowski 1985). Dans ces premiers développements, cette chromatographie d'affinité = IMAC (Immobilized-Metal Affinity Chromatography) a permis de purifier des protéines contenant naturellement des histidines. Le principe de cette chromatographie d’affinité repose sur la propriété de fixation des histidines sur des ions métalliques (C++, Ni++, Zn++ et Co++). Par génie génétique, on peut donc ajouter à la protéine que l’on veut purifier une étiquette composée de plusieurs histidines consécutives (généralement 6 mais on peut en avoir jusqu’à 10) Cette étiquette est capable d'interagir fortement avec les ions métalliques. On utilise cette propriété pour fixer la protéine ainsi étiquetée sur une résine chromatographique sur laquelle déjà chélaté un ion métallique.
En 1987, Hochuli introduit une nouvelle molécule, l'acide nitriloacétique (NTA), pour réaliser l'immobilisation du nickel sur les matrices de chromatographie (Hochuli et al 1987). ~ 108 ~
Matériel & Méthodes
Eluer l’extrait d’ARN dans un tube eppendorf stérile avec 30 à 50µl H2O dépourvue de RNase.
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Il complexe fortement le cuivre et le nickel qui sont de valence 6. Ces ions, une fois complexés, gardent 2 sites accessibles qui peuvent être occupés soit par des molécules d'eau soit par d'autres molécules (figure ci-dessous). Chargées avec du Ni2+, les résines Ni-NTA lient de manière très spécifique les protéines ou polypeptides présentant plusieurs histidines consécutives en surface. Après lavage des protéines non retenues, la protéine est ensuite éluée par une solution d'imidazole qui déplace la protéine de l'ion métallique par compétition. En effet, l’imidazole, de part sa structure, est capable d’interagir avec les ions métalliques de la même façon que l’histine. Si on en ajoute des quantités largement supérieures à celles de cet acide aminé, il y aura remplacement de l’interaction histidine/support d’affinité par une interaction imidazole/colonne. L’élution peut-être également être réalisée en baissant le pH, l'histidine va alors se protonner (base faible) et ne peut plus avoir de liaison de coordination avec le Ni-NTA. L’étiquette polyhistidine permettra donc la purification de la protéine de fusion.
Protocole expérimental : Toutes les étapes du protocole de purification sont réalisées à 4°C. Ainsi les incubations effectuées sont sous agitation sur une plaque à agitation orbitale pour veiller surtout au bon contact entre les protéines et la résine. Laver la résine avec 10V en H2O pendant 10mn pour éliminer les traces de tampon de stockage; Equilibrer la résine avec 10V en Tampon 1 (30mM Phosphate de Sodium pH7.5 ; 0.5M NaCl ; 10mM Imidazole). Cette étape permet d’éviter les fixations non spécifiques des protéines. Centrifuger à 5000rpm puis enlever le surnageant. ~ 109 ~
Matériel & Méthodes
L'acide nitriloacétique(NTA) est un complexant quadridentate, c'est-à-dire qu'il forme 4 liaisons.
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
sur la résine et laisser incuber pendant 1h. Centrifuger à 5000 rpm puis enlever le surnageant (fraction non fixée). A partir de cette étape tous les surnageants récupérés doivent être gardés. Laver la résine avec 2V en tampon 1. Centrifuger à 5000 rpm et récupérer le produit de lavage. Procéder à l’élution de la protéine avec tampons 2, 3 et 4 (V/V) en augmentant la concentration d’imidazole progressivement (les Tampons 2, 3 et 4 sont composés de : 30mM Phosphate de Sodium pH7.5 ; 0.1M NaCl et 100mM, 200mM et 300mM imidazole, respectivement). III.21. Séparation des protéines sur gel d’acrylamide en conditions dénaturantes SDSPAGE : L’électrophorèse sur gel acrylamide en conditions dénaturantes est une méthode d’analyse décrite par Laemmeli (1970). Séparant les protéines en fonction de leur géométrie, masse molaire et forme. Le SDS est un détergent anionique qui se fixe sur les protéines et rompt les liaisons hydrophobes leur donnant une charge globale négative. Son action, couplée à celle du DTT ou Mercaptoéthanol et la chaleur, permet la rupture des ponts S-S et la solubilisation des protéines. Les polypeptides dénaturés perdent leur structure tertiaire et deviennent des bâtonnets, entourés d’un nuage de charges. Ainsi sous l’action d’un champ électrique, les molécules sont séparées uniquement par effet de tamisage moléculaire. Et comme il existe une relation de linéarité entre le logarithme de la masse molaire et la mobilité électrophorétique sur gel, on peut déterminer le PM de la protéine d’intérêt en se basant sur une courbe de référence tracée sur échelle logarithmique à partir de protéines standards analysées dans les mêmes conditions.
III.21.1. Protocole de SDS-PAGE : Les protéines sont séparées par migration électrophorétique dans un gel de polyacrylamide après dénaturation par des détergents, des réducteurs et une élévation de la température. Les protéines chargées négativement par le SDS migrent en fonction de leur masse (Laemmli 1970). Le gel est composé de deux parties ; un gel de séparation sur lequel est coulé un gel de concentration. Les protéines sont reprises dans du tampon de charge et déposées sur le gel après dénaturation à 95°C pendant 5mn. La migration est conduite dans du tampon Laemmli sous un ampérage de 20mA pendant environ 2heures. Après la migration, le gel peut être coloré de diverses manières ~ 110 ~
Matériel & Méthodes
Charger l’extrait protéique (surnageant de la culture de levure) mélangé à 50% avec le tampon 1
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
la migration. Les tailles apparentes des protéines sont estimées par rapport à un marqueur de poids moléculaire (Bio-Rad). III.21.2. Révélation au nitrate d’argent : La coloration au nitrate d’argent est une méthode très sensible, elle assure une détection des protéines de l’ordre de nanogrammes. Les gels sont immergés dans une solution d’acide acétique/éthanol/Eau Milli-Q (50/10/40) pendant 30mn à 1h. Cette étape fixe les protéines dans le gel. Puis transférer dans une solution de sensibilisation à 5% éthanol/1% acide acétique et agiter pendant 15mn. Les traces résiduelles d’acide acétique et d’éthanol sont éliminées par 3 lavages successifs de 5mn dans l’eau Milli-Q. Les protéines sont ensuite sensibilisées à l’action du nitrate d’argent par un bain de thiosulfate de sodium à 0,2g/l pendant 1mn. L’excédent de thiosulfate est éliminé avec trois lavages à l’eau Milli-Q chacune 30s. Le gel est ensuite immergé dans une solution de nitrate d’argent 0,2% et 0,75ml/l de formaldéhyde 37% pendant 20 min. Les protéines sont révélées par une solution de développement composée de 200μl formaldéhyde 37%, 6% (m/v) carbonate de sodium et 2% (v/v) de la solution de thiosulfate de sodium. Agiter 2 à 5mn jusqu’à ce que la coloration convienne sachant qu’elle s’éclaircira avec la solution stop au moment opportun. Stopper la réaction avec une solution d’acide acétique 5% (v/v) puis agiter 5mn jusqu’à ce que la coloration convienne, celle-ci ne bougera plus. Conserver les gels dans l’eau milli-Q ou les sécher. III.22. Traitement de l’anticorps avec le Peptide N-Glycosidase F: Le Peptide N-Glycosidase F, aussi connue comme PNGase, est une enzyme purifiée à partir de la bactérie Flavobacterium meningosepticum et possède la propriété de cliver les liaisons entre l’Asparagine et le GlcNAc (N-Acétyl Glucosamine) des résidus mannose, hybride et complexes oligosaccharides dans les liaisons N-glycosidiques des glycoprotéines.
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Matériel & Méthodes
et séché. Le gel peut également être transféré sur une membrane de PVDF immédiatement après
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Dans un mélange de volume final de 10µl, combiner 1 à 20µg de glycoprotéine, 1µl de tampon 10X de dénaturation et de l’H2O si nécessaire. Dénaturer la glycoprotéine par incubation à 100°C pendant 10mn. Ajouter au mélange réactionnel 2µl de tampon de réaction G7, 2µl NP40 10%, 12µl PNGase et ajuster le volume final à 20µl avec de l’H2O. Incuber la réaction pendant 1h à 37°C. Ne pas utiliser plus que 1/10ème du volume en PNGase.
III.23. Technique western blot: III.23.1. Transfert des protéines: Les protéines dans le gel sont chargées négativement, elles migrent donc vers le pôle positif. Ainsi, pour recueillir les protéines sur la membrane, nous plaçons le gel du côté du pôle négatif, et la membrane du côté du pôle positif. Le tampon de transfert permet d’une part de faire passer le courant électrique, et d’autre part, d’extraire les protéines du gel pour l’amener sur la membrane. Nous appliquons un champ électrique de 30 volts pendant 90mn environ. En colorant le gel au bleu de coomassie après le transfert, nous pouvons évaluer la quantité de protéines restante sur le gel.
III.23.2. Fixation des anticorps : Après transfert, les membranes sont lavées 2 fois 15mn dans 0.1% TBS-TWEEN sur agitateur basculant pour exposer les sites antigéniques. Incubation ensuite dans 0.1% TBS-TWEEN/5% lait (ou BSA 3%), sur agitateur basculant pendant une heure à température ambiante (ou toute la nuit à +4°C). L’albumine va se fixer de façon non spécifique sur tous les sites antigéniques existants. Lavage 2 fois 15 mn dans 0.1% TBS-TWEEN avec agitation. Incuber avec l’anticorps primaire anti-6xHis dilué au millième dans 0.1% TBS-TWEEN/1% BSA pendant la nuit à 4°C (ou 1h à température ambiante ou même pendant le weekend à 4°C) sous agitation. Le premier anticorps reconnait spécifiquement la protéine d’intérêt et va déplacer l’albumine liée non spécifiquement. Pour cette manipulation nous utilisons des tubes falcons de 50ml dans lesquels nous enroulons la membrane, la face contenant les protéines vers l’intérieur, ou des boites avec de la membrane contenant les protéines vers le haut, que nous plaçons sur agitateur giratoire en chambre froide.
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Matériel & Méthodes
Conditions expérimentales :
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
secondaire dilué au dix millièmes dans TBS/TWEEN 0.1%/BSA 1%, 30mn à température ambiante sous agitation. L’anticorps secondaire reconnait les IgG de l’espèce où l’anticorps primaire a été produit. L’anticorps secondaire qu’on a utilisé est un anti-IgG de souris. Laver la membrane 2 fois 15mn dans TBS/TWEEN 0.1%, sur agitateur basculant puis passer à la révélation à l’ECL utilisant le kit Amersham ECL Plus™ Western Blotting Detection Reagents.
III.24. Test d’activité ELISA: Préparer la plaque ELISA par fixation des deux toxines AahI et AahII dans les puits (0,2µg) pendant la nuit. Laver 2 fois les puits avec 250µl de tampon PBS-T (10 mM tampon phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20). Ajouter 200µl de solution de saturation contenant 5% de lait poudré et incuber pendant 45mn à 37°C. Laver les puits deux fois puis déposer l’anticorps VHH22 dans les puits et incuber pendant 45mn à 37°C. Laver les puits 6fois avec le tampon PBS-T puis déposer la solution d’anticorps secondaire anti-His couplé à la peroxydase. Laisser incuber pendant 45mn à 37°C puis laver les puits 2fois avec 250µl de solution de lavage. Révéler la fixation des anticorps secondaires par ajout de 100µl de solution de révélation composée d’une gélule d’OPD (O-Propylène Diamine) dissoute dans 20ml d’H2O pour avoir un substrat contenant 0.4 mg/ml OPD, 0.4 mg/ml hydrogène peroxyde d’urée et 0.05 M citrate de phosphate, pH 5.0. Une coloration se développe à son maximum après 20 à 30mn. Ne pas attendre pour comparer les colorations car au bout de quelques minutes les différences s’estompent. Il faut stopper la réaction avec 100µl d’acide sulfurique à 2N. Déterminer la densité optique au niveau d’un lecteur de plaques ELISA qui assure la mesure de la DO à 450nm.
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Matériel & Méthodes
Effectuer deux lavages 2 de 15mn dans 0.1% TBS-TWEEN puis incubation avec l’anticorps
Résultats & Discussion
PARTIE I. MISE AU POINT DE L’EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DANS LE SYSTEME ARABIDOPSIS THALIANA
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CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
Introduction : Le cancer du col de l’utérus, second cancer de la femme dans le monde, est responsable d’environ 250 000 décès par an au niveau mondial (Parkin et al., 1999). Des travaux récents ont permis de découvrir que la quasi-totalité des cancers du col sont estimés liés aux infections par les papillomavirus humains, l’un des virus sexuellement transmissibles. Au moins 40 types de HPV infectant la région génitale ont été identifiés, mais vu que l'infection cervicale génitale des femmes par les types 16 et 18 est fortement associée au cancer du col de l'utérus, ces types de HPV ont suscité la majeure partie de l'attention des études scientifiques. La protéine L1 dont la masse moléculaire est de 55kDa, représente la majeure protéine structurale de la capside virale des Papillomavirus Humains de type 16. Cette protéine glycosylée, de séquence hautement conservée entre les différents types de Papillomavirus, porte les antigènes de surface spécifiques du genre et du type. La portion C-terminale de la protéine L1 d’HPV16 comporte deux signaux de localisation nucléaire qui permettent son transport dans le noyau cellulaire où il y a lieu l’assemblage des différents constituants du virus. Cette protéine possède la capacité de s’auto-assembler toute seule in vivo pour former des capsides dans les systèmes d’expression eucaryotes sous forme de particules virales (VLPs: Virus Like Particles) portant les antigènes de surface capables d’induire des réactions immunologiques spécifiques. Le gène codant pour la protéine L1 a été identifié, séquencé et exprimé dans différents systèmes d’expression eucaryotes comme le tabac (Hong-Li et al., 2005; Maclean et al., 2007)
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
et Pichia pastoris (Boschi et al., 2009). Ainsi des vaccins reconnaissant plusieurs types de Papillomavirus ont été développés par différents laboratoires pour être approuvés par la FDA et autorisés pour la commercialisation. Le premier vaccin qui a déjà obtenu l'autorisation de mise sur le marché (AMM) européen est le Gardasil®. Ce vaccin quadrivalent recombinant développé par le laboratoire Merck, contient certaines protéines de la capside des virus de type 6, 11, 16 et 18 et qui permet une protection de 90 % contre les lésions cervicales génitales. Le deuxième vaccin anti papillomavirus est le Cervarix®, vaccin bivalent fabriqué par le laboratoire GlaxoSmithKline à partir de protéines L1 de type 16 et 18 et qui ont été développés pour des traitements préventifs pour les filles de 15 à 23ans. Dans notre laboratoire, la plante Arabidopsis thaliana représente l’un des systèmes d’expression utilisés pour la production des protéines recombinantes. En s’appuyant sur les caractéristiques de cette plante, elle a été choisie pour exprimer la protéine L1 de la capside du Papillomavirus humain de type 16. Cette plante est désignée parmi les meilleurs hôtes dans l’assemblage des protéines recombinantes et la formation de particules virales. D’après des travaux réalisés par Thomas et al. 2007, la protéine L1 de HPV11 exprimées chez Arabidopsis représente moins de dégradation protéolytique que celle exprimée chez le tabac. Ainsi que son assemblage en particules virales est plus meilleur chez Arabidopsis. Dans un travail précédent, l’ADNc correspondant (1,5Kb) a été intégré dans le génome de cette plante suivant la stratégie binaire utilisant les caractéristiques du vecteur pBI121 et la bactérie Agrobacterium tumefaciens souche GV3101 qui contient le plasmide (Ti) de virulence désarmé. La méthode de transformation adoptée était la méthode de transformation indirecte in planta qui est très utilisée dans la transgénèse végétale.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
Les plantes transformées sont conçues de génération T0. La copie d’ADN-T s’insère dans un seul des chromosomes homologues au niveau des ovules localisés au niveau des fleurs de cette plante (hémizygotie). La descendance de cette génération représentée par de minuscules graines ont donné naissance à des plantes transgéniques comprenant chacune une seule copie du gène d’intérêt et qui sont résistantes à l’antibiotique kanamycine ; ces plantes représentent la première génération de plantes transgéniques T1. Ces dernières ont été analysées par PCR sur ADN génomique et on a pu révéler des plantes transgéniques qui ont incorporé le gène d’intérêt par amplification d’une séquence spécifique de taille 450pb. Les études réalisées et discutées dans le présent travail concernent les plantes transgéniques obtenues à partir de la génération T2. Nous avons analysé la transmission du gène cloné chez les plantes des générations T2 et T3 par PCR sur ADN génomique. L’expression et la stabilité de l’ARNm du gène L1 ont été confirmées par technique RT-PCR. Grace à la technique Southern blot nous avons montré que c’était une seule copie d’ADN-T intégrée dans le génome des plantes transgéniques. Ainsi la protéine L1 recombinante produite chez ces plantes a été identifiée par western blot utilisant des anticorps spécifiques.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
Résultats & Discussion : 1- Analyse de l’intégration du gène L1 dans le génome des plantes transgéniques et détermination du nombre de copies: Grâce à la sélection sur antibiotique, nous avons obtenu les plantes résistantes de génération T2 à partir de la culture des graines issues de T1. Selon le mode de reproduction de la plane Arabidopsis thaliana, qui est l’autofécondation, 25% de la descendance ne contient aucune copie d’ADN-T, donc elles vont être éliminées suite à leur sensibilité à l’antibiotique kanamycine. L’ADN génomique de certaines plantes a été extrait par un kit et 50ng ont été utilisés comme matrice dans une réaction d’amplification par PCR en présence de 2,5U de Taq ADN polymérase et 0,04µM d’amorces internes MY09/MY11 amplifiant une séquence de 450pb spécifique du gène L1. Les bandes d’amplification obtenues à partir de la PCR sur ADN génomique de plantes T2 et T3 montrent bien que les plantes transgéniques analysées contiennent au moins une copie du gène d’intérêt dans leurs génomes. Pour que le résultat soit certain et fiable, nous avons utilisé des contrôles positif et négatif, dans les mêmes conditions pratiques. Comme contrôle positif on a utilisé une séquence d’ADN spécifique comme matrice amplifiée par les mêmes amorces et dans la même température d’hybridation. Dans des conditions pratiques pareilles, nous avons réalisé une amplification contrôle sur l’ADN génomique de plantes non transgéniques. Le résultat montre
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
bien la spécificité des amorces utilisées et l’absence de complémentarité entre elles et l’ADN de la plante. L’ADN-T est une molécule transposable qui peut se déplacer dans le génome des plantes grâce à la présence des bordures droite et gauche qui assurent son intégration et son déplacement. La confirmation de la stabilité d’un gène au niveau du génome d’une plante transgénique doit être alors déterminée après 5 ou 6 générations successives. En effet, cette stratégie doit être adoptée surtout lors de l’utilisation de la plante transgénique dans un objectif commercial. En appliquant la technique PCR on a pu amplifier une séquence de 450pb spécifique du gène L1 et ainsi démontrer avec succès sa transmission vers les générations T2 et T3 de plantes transgéniques. Plusieurs facteurs peuvent influencer sur l’expression des transgènes chez les systèmes hétérologues. On sait actuellement que le transgène silencieux ne provient pas seulement à partir des mécanismes de transcription couramment associés à la méthylation du promoteur du transgène (Meyer 2000) mais le phénomène est aussi post-transcriptionnel ; i.e. le transgène est transcrit mais l’ARNm résultant est instable (Meins 2000). Un tel phénomène est fréquemment associé à une intégration multiple du transgène dans la cellule. Les plantes transgéniques produites par des méthodes directes de transfert d'ADN (par exemple, polyéthylène glycol ou transformation par des liposomes, électroporation, ou le bombardement de particules) intègrent souvent un grand nombre de copies du transgène de façon répétée en tandem ou inverses, dans un même ou multiples loci (Kohli et al., 1999). Ce
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
phénomène peut effectivement avoir un effet négatif sur l’expression du transgène dans le système recombinant. En vue de déterminer le nombre d’intégrations de l’ADN-T au niveau des plantes transgéniques sélectionnées, 10µg d’ADN génomique purifiés à partir de 3 lignées de plantes transgéniques de la génération T3 et digérés avec l’enzyme XbaI ont été utilisés dans une technique d’hybridation moléculaire sur support solide : technique Southern blot. Le marquage à chaud de la sonde utilisée pour l’hybridation a été réalisé par la méthode de radioactivité utilisant le 32P, ainsi la révélation était par autoradiographie. L’auto radiogramme révèle une seule tâche d’hybridation qui représente une seule copie du gène d’intérêt. La copie d’ADN-T intégrée a été révélée au niveau d’un fragment d’ADN de taille d’environ 8Kb.
2- Synthèse de l’ADNc de L1 à partir des plantes transgéniques grâce à la RT-PCR : Bien que la transformation par Agrobacterium ait habituellement comme conséquence un nombre de copie inférieur d’ADN-T insérés en tandem au niveau d’un même locus (Jorgensen et al., 1987), toutefois le transgène peut être silencieux même en cas de simple intégration (Elmayan et Vaucheret 1996). Pour s’assurer de la fonctionnalité du gène intégré au niveau du système hétérologue plante, nous avons eu recours à la technique RT-PCR. Pour cela, les ARN totaux ont été extraits grâce à un kit de purification et 250µg d’ARN ont été le sujet d’une réaction de réverse transcription puis amplification de l’ADNc double brin par PCR utilisant toujours les mêmes amorces spécifiques MY09 et MY11.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
Les résultats montrent bien que la fonction du gène L1 intégré n’était pas affectée au niveau transcriptionnel.
3- Analyse de l’expression de la protéine L1 recombinante par western blot : La cellule végétale comporte de nombreuses protéases qui assurent diverses fonctions de régulation, de maturation protéolytique et la demi-vie (turnover) des protéines (Schaller, 2004). Bien qu'essentielles au métabolisme cellulaire, ces protéases représentent une menace importante contre la stabilité des protéines recombinantes qui peuvent subir des clivages partiels, parfois délétères pour leur activité biologique (Outchkourov et al., 2003; Badri et al., 2007a). Le produit final devient alors plus hétérogène, s'éloignant parfois considérablement de sa contrepartie naturelle. Dans d'autres cas, la protéolyse peut être totale, entraînant des rendements faibles (Takaiwa et al., 2007). En système hétérologue, la dégradation des protéines exogènes peut se produire in planta, durant les phases d'expression, ou ex planta, durant les diverses étapes post-récolte, en cours d'extraction ou de purification. Dans ce dernier cas, la protéolyse peut être importante car l'homogénéisation et le débris des cellules libèrent les protéases et autres composés dénaturants des différents organites (en particulier la vacuole), directement dans l'extrait brut (Rivard et al., 2006). Diverses stratégies ont été envisagées depuis quelques années pour limiter la dégradation protéolytique in planta comme ex planta.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
Les protéines totales de plantes transgéniques ont été le sujet d’une analyse par technique western blot afin de montrer l’expression effective de la protéine L1 recombinante exprimée dans les différentes parties aériennes de la plante (Tige et Feuilles). En effet, les protéines totales ont été extraites à partir de plantes transgéniques et de plantes non transgéniques. Ces dernières ont servi comme contrôle négatif dans la réaction. Le résultat du western blot réalisé montre que la protéine L1 a été produite sous forme recombinante dans la plante Arabidopsis thaliana ayant la taille de ~55kDa. Ce résultat est confirmé par l’utilisation de protéines VLP produites chez le tabac comme contrôle positif. Ainsi l’absence de signal au niveau des plantes non transgéniques permet de prouver la spécificité des anticorps anti L1 utilisés. Quelques petites dégradations remarquées au niveau de la protéine L1 exprimée et qui expliquent l’effet de l’étape d’extraction.
Conclusion : Dans cette partie nous avons illustré le succès de l’expression d’une protéine d’intérêt thérapeutique et pharmacologique chez la plante Arabidopsis thaliana. Etant un modèle dans la transgénèse végétale, nous avons choisi cette plante pour exprimer et produire la protéine L1 majeure de la capside du papillomavirus humain de type 16 sous forme recombinante. Plusieurs essais ont été en faveur de la production de cette protéine sous forme recombinante vue qu’elle possède la capacité de s’auto-assembler dans certains systèmes hétérologues en particules virales considérées à effet prophylactique. Ces particules sont produites et commercialisés sous forme de vaccins capables d’induire une réaction immunologique protectrice une fois administrées à un individu quelconque.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
La production des vaccins est un domaine très sensible et très coûteux, donc l’utilisation des plantes Arabidopsis thaliana comme système d’expression représente un avantage intéressant et un atout considérable dans ce domaine. Il nous reste pour cette partie de vérifier la formation des particules virales dans la plante ainsi que leur capacité de déclencher une réaction immunogène, donc capable d’être utilisée comme vaccin prophylactique. Toutefois, les vaccins conçus pour une commercialisation doivent passer par des étapes de tests et validation afin de décider l’autorisation de leur mise sur le marché.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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Résultats & Discussion
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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Résultats & Discussion
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Résultats & Discussion
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Résultats & Discussion
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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Résultats & Discussion
CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA
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CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
L’ADN, support du patrimoine génétique de tous les organismes vivants, est une molécule stable mais qui peut occasionnellement subir des modifications. Un ensemble de mécanismes de réparation complexes permet à la cellule de contrecarrer ces changements de séquences afin de sauvegarder l’intégrité du génome et d’assurer le maintient de l’information génétique. Les plantes, en raison de leur immobilité, doivent faire face couramment à différents agents mutagènes. Afin de maintenir l’intégrité de leur génome, les végétaux doivent se défendre des erreurs de réplication de l’ADN et acquérir un système particulièrement efficace qui les protège des mutations et des recombinaisons génétiques. L’intégration de l’ADN-T qui contient le gène d’intérêt dans le génome de la cellule hôte est réalisée de manière aléatoire, plutôt dans les régions transcrites. Lorsqu’on génère une plante transgénique, l’ADN s’intègre dans un seul des chromosomes homologues. Pas de locus correspondant sur l’autre chromosome ; c’est l’hémizygotie. Seulement la moitié des gamètes porteront le transgène en question. En effet, la première génération de plantes transgéniques est hétérozygote vis-à-vis du gène. La T2 représente la première génération de plantes transgéniques ayant reçu l’ADN-T contenant le gène d’intérêt comme locus. Donc on s’est intéressé à l’étude de la transmission du gène vers cette génération ainsi que sa fonctionnalité par des techniques de biologie moléculaire simples et efficaces.
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Résultats & Discussion
INTRODUCTION :
CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
plante
Arabidopsis
thaliana
est
l’autofécondation, la génération des plantes T2 se compose théoriquement de trois types de plantes: - Des plantes homozygotes contenant deux copies du gène et qui représentent 25% du total de la descendance; - 50% de plantes hétérozygotes comprenant une seule copie du gène ; - Et 25% homozygotes ne contenant aucune copie d’ADN-T et qui ne vont pas pousser sur milieu sélectif additionné d’antibiotique kanamycine. Des plantes résistantes de cette génération T2 ont été le sujet d’une analyse par PCR et RTPCR afin de déterminer la stabilité et la fonctionnalité du gène d’intérêt.
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Résultats & Discussion
Comme le mode de reproduction de la
CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
Dans le but de suivre la transmission du gène L1 cloné chez Arabidopsis thaliana, des plantes transformées de deuxième génération T2 sont sélectionnées sur milieu contenant l’antibiotique kanamycine et sont analysées par amplification d’un fragment spécifique de taille 450pb par technique PCR utilisant des amorces spécifiques MY09 et MY11. Ceci étant le début d’un processus de suivie des générations pour confirmer la stabilité du transgène. Au niveau de cette génération on voulait faire une mise au point de protocoles fiables et applicables à la plante utilisée comme système d’expression. Vérifier les contrôles positifs et négatifs, optimiser les amplifications PCR de point de vue quantités de matrice, quantité d’amorces utiles, température d’hybridation convenable… afin de mettre au point les conditions expérimentales nécessaires tous au long des générations qui suivent. Les résultats de PCR montrent bien que cette génération de plantes transgéniques contient l’ADN-T inséré et par conséquence le gène d’intérêt codant pour la protéine L1. Comme contrôle négatif à la réaction on a utilisé un ADN génomique extrait de plantes non transgéniques en vue de déterminer la spécificité des amorces utilisées. Ainsi le contrôle positif est représenté par un vecteur pBI121 recombinant contenant le gène L1 inséré dans l’ADN-T. La transmission de l’ADN-T vers les plantes transgéniques de la deuxième génération ne suffit pas pour confirmer la fonctionnalité du gène d’intérêt. Pour cela nous avons vérifié son niveau transcriptionnel. En fait, nous avons extrait les ARN totaux grâce à un kit de purification, on a synthétisé l’ADNc par une transcriptase reverse et ensuite on l’a amplifié par PCR utilisant les mêmes amorces spécifiques MY09 et MY11. ~ 139 ~
Résultats & Discussion
Résultats & Discussions :
CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
transcrit en ARNm.
Conclusion : Dans cette partie on s’est intéressé à la première génération ayant reçu une répartition génotypique du gène intégré selon le mode de transmission des gamètes dans le cas de l’autofécondation (Plantes Transgéniques (T2)). En effet, un locus est définit au niveau de l’un des chromosomes de la plante et qui est transmis des plantes de première génération vers la deuxième et ainsi vers les autres. La stabilité et la fonctionnalité de cette séquence dépend de plusieurs facteurs influençant sur le développement du génome des plantes. Les deux techniques utilisées PCR et RT-PCR peuvent déterminer la stabilité du gène au niveau de l’ADN génomique et prouver sa fonctionnalité.
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Résultats & Discussion
Cette technique nous a montré que le gène L1 intégré est fonctionnel et il a était
Résultats & Discussion
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Résultats & Discussion
CHAPITRE II. ANALYSE DE L’EXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2
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PARTIE II. MISE AU POINT DE L’EXPRESSION D’UNE PROTEINE ANTICORPS RECOMBINANTE DE TYPE VHH DANS LE SYSTEME PICHIA PASTORIS
- CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
INTRODUCTION:
Dans les pays tropicaux et subtropicaux, l’envenimation scorpionique représente un sérieux problème de santé publique. Le nombre élevé des décès enregistrés d’après la Direction de Soin et de Santé de Base (DSSB) à cause des envenimations scorpioniques reste inacceptable. D’après des études statistiques, le scorpion Androctonus australis hector est responsable de 80% des cas d’envenimations scorpioniques dans les pays du nord de l’Afrique. Quelques sérums anti-scorpioniques utilisés sont généralement des anticorps de type F (ab’)2 et Fab obtenus par protéolyse aménagée d’immunoglobulines dirigés contre tout le contenu du venin (Ismail 1994). Récemment, l’identification des anticorps à simple chaine variable lourde (VHH), appelés aussi « Nanobodies », chez les camélidés vient d’ouvrir de nouveaux horizons sur les méthodes de traitement de ces envenimations scorpioniques ainsi que pour la sérothérapie en général. Ce type d’anticorps a montré aussi une grande capacité d’être un outil de choix dans le traitement thérapeutique de plusieurs maladies et cancers ainsi que pour des applications biotechnologiques et industrielles. Dans cette partie on montre l’utilisation de la levure Pichia pastoris comme système d’expression hétérologue afin de produire une protéine anticorps de type VHH dirigée contre la neurotoxine AahI’ du scorpion Androctonus australis hector. Des travaux récents ont été effectués au sein du Laboratoire des Venins et Toxines de l’Institut Pasteur en vue de produire des Nanobodies ayant une capacité de neutralisation importante vis-à-vis de cette toxine. L’un des clones sélectionnés qui a montré une affinité
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Résultats & Discussion
CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
importante à la toxine d’intérêt a été produit sous forme recombinante chez E. coli mais les résultats n’étaient pas satisfaisantes de point de vue activité et quantité de protéine produite. Nous avons donc envisagé dans ce travail d’exprimer cet anticorps chez le système eucaryote Pichia pastoris afin de démontrer de nouvelles caractéristiques et propriétés visant à augmenter sa production et améliorer son activité de neutralisation. A nos jours, la levure Pichia pastoris a gardé une place importante dans le domaine de la biotechnologie et de la production des protéines recombinantes. Ce système unicellulaire possède d’énormes capacités dans la synthèse et le bon repliement des protéines hétérologues surtout celles de petite taille (Joosten et al., 2003). Elle possède les caractéristiques des cellules procaryotes dans la simplicité morphologique et structurale, dans le coût réduit de culture et maintient cellulaire, et en même temps elle possède les caractéristiques des cellules eucaryotes dont la capacité de réaliser les modifications transcriptionnelles et post traductionnelles. Ainsi, la possibilité d’utilisation des promoteurs inductibles comme celui du gène de l’alcool oxydase AOXI favorisant le choix du système Pichia pastoris dans la production des protéines toxiques. En plus des énormes performances de ce système d’expression, des travaux récents menés par Harmsen et al., ont montré en 2009 que la N-glycosylation des anticorps VHH augmente la capacité de sécrétion des protéines hétérologues dans le milieu extracellulaire et améliore de trois à cinq fois leur capacité de neutralisation vis-à-vis de l’antigène. A la lumière de ces données, nous avons choisi Pichia pastoris pour exprimer l’anticorps VHH22. Les résultats obtenus montrent bien que cet anticorps a été exprimé entièrement dans le milieu extracellulaire sous forme glycosylée. En se basant sur la présence de l’étiquette histidine additionnée du côté C-terminal, notre protéine a été purifiée sur colonne de Nickel Sépharose avec un rendement qui a dépassé les 95%.
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Résultats & Discussion
CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
Quant à la modification glucosidique remarquée, nous avons montré aussi que le traitement avec une Glucosidase; (peptide N-Glycosidase F) permet de vérifier que l’anticorps produit peut être déglycosylée in vitro. L’activité de neutralisation de l’anticorps recombinant synthétisé a été analysée par test ELISA contre les toxines AahI’ et AahII utilisant des quantités variables d’anticorps recombinant. Les résultats étaient satisfaisants puisqu’on a déterminé une activité considérable et spécifique avec des quantités minimes de l’ordre du 10-1ng.
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CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
Résultats & Discussion : 1. Clonage de l’ADNc du VHH22 et transformation de la levure Pichia pastoris : La séquence codante pour le VHH22 (393pb) a été amplifiée à partir d’une banque d’ADNc utilisant des amorces spécifiques et contenant des sites de restriction XbaI. Cette séquence a été clonée au niveau du site XbaI du plasmide pPICZαA (3.6Kb) sous le contrôle du promoteur AOXI et en phase de lecture avec le facteur α de Saccharomyces cerevisiae afin de permettre une expression extracellulaire de la protéine. Nous avons utilisé donc l’enzyme XbaI pour traiter la séquence VHH et pour linéariser 3µg de plasmide pPICZαA. Le vecteur est ensuite déphosphorylé par la phosphatase alcaline (Calf Intestinal Phosphatase ou CIP ; NEB Labs) afin d’empêcher sa recircularisation. Après traitement enzymatique, le vecteur et l’insert ont été purifiés sur colonne de silice utilisant le kit Mini Elute Reaction Cleanup Kit (Qiagen) puis mis en mélange de ligation en présence de la T4 DNA Ligase (NEB Labs) pendant 1h à 16°C.
Figure 1: La cassette d’expression pPICZαA/VHH22. La séquence VHH22 (393pb) a été clonée en phase de lecture avec le facteur α sous le contrôle du promoteur inductible AOXI. La présence d’un seul site unique BlpI au niveau du vecteur et de la séquence clonée nous a permis de déterminer le sens d’intégration par restriction enzymatique. Les sites d’hybridation des amorces utilisées sont localisés sur le schéma ci-dessus.
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50µl de bactéries NEB5α compétentes ont été transformées par le produit de ligation selon le protocole approprié puis étalées sur milieu LB contenant l’antibiotique zéocine (25µg/ml) et incubées pendant une nuit à 37°C. Les bactéries résistantes obtenues sur milieu sélectif ont été vérifiées pour la présence de vecteurs recombinants. Nous avons extrait les plasmides selon la méthode de lyse alcaline décrite par Sambrook et al., 1989, puis ensuite digéré par l’enzyme BlpI afin d’identifier les vecteurs recombinants et de vérifier le sens d’intégration de la séquence d’intérêt.
Figure 2: Analyse de l’orientation du gène cloné. Puits 1-3: Vecteurs suspectés recombinants digérés par l’enzyme BlpI. Puit 4: Contrôle négatif (vecteur intact linéarisé avec BlpI), M1 and M2: 100bp and 1Kb DNA Ladders respectivement (NEB Labs).
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Un vecteur recombinant a été révélé incorporer la séquence d’ADNc du VHH22 dans le bon sens. Ce vecteur a été séquencé utilisant l’amorce « α-factor primer » et nous avons vérifié que le gène est en phase de lecture avec le facteur α et la séquence du site de protéolyse Kex2. Cette séquence de clivage est nécessaire pour détacher la séquence d’adressage au milieu extracellulaire (facteur α) lorsque la protéine passe par l’étape de maturation au niveau de l’appareil de Golgi. Le vecteur recombinant obtenu a été linéarisé par PmeI et utilisé pour la transformation de cellules P. pastoris compétentes selon les instructions du kit de transformation fourni par Invitrogen. Ensuite ont été étalées sur milieu sélectif contenant la zéocine. Les clones résistants qui ont poussé ont probablement incorporé la cassette d’expression.
2. Analyse du génome des cellules P. pastoris transformées : L’intégration de la cassette d’expression au niveau du génome de la levure P. pastoris se réalise par phénomène de recombinaison homologue. Deux modalités de recombinaison sont possibles, l’une s’effectue au niveau du côté 5’AOXI seulement pour laisser le gène AOXI intact et dans ce cas les levures transformées sont de phénotype Mut+ (capables de métaboliser le méthanol), l’autre consiste au remplacement de la totalité du gène AOXI par intégration des deux côtés 5’ et 3’ et dans ce cas les clones obtenus sont de phénotype MutS (sensibles au méthanol) ne pouvant pas métaboliser le méthanol. Le phénomène de recombinaison simple au niveau 5’ seul est le plus observé. Pour vérifier cette intégration on a utilisé la technique PCR. L’ADN génomique de clones recombinants a été analysé par PCR utilisant deux couples d’amorces. Un premier couple d’amorces externes au gène d’intérêt et s’hybridant au niveau des régions 5’ et 3’ AOXI
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Résultats & Discussion
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permettent d’amplifier une séquence de ~1Kb comprenant 588pb du gène AOXI qui flanque la séquence d’ADNc du VHH22 (393pb). Par contre, si le clone n’est pas recombinant, uniquement la séquence de 588pb va être amplifiée. Dans notre cas les clones sont recombinants montrant une amplification de la séquence de 1Kb pour tous les clones.
Figure 3: Analyse de l’ADN génomique des cellules P. pastoris recombinantes par technique PCR. A: Amplification PCR avec les amorces AOX1. Ligne 1: pPICZαA/VHH22 recombinant, Ligne 2: pPICZαA intact, Lignes 3-5: ADN génomique de cellules P. pastoris recombinantes, ligne 6: Contrôle négatif (ADN Génomique de cellules non recombinantes). B: Amplification PCR avec des amorces internes spécifiques. Ligne 1: Nested-PCR sur la séquence VHH (Contrôle Positif); Ligne 2: pPICZαA/VHH22 recombinant, Lignes 35: ADN Génomique de P. pastoris recombinant; Ligne 6: ADN Génomique de levure non recombinante (Contrôle Négatif); Ligne 7: vecteur intact. M: 1Kb DNA Ladder (Promega).
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Résultats & Discussion
CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
Si le clone recombinant est Mut+ (cas des cellules obtenues dans ce travail), utilisant ces amorces, on remarque la présence d’une bande supplémentaire de taille 2,2Kb et qui représente le gène AOXI complet qui est amplifié. La présence de cette bande donne une information sur le phénotype du clone recombinant obtenu. La réaction PCR effectuée montre bien que les clones qui ont poussé sur milieu sélectif sont bien des clones recombinants et ont un phénotype Mut+. Pour mieux vérifier la présence du gène d’intérêt au niveau du génome des levures transgéniques, ont a utilisé le deuxième couple d’amorces internes amplifiant une séquence de 289pb spécifique de l’ADNc de VHH22. Alors tous les clones analysés ont été révélés transgéniques.
3. Analyse du transcriptome par RT-PCR : Les différents clones ont été mis en culture sur milieu BMMY contenant l’inducteur méthanol à 0.5%. Après 24h de culture sous induction, les ARN totaux des différents clones ont été extrait par le RNeasy Mini kit (Qiagen) ensuite une réaction RT-PCR à été réalisée. Dans cette réaction PCR on a utilisé les amorces internes pour identifier spécifiquement l’ARNm du gène VHH22.
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CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
Figure 4: Analyse de l’expression du gène par RT-PCR. Ligne 1: contrôle positif (PCR sur pPICZαA/VHH22 recombinant), Lignes 2 et 3: ADNc de cellules Pichia recombinantes, Ligne 4: contrôle Négatif (ADNc de cellules Pichia non recombinantes). Lignes 5 et 6: PCR directe sur extrait d’ARN totaux de cellules Pichia recombinantes, M: 1Kb Ladder (Promega).
Une bande d’amplification d’ADNc correspondant à la taille suspectée a été obtenue pour les différents clones testés montrant que le gène d’intérêt a été bien exprimé chez les clones recombinants.
4. Production de l’anticorps recombinant : Le but d’exprimer cet anticorps dans la levure c’est de le produire en grande quantité, avec un repliement plus proche au naturel puisque la levure est un système eucaryote qui a montré de grandes performances dans la production des protéines hétérologues et d’assurer les modifications post-traductionnelles propres aux eucaryotes telle que le bon repliement, la formation des ponts disulfures, l’addition des résidus glucidiques ou lipidiques, etc. nécessaires pour assurer l’activité biologique de la protéine. ~ 152 ~
Figure 5: Analyse de l’expression de la protéine VHH22 par Immunoblot. Lignes 1-6: Analyse de la production extracellulaire du sdAb VHH22 par les clones de levure transformées. Ligne 7: contrôle négatif (cellules de levure transformées par le vecteur pPICZαA intact). 100ng de protéines extracellulaires ont été utilisées dans chaque échantillon. M: Magic Mark™ Western Protein Standard (Invitrogen).
Les clones recombinants ont été cultivés sur milieu riche en glycérol à 0.5% pour augmenter la biomasse cellulaire. Ensuite, une étape de production de la protéine d’intérêt est réalisée par induction du promoteur 5’AOXI avec du méthanol à 0,5% qui représente dans ce cas la seule source de carbone pour la levure Pichia pastoris transgénique pendant 48h et dans 10ml de culture. La production de la protéine VHH22 a été analysée dans les deux milieux intra et extracellulaire par technique western blot utilisant des anticorps primaires monoclonaux anti6His Tag. Le résultat du western blot a montré que la protéine VHH22 est entièrement secrétée dans le milieu extracellulaire et ayant une taille d’environ 23kDa. Aucune expression intracellulaire n’a été révélée.
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Résultats & Discussion
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CHAPITRE III. EXPRESSION D’UN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI’ DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS
Figure 6: Purification de l’anticorps VHH22 recombinant par IMAC. Ligne 1 : Extrait brut (milieu de culture), Ligne 2 : Fraction non fixée ; Ligne 3 : Lavage avec du tampon ; Lignes 4, 5 et 6 : Elutions avec 100, 200 et 300µM d’Imidazole, respectivement. M : Marqueur de masse moléculaire : Dual Color Protein Standard (BioRad).
La protéine VHH22 possède normalement une taille de 15kDa, caractéristique des anticorps simple domaine. L’obtention d’une forme recombinante de taille supérieure à la normale nous a laissé penser à la possibilité d’une modification post-traductionnelle par addition d’un résidu glycosidique surtout qu’on a localisé un site potentiel de N-glycosylation (NDTA) au niveau de l’acide aminé Asparagine 91. L’anticorps recombinant a été purifié par chromatographie d’affinité IMAC utilisant une résine de Sépharose chargée de Nickel capable de fixer les étiquettes 6xHis présentes sur les protéines recombinantes exprimées. Le rendement de la purification a dépassé 95%.
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Résultats & Discussion
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Figure 6: Vérification de la déglycosylation du VHH22 par western blot. Anticorps VHH22 traité (2) et non traité (1) par la PNGase F. M: MagicMark™ Western Protein Standard (Invitrogen).
La protéine purifiée a été traitée avec la Glucosidase F ; (ou peptide N-Glycosidase). Cette enzyme enlève les chaines oligo-glycanes fixés sur la protéine. Les résultats montrent bien le shift de la bande au niveau du gel après traitement, ce qui explique que la protéine anticorps produite est sous forme glycosylée et aussi elle peut être déglycosylée in vitro.
5. Analyse de l’activité de neutralisation de l’anticorps VHH22 recombinant : Pour vérifier l’activité de neutralisation de l’anticorps recombinant purifié sous sa forme glycosylée, nous avons réalisé un test ELISA utilisant des quantités différentes de l’anticorps. La capacité de reconnaissance de l’antigène a été vérifiée par l’utilisation de quantités croissantes d’anticorps. Ainsi la spécificité à la toxine AahI’ a été testée par son incubation avec une autre toxine (AahII) utilisée comme antigène.
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Résultats & Discussion
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Test ELISA
DO A490
0,5 AahI AahII
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,375
0,75
1,25
2,5
5
10
Quantité de VHH22 (ng)
Figure : Test ELISA avec le VHH22 recombinant
Le test réalisé montre bien que l’anticorps VHH22 exprimé et produit chez la levure Pichia pastoris sous forme glycosylée est efficace ainsi il reconnait spécifiquement la toxine AahI’ du scorpion Androctonus australis hector. L’effet de neutralisation est de plus en plus important que la quantité de VHH22 recombinant utilisée est importante. La réaction de reconnaissance d’antigène obtenue est spécifique. Ce résultat est dégagé suite à l’utilisation d’une autre toxine produite par le même type de scorpion qui est l’AahII. Alors aucun signal considérable n’a été obtenu. En outre, l’augmentation de la quantité d’anticorps dans le milieu réactionnel n’a pas favorisé la reconnaissance de la toxine AahII.
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Conclusion : Dans cette partie nous avons illustré des résultats intéressant sur l’utilisation de la levure Pichia pastoris comme système d’expression de l’anticorps VHH22 sous une nouvelle forme glycosylée qui a montré plus d’efficacité dans la neutralisation de la toxine AahI’ de scorpion. Des techniques bien assistées de biologie moléculaire nous ont permis de maitriser la manipulation de ce système d’expression et décrocher l’originalité dans la sécrétion extracellulaire d’un anticorps de type VHH sous forme glycosylée pour la première fois chez la levure Pichia pastoris. Cette levure a été montrée une autre fois comme un système performant dans la production des protéines recombinantes.
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Résultats & Discussion
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Conclusion & Perspectives
CONCLUSION & PERSPECTIVES
La production de protéines recombinantes est une biotechnologie qui entre dans une phase de maturité, entraînant ainsi un essor de la production industrielle. Cependant, le processus de conversion de l’information génétique en protéine biologiquement active se heurte au problème fondamental du repliement cellulaire des protéines. Le choix du système d’expression est principalement guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active. Bien qu’il existe des techniques permettant le transfert rapide des gènes clonés entre différents systèmes d’expression, le vecteur génétique, utilisé pour exprimer le gène recombinant, doit être adapté à l’hôte choisi. De même, il est important de connaître le compartiment cellulaire dans lequel la protéine d’intérêt se replie ou exerce son activité biologique naturelle. Les systèmes d’expression possèdent un certain nombre de caractéristiques biologiques qui peuvent être optimisés, telle que le système promoteur, le nombre de copies et la stabilité avec les séquences signal. Mais le système biologique entier et son réseau régulateur sont extrêmement complexes. Ainsi l'amélioration biologique de production par modification dirigée et sa fine régulation consomme beaucoup de temps avec un coût très cher. Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à développer des méthodes de base pour l’installation de la technologie de production des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique et industriel dans différents systèmes d’expression hétérologues principalement la levure Pichia pastoris et la plante Arabidopsis thaliana au sein du laboratoire. Les protéines exprimées représentent un intérêt considérable dans le traitement thérapeutique et prophylactique.
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CONCLUSION & PERSPECTIVES
La première protéine produite était la protéine L1 de la capside du papillomavirus humain de type 16. Cette protéine possède une forte capacité d’autoassemblage et forme des particules virales non virulentes mais qui sont capables d’induire les réactions immunologiques anti PVH16. Ces particules présentent de bons candidats pour être utilisées comme vaccins prophylactiques. La production de cette protéine a été réalisé avec succès chez la plante modèle « Arabidopsis thaliana » et la protéine recombinante a été identifiée dans l’extrait protéique des plantes transgéniques. Comme perspectives à ce travail, on prévoit la purification de cette protéine et l’identification microscopique et par ELISA de l’assemblage des particules virales, ainsi que l’utilisation des particules virales dans des tests immunologiques chez des souris. Dans un second volet, nous avons réussi à exprimer une protéine anticorps de type VHH dirigé contre la neurotoxine AahI’ du scorpion Androctonus australis hector chez la levure Pichia pastoris. En fait, c’est la première fois qu’un anticorps de ce type est produit sous forme glycosylée chez ce type de levure. Le motif glycosidique fixé sur l’anticorps produit peut être éliminé grâce à la Peptide N-glycosidase F. La protéine anticorps VHH22 est confirmée exprimée totalement vers le milieu extracellulaire en fusion avec une étiquette histidine qui a facilité sa détection par technique western blot, et par la suite sa purification via une colonne de résine chargée de nickel. En effet, grâce à la technique de chromatographie IMAC, nous avons pu purifier notre protéine à plus de 95%. Le VHH recombinant sous sa forme glycosylée a été vérifié pour son affinité à la toxine AahI’ par un test ELISA. Alors on a obtenu des résultats très encourageants.
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CONCLUSION & PERSPECTIVES
La continuité du travail se présente dans le test de l’activité de neutralisation de l’anticorps VHH22 recombinant sous sa forme déglycosylée, ainsi que la détermination de ses caractéristiques biochimiques et pharmacocinétiques et sa comparaison par rapport à la forme recombinante produite chez la bactérie E. coli. Les deux systèmes d’expression utilisés se présentent parmi les systèmes les plus performants dans la production des protéines recombinantes. En effet, la plante est connue la meilleure dans l’assemblage des protéines produites sous forme recombinante. Par contre, la levure Pichia pastoris est le plus souvent efficace dans la production des protéines secrétées de petite taille.
~ 192 ~
Références Bibliographiques
Références Bibliographiques
1. 2. 3.
4. 5. 6.
7.
8.
9.
10. 11.
12. 13. 14.
15. 16. 17.
Abeijon C. and Hirschberg C.B. (1992) Topography of glycosylation reactions in the endoplasmic reticulum. Trends Biochem Sci 17: 32–36. Ablynx (2005) www.ablynx.com. Nanobodies, pp. 1-2. Ahmadvand D., Rahbarizadeh F. and Khoddami V.V. (2008) High-Expression of Monoclonal Nanobodies Used in the Preparation of HRP-Conjugated Second Antibody. Hybridoma 27: 269-276. Altmann F., Staudacher E., Wilson I.B.H. and Marz L. (1999) Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycoconjugate J 16: 109-123. Andersen D.C. and Krummen L. (2002) Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 117-123. Anttila A., Ronco G., Clifford G., Bray F., Hakama M., Arbyn M., et al. (2004) Cervical cancer screening programmes and policies in 18 European countries. Br J Cancer 91: 935-41. Apweiler R., Attwood T.K., Bairoch A., Bateman A., Birney E., Biswas M., Bucher P., Cerutti L., Croning M.D.R. and Durbin R. (1999) InterPro integrated resource of protein domains and functional sites http://www .ebi.ac.uk/interpro Arbabi G.M., Desmyter A., Wyns L., Hamers R. and Muyldermans S. (1997) Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett 414: 521-526. Arencibia A., Molina P., de la Riva G. and Selman-Housein G. (1995) "Production of transgenic sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by intact cell electroporation." Plant Cell Reports 14: 305-309. Ashley N.V. and Roach D.J. (1990) Review of biotechnology applications to nuclear waste treatment. J Chem Technol Biotechnol 49: 381–94. Bain J.D., Diala E.S., Glabe C.G., Dix T.A. and Chamberlin A.R. (1989) Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide. J Am Chem Soc 111: 8013-8014. Baneyx F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 10: 411-421. Baneyx F. and Mujacic M. (2004) Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol 22: 1399-408. Baral T.N., Magez S., Stijlemans B., Conrath K., Vanhollebeke B., Pays E., Muyldermans S. and De Baetselier P. (2006) Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. Nat Med 12: 580-584. Baseman J.G. and Koutsky L.A. (2005) The epidemiology of human papillomavirus infections. J Clin Virol 32: S16–S24. Bause E. (1984) Model studies on N-glycosylation of proteins. Biochem Soc Trans 12: 514-517. Bause E., Breuer W. and Peters S. (1995) Investigation of the active site of oligosaccharyltransferase from pig liver using synthetic tripeptides as tools. Biochem J 312: 979-985. ~ 194 ~
Références Bibliographiques 18. Beby-Defaux A. and Agius G. Papillomaviridae. In: Huraux JM, Nicolas JC, Agut H, Peigue-Lafeuille H, editors. Traité de virologie médicale. Paris: Estem; (2003) p. 267–73. 19. Bent A.F. (2000) "Arabiopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species". Plant Physiology 124: 1540-1547. 20. Berman H.M. Westbrook J., Feng Z., Gilliland G.; Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N. and Bourne P.E. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res 28: 235-242. 21. Bernard H.U. (2005) The clinical importance of the nomenclature, evolution and taxonomy of human papillomaviruses. J Clin Virol 32S: S1–S6. 22. Betton J.M. (2003) Rapid translation system (RTS): a promising alternative for recombinant protein production. Curr Protein Pept Sci 4: 73-80. 23. Bosch F.X. (2003) Épidémiologie des infections à HPV de type muqueux. In: Aubin F, Prétet JL, Mougin C, editors. Papillomavirus humains. Biologie et pathologie tumorale. Paris: Editions TEC & DOC; p. 335–57. 24. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N., Meijer C.J. and Shah K.V. (2002) The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 55: 244–65. 25. Bosch F.X., Manos M.M., Munoz N., Sherman M., Jansen A.M., Peto J., et al. (1995) Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst 87: 796–802. 26. Bosch F.X., Schiffman M., and Solomon D., editors. (2003) Future directions in epidemiologic and preventive research on human papillomaviruses and cancer. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31: 131. 27. Boschi B.S., Muniz C.A.A., Araujo A.K., Marques C.A., Garcea R.L. and Ho Paulo L. (2009) Expression and characterization of HPV16 L1 capsid protein in Pichia pastoris. Archives of virology 154 (10): 1609-1617. 28. Boulanger J.C., Sevestre H., Bauville E., Ghighi C., Harlicot J.P., Gondry J. (2004) Épidémiologie de l’infection à HPV. Gynecol Obstet Fertil 32: 218–23. 29. Bozon M. (2003) À quel âge les femmes et les hommes commencent-ils leur vie sexuelle ? Comparaison mondiale et évolution récente. Popul Soc (Paris); 391:1–4. 30. Braun P., Hu Y., Shen B., et al. (2002) Proteome-scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 99: 2654-9. 31. Braun P., LaBaer J. (2003) High throughput protein production for functional proteomics. Trends Biotechnol 21: 383-8. 32. Brekke K.A., S. Kverndokk and K. Nyborg: “An Economic Model of Moral Behavior”. J Public Eco 2003. 33. Brekke O.H, Sandlie I. (2003) Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov 2: 52-62. 34. Brentjens M.H, Yeung-Yue K.A. and Lee P.C., (2002) Tyring SK. Human papillomavirus: a review. Dermatol Clin 20: 315–31. 35. Cabantous S., Terwilliger T.C. and Waldo G.S. (2005) Protein tagging and detection with engineered selfassembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 23: 102-7. ~ 195 ~
Références Bibliographiques 36. Capell T., Claparols I., Del Duca S., Bassie L., Miro B., Rodriguez-Montesinos J., Christou P. and Serafini-Fracassini D. (2004) Producing transglutaminases by molecular farming in plants. Mini review article in Amino Acids 26: 419-423. 37. Carrio M.M. and Villaverde A. (2002) Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. J Biotechnol 96: 3-12. 38. Cereghino G.P.L., Cereghino J.L., Ilgen C. and Cregg J.M. (2002) Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol 13: 329-332 39. Cereghino, J.L. and Cregg, J.M. (2000) Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 24: 45–66. 40. Chirino A.J. and Mire-Sluis A. (2004) Characterizing biological products and assessing comparability following manufacturing changes. Nat Biotechnol 22: 1383-91. 41. Clark E.D., Schwartz E. and Rudolph R. (1999) Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding. Meth Enzymol 309: 217-36. 42. Clough S.J. and Bent A.F. (1998) "Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana." The Plant Journal: Technical Advance 16(6): 735-743. 43. Combita A.L, Touze A., Bousarghin L., Christensen N.D. and Coursaget P. (2002) Identification of two cross-neutralizing linear epitopes within the L1 major capsid protein of human papillomaviruses. J Virol 76: 6480–6. 44. Conrath E.K., Lauwereys M., Wyns L. and Muyldermans S. (2001) Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. J Biol Chem 276(10): 7346–7350. 45. Coppieters K., Dreier T., Silence K., De Haard H., Lauwereys M., Casteels P., Beirnaert E., Jonckheere H., Van de Wiele C., Staelens L., Hostens J., Revets H., Remaut E., Elewaut D. and Rottiers P. (2006) Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum 54(6): 1856– 1866. 46. Cortez-Retamozo V., Backmann N., Senter P.D., Wernery U., De Baetselier P., Muyldermans S. and Revets H. (2004) Efficient cancer therapy with a nanobodybased conjugate. Cancer Res 64: 2853-2857. 47. Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh G.G., Gobert M., Conrath K., Muyldermans S., De Baetselier P. and Revets H. (2002) Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. Int J Cancer 98(3):456–462. 48. Cregg J.M. (1999) Expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. In Fernandez, J. and Hoeffler, J. (eds.), Gene expression systems: Using nature for the art of expression. Academic Press, San Diego, CA, pp. 158-184. 49. Cregg J.M., Barringer K.J., Hessler A.Y. and Madden K.R. (1985) Pichia pastoris as a host system for transformations. Mol Cell Biol 5(12): 3376-3385 50. Cregg J.M., Lin-Cereghino J., Shi J. and Higgins D.R. (2000) Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16: 23–52.
~ 196 ~
Références Bibliographiques 51. Cregg J.M., Madden K.R., Barringer K.J., Thill G.P. and Stillman C.A. (1989) Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol 9: 1316-1323. 52. Cregg J.M., Vedvick T.S. and Raschke W.C. (1993) Recent Advances in the Expression of Foreign Genes in Pichia pastoris. Bio/Technology 11(8): 905-910. 53. Crossway A., Oakes J., Irvine J.M., Ward B., Knauf V.C. and Shewmaker C.K. (1986) Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol Gen Genet 202: 179-189. 54. Cumming D. A. (1991) Glycosylation of recombinant protein therapeutics: control and functional implications. Glycobiology 1: 115-130. 55. Cumming D.A. (1991) Glycosylation of recombinant protein therapeutics: control and functional implications. Glycobiology 1: 115-130. 56. Cunningham B.C. and Wells J.A. (1989) High-resolution epitope mapping of hGHreceptor interactions by alanine-scanning mutagenesis. Science 244: 1081-1085. 57. Cunningham L.W, Clouse R.W. and Ford J.D. (1963) heterogeneity of the carbohydrate moiety of crystalline ovalbumin. Biochim Biophys Acta 78: 379- 381. 58. Dalstein V., Prétet J.L. and Mougin C. (2003) Histoire naturelle de l’infection à HPV muqueux. In: Aubin F, Prétet JL, Mougin C, editors. Papillomavirus humains. Biologie et pathologie tumorale. Paris: Editions TEC & DOC; p. 287–307. 59. Damasceno L.M., Itzcoatl P., Chang H.J., Cohen L., Ritter G., Old L.J. and Batt C.A. (2004) An optimized fermentation process for high-level production of a single-chain Fv antibody fragment in Pichia pastoris. Protein Expression Purif 37: 18–26. 60. Daniell H., Lee S.B., (2001) Panchal T. and Wiebe P.O. Expression of the native Cholera Toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts. J Mol Biol 311(5): 1001-1009. 61. Davies J. and Riechmann L. (1994) Camelizing human antibody fragments: NMR studies on VH domains. FEBS Lett 339: 285-290. 62. De Genst E., Saerens D., Muyldermans S. and Conrath K. (2006) Antibody repertoire development in camelids. Developmental and Comparative Immunol 30: 187-198. 63. De Genst E., Silence K., Decanniere K., Conrath K., Loris R., Kinne J., Muyldermans S. and Wyns L. (2006) Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 103(12): 4586–4591. 64. De Haard H. (2008) Nanobodies-small is beautiful. Eur Biotechnol Sci Ind New 7: 39-41. 65. De Villiers E.M., Fauquet C., Broker T.R., Bernard H.U., zur Hausen H. (2004) Classification of papillomaviruses. Virology 324: 17–27. 66. Deckers N., Saerens D., Kanobana K., Conrath K., Victor B., Wernery U., Vercruysse J., Muyldermans S. and Dorny P. (2008) Nanobodies, a promising tool for speciesspecific diagnosis of Taenia solium cysticercosis. Int J Parasitol 1-9. 67. Desmyter A., Transue T.R., Ghahroudi M.A., Thi M.H., Poortmans F., Hamers R., Muyldermans S. and Wyns L. (1996) Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. Nat Struct Biol 3(9): 803–811. 68. Douvier S. and Dalac S. (2004) Infections à papillomavirus.- Encycl. Méd. Chir., Maladies infectieuses. 8-054-A-10, 19 p. ~ 197 ~
Références Bibliographiques 69. Dumoulin M., Last A.M., Desmyter A., Decanniere K., Canet D., Larsson G., Spencer A., Archer D.B., Sasse J., Muyldermans S., Wyns L., RedWeld C., Matagne A., Robinson C.V., Dobson CM (2003) A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid Wbrils by human lysozyme. Nature 424(6950): 783–788. 70. Dumoulin M., Last A.M., Desmyter A., Decanniere K., Canet D., Larsson G., Spencer A., Archer D.B., Sasse J., Muyldermans S., Wyns L., Redfield C., Matagne A., Robinson C.V., Dobson C.M. (2003) A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils by human lysozyme. Nature 424(6950): 783–788. 71. Eckart M.R. and Bussineau C.M. (1996) Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. Curr Opin Biotech 7: 525-530. 72. Elmayan T. and Vaucheret H. (1996) Expression of single copies of a strongly expressed 35S transgene can be silenced post-transcriptionally. Plant J 9: 787–797. 73. Enriquez-Obregon G.A., Vazquez-Padron R.I., Prietosansonov D.L., de la Riva G.A. and Selman-Houssein G. (1998) "Herbicide resitant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation." Planta 206: 20-27. 74. Enriquez-Obregon G.A., Vazquez-Padron R.I., Prietosansonov D.L., Pérez M. and Selman-Housein G. (1997) "Genetic transformation of sugarcane by Agrobacterium tumefaciens using antioxidants compounds." Biotecnologia Applicada 14: 169-174. 75. Feldmann M. (2002) Development of anti-TNF therapy for rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol 2(5): 364–371. 76. Ferlay J., Bray F., Pisani P. Globocan (2002) cancer incidence, mortality and prevalence worldwide. IARC Cancerbase no°5. Version 2.0. Lyon: IARC Press; 2004. 77. Fink A.L. (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold Design 3: R9-23. 78. Fischer G., Tradler T. and Zarnt T. (1998) The mode of action of peptidyl prolyl cis/trans isomerases in vivo: binding versus catalysis. FEBS Lett 426: 17-20. 79. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. and Twyman R. (2004) M. Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol 7: 152-158. 80. Frenken L.G.J., Hessing J.G.M., Van den Hondel C.A.M.J.J. and Verrips C.T. (1998) Recent advances in the large-scale production of antibody fragments using lower eukaryotic microorganisms. Res Immunol 149: 589–99. 81. Frenken L.G.J., Van Der Linden R.H.J., Hermans P.W.J.J., Bos J.W., Ruuls R.C., de Geus B., Verrips C.T. (2000) Isolation of antigen specific Llama VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 78: 11-21. 82. Frisch M. (2002) On the etiology of anal squamous carcinoma. Dan Med Bull 49:194– 209. 83. Fromm M., Taylor L.P. and Walbot V. (1985) "Expression of genes transferred into monocotyledonous plant cells by electroporation." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828. 84. Fromm M., Taylor L.P. and Walbot V. (1986) "Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation". Nature 319: 791-793.
~ 198 ~
Références Bibliographiques 85. Gavel Y. and Von Heijne G. (1990) Sequence differences between glycosylated and nonglycosylated Asn-X-Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering. Protein Eng 3: 433-442. 86. Gerngross T.U. (2004) Advances in the production of human therapeutic proteins in yeast and filamentous fungi. Nat Biotechnol 22: 1409-14. 87. Ghahroudi M., Desmyter A., Wyns L., Hamers W.R. and Muyldermans S. (1997) Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavychain antibodies. FEBS Lett 414, 521–526 88. Giddings G., Allison G., Brooks D. and Carter A. (2000) Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nat Biotechnol 18: 1151-1155. 89. Giddings M., Matveeva O., Atkins J.F. and Gesteland R.F. (2000) ODNBase--a web database for antisense oligonucleotide effectiveness studies. Bioinformatics 16: 843844. 90. Gillison M.L. and Lowy D.R. (2004) A causal role for human papillomavirus in head and neck cancer. Lancet 363:1488–1489. 91. Gillison M.L. and Shah K.V. (2003) Chapter 9: role of mucosal human papillomavirus in nongenital cancers. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31: 57–65. 92. Gomord V. and Faye L (2004a) Post-translational modification of therapeutic proteins in plants. Curr Opin Plant Biol 7: 171-181 93. Gomord V. et al. (2004b) Production and glycosylation of plant made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge. Plant Biotechnol 2: 83–100 94. Goochee C.F. and Monica T. (1990) Environmental effects on protein glycosylation. Bio/Technology 8: 421-427. 95. Got P.A. and Scherrmann J.M. (1997) Stereo selectivity of antibodies for the bioanalysis of chiral drugs. Pharm Res 14: 1516–23. 96. Graham B.M., Porter A.J. and Harris W.J. (1995) Cloning, expression and characterization of a single-chain antibody fragment to the herbicide paraquat. J Chem Technol Biotechnol 63: 279–89. 97. Gueorguieva D., Li S., Walsh N., Mukerji A., Tanha J., Pandey S. (2006) Identification of single-domain, Bax-specific intrabodies that confer resistance to mammalian cells against oxidativestress-induced apoptosis. FASEB J 20(14): 2636–2638. 98. Gustafsson C., Govindarajan S. and Minshull J. (2004) Codon bias and heterologous protein expression. Trends Biotechnol 22: 346-53. 99. Hagensee M., Yaegashi N. and Galloway D. (1993) Self-assembly of human papillomavirus type 1 capsids by expression of the L1 protein alone or by coexpression of the L1 and L2 capsid proteins. J Virol 67:315–22. 100.Hamers-Casterman C., Atanhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Bajyana Songa E., Bendahman N. and Hamers R. (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nat 363: 446-448. 101.Hamilton S.R., Bobrowicz P., Bobrowicz B., Davidson R.C., Li H., Mitchell T., Nett J.H., Rausch S., Stadheim T.A., Wischnewski H., Wildt S. and Gerngross T.U. (2003) Production of complex human glycoproteins in yeast. Science 301: 12441246. ~ 199 ~
Références Bibliographiques 102.Hamilton S.R., Bobrowicz P., Bobrowicz B., Davidson R.C., Li H., Mitchell T., et al. Production of complex human glycoproteins in yeast. Science 2003; 301(5637): 1244-1246. 103.Hansen G., Shillito R.D. and Chilton M.D. (1997) "T-strand integration in maize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence genes." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11726-11730. 104.Hantz S., Alain S., Denis F. (2006) Human papillomavirus prophylactic vaccines: stakes and perspectives. Gynécologie Obstétrique & Fertilité 34: 647–655. 105.Harmsen M.M. and De Haard H.J. (2007) Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl Microbiol Biotechnol 77: 13-22. 106.Harmsen M.M., van Solt C.B. and Fijten H.P.D. (2009) Enhancement of toxin- and virusneutralizing capacity of single-domain antibody fragments by N-glycosylation. Appl Microbiol Biotechnol 84: 1087–1094. 107.Harper D.M., Franco E.L., Wheeler C., Moscicki A.B., Romanowski B., Roteli-Martins C.M., et al. (2006) Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a randomised control trial. Lancet 367: 1247–55. 108.Hebner C.M. and Laimins L.A. (2006) Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Rev Med Virol 16: 83–97. 109.Hellwig S., Drossard J., Twyman R.M. and Fischer R. (2004) Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nat Biotechnol 22: 1415-22. 110.Herscovics A. and Orlean P. (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7(6): 540-50. 111.Higgins D.R. and Cregg J.M. (1998) Introduction to Pichia pastoris. In Higgins, D.R. and Cregg, J.M. (eds.), Pichia Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 1-15. 112.Hmila I., Ben Abdallah R.B.A., Saerensb D., Benlasfard Z., Conrathb K., El Ayeb M., Muyldermans S. and Bouhaouala-Zahara B. (2008) VHH, bivalent domains and chimeric Heavy chain-only antibodies with high neutralizing efficacy for scorpion toxin AahI’. Mol Immunol 45: 3847-3856. 113.Hmila I., Ben Abderrazek R., Dirk S., Benlasfar Z., Conrath K., El Ayeb M., Muyldermans S. and Bouhaouala B. (2008) VHH, bivalent domains and chimeric Heavy chain-only antibodies with high neutralizing efficacy for scorpion toxin AahI’. Mol Immunol 45: 3847–3856. 114.Hochuli E., Dobeli H. and Schacher A. (1987) New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr 411: 177–184. 115.Hollenberg C.P. and Gellissen G., (1997) Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts. Curr Opin Biotechnol 8: 554-60. 116.Holliger P. and Hudson P.J. (2005) Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol 23(9): 1126–1136. 117.Hong-Li L., Wen-Sheng L., Ting L., Jing Z., Zheng Z., Xiao-Fei Y., Zhe-Zhi W., Yi-Li W. and Lü-Sheng S. (2005) Expression of Human Papillomavirus Type 16 L1 Protein in Transgenic Tobacco Plants. Acta Biochim Biophys Sin 37 (3): 153-158. ~ 200 ~
Références Bibliographiques 118.Hoogenboom H.R. (2005) Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol 23(9): 1105–1116. 119.Huang L., Tchouate Gainkam L.O., Caveliers V., Vanhove C., Keyaerts M., De Baetselier P., Bossuyt A., Revets H. and Lahoutte T. (2008) SPECT Imaging with 99mTc-Labeled EGFR-Specific Nanobody for In vivo Monitoring of EGFR Expression. Mol Imaging Biol 10: 167-175. 120.Hubbard S.C. and Ivatt R.J. (1981) Synthesis and processing of asparagines-linked oligosaccharides. Annu Rev Biochem 50: 555-583. 121.Hutchison C.A., Phillips S., Edgell M.H., Gillam S., Jahnke P. and Smith M.J. (1978) Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. Biol Chem 253: 6551-6560. 122.Imperiali B. and Shannon K.L. (1991) Differences between Asn-Xaa-Thr-containing peptides: a comparison of solution conformation and substrate behavior with oligosaccharyltransferase. Biochemistry 30: 4374-4380. 123.Janda K.D., Lo L.C., Lo C.H.L., Sim M.M., Wang R., Wong C.H. and Lerner R.A. (1997) Chemical selection for catalysis in combinatorial antibody libraries. Science 275, 945–948. 124.Jenkins N. and Curling E.M.A. (1994) Glycosylation of recombinant proteins: Problems and prospects. Enz Microb Technol 16: 354-364. 125.Jenkins N., Curling E.M.A. (1994) Glycosylation of recombinant proteins: Problems and prospects. Enz Microb Technol 16: 354-364. 126.Jenkins N., Parekh R.B. and James D.C (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat Biotechnol 14: 975-981 127.Jobling S.A., Jarman C., Teh M.M., Holmberg N., Blake C. and Verhoeyen M.E. (2003) Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibody fragments. Nat Biotechnol 21(1): 77–80. 128.Johansen P.G., Marshall R.D. and Neuberger A. (1961) Carbohydrates in protein. Biochem J 78: 518-527. 129.John D. (2005) The papillomavirus life cycle. J Clin Virol 32: 7–15. 130.Joosten V., Gouka R.J., vanden Hondel C.A., Verrips C.T., Lokman B.C. (2005) Expression and production of llama variable heavy-chain antibody fragments (VHHs) by Aspergillus awamori. Appl Microbiol Biotechnol 66: 384–392. 131.Joosten V., Lokman C., Hondel A.V.D., Punt P.J. (2003) The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories 2: 1–15. 132.Joosten V., Roelofs M.S., Van Den Dries N., Goosen T., Verrips C.T., Van Den Hondel C.A.M.J.J. and Lokman B.C. (2005) Production of bifunctional proteins by Aspergillus awamori: Llama variable heavy chain antibody fragment (VHH) R9 coupled to Arthromyces ramosus peroxidase (ARP). J Biotechnol 120: 347-359. 133.Jorgensen R., Snyder C. and Jones J.D.G. (1987) T-DNA is organized predominantly in inverted repeat structures in plants transformed with Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives. Mol Gen Genet 207: 471–477. 134.Khalissa D., Hengliang S., Liang Li, Xingzhi W., Xiaojuan Z. K. et al. (2005) The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human ~ 201 ~
Références Bibliographiques papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice. J. Natl. Cancer Inst. 97:1072–1079. 135.Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H-H. and Buchner J. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology 9: 825-9. 136.Klein T.M., Fromm M., Weissinger A., Tomes D., Schaaf S., Sletten M., Sanford J.C. (1987) High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73. 137.Kobata A. (1992) Structures and functions of the sugar chains of glycoproteins. Eur J Biochem 209: 483 - 501 138.Koff R.S. (2002) Immunogenicity of hepatitis B vaccines: implications of immune memory. Vaccine 3695–701. 139.Köhler G. and Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nat 256: 495-497. 140.Kohli A., Gahakwa D., Vain P., Laurie D.A. and Christou P. (1999) Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta 208: 88–97. 141.Kojima M., Arai Y., Iwase N., Shirotori K., Shioiri H. and Nozue M. (2000) "Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants (Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium tumefaciens." Biosc Biotechnol Biochem 64(4): 845-847. 142.Kyrgiou M., Koliopoulos G., Martin-Hirsch P., Arbyn M., Prendiville W., Paraskevaidis E. (2006) Obstetric outcomes after conservative treatment for intraepithelial or early invasive cervical lesions: systematic review and meta-analysis. Lancet 367: 89–98 143.Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. 144.Lam A.Y., Pardon E., Korotkov K.V., Hol W.G.J., Steyaert J. (2009) Nanobody-aided structure determination of the EpsI:EpsJ pseudopilin heterdimer from Vibrio vulnificus. J Structural Biol 1-8. 145.Laroche Y., Storme V., De Meutter J., Messens J., Lauwereys M. (1994) High-level secretion and very efficient isotopic labeling of tick anticoagulant peptide (TAP) expressed in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 12: 1119– 1124. 146.Larrick J.W. and Thomas D.W. (2001) Producing proteins in transgenic plants and animals. Cur Opinion Biotech 12: 411-418. 147.Lerouge P., Bardor M., Pagny S., Gomord V. and Faye L. (2000) N-glycosylation of recombinant pharmaceutical glycoproteins produced in transgenic plants: towards an humanization of plant glycans. Curr Pharm Biotechnol 1: 347-354. 148.Lin H. and Cornish V.W. (2002) Screening and selection methods for large-scale analysis of protein function. Angew Chem Int Ed Engl 41: 4402-4425. 149.Ling M.M. and Robinson B.H. (1997) Approaches to DNA mutagenesis: an overview.Anal. Biochem. 254: 157-178.
~ 202 ~
Références Bibliographiques 150.Lonberg N. (2008) Fully human antibodies from transgenic mouse and phage display platforms. Curr Opin Immunol 20(4): 450–459. 151.Lörz H., Baker B. and Schell J. (1985) "Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation." Mol General Genetics 199: 473-497. 152.Lowy D.R. and Howley P.H. (2001) Papillomaviruses. In Fields virology. D.M. Knipe and P.H. Howley, editors. Lippincott, Williams, et Wilkins. Philadelphia, Pennsylvania, USA. 2231–2264. 153.Maass D.R., Sepulveda J., Pernthaner A. and Shoemaker C.B. (2007) Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). J Immunol Methods 324: 13-25. 154.Maclean J., Koekemoer M., Olivier A.J., Stewart D., Hitzeroth I.I., Rademacher T., Fischer R., Williamson A.L. and Rybicki E.P. (2007) Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. J Gen Virol 88:1460-9. 155.Mao C., Koutsky L., Ault K., Wheeler C., Brown D.M., Wiley D., et al. (2006) Efficacy of human papillomavirus-16 vaccine to prevent cervical intraepithelial neoplasia: a randomized controlled trial. Obstet Gynecol 107:18–27. 156.Maras M., van Die I., Contreras R. and van den Hondel C.A. (1999) Filamentous fungi as production organisms for glycoproteins of bio-medical interest. Glycoconj J 16(2): 99-107. 157.Marchal I., Jarvis D.L., Cacan R., Verbert A. (2001) Glycoproteins from insect cells: sialylated or not? Biol. Chem. 382: 151-159. 158.Marton L., Hrouda M., Pecsvaradi A., Czako M. (1994) "T-DNA-insert-independent mutations induced in transformed plant cells during Agrobacterium co-cultivation." Transgenic Research 3: 317-325. 159.Maxam A. M., Gilbert W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564. 160.Medzihradszky K.F., Spencer D.I.R., Sharma S.K., Bhatia J., Pedley R.B., Read D.A., Bergent R.H.J., Chester K.A., 2004. Glycoforms obtained by expression in Pichia pastoris improve cancer targeting potential of a recombinant antibody-enzyme fusion protein. Glycobiology 14, 27-37. 161.Meins F. (2000) RNA degradation and models for post-transcriptional gene silencing. Plant Mol Biol 43:261–273. 162.Mendez F., Munoz N., Posso H., Molano M., Moreno V., van den Brule A.J.C. (2005) Cervical coinfection with human papillomavirus (HPV) types and possible implications for the prevention of cervical cancer by HPV vaccines. J Infect Dis 192: 1158–65. 163.Merrifield R.B. (1963) Solid phase peptide synthesis I: the synthesis of tetrapeptide. J Am Chem Soc 85: 2149-2154. 164.Meyer P. (2000) Transcriptional transgene silencing and chromatin components. Plant Mol Biol 43: 221–234. 165.Middelberg A.P.J. (2002) Preparative protein refolding. Trends Biotechnol 20: 437-43. ~ 203 ~
Références Bibliographiques 166.Middleton K., Peh W., Southern S.A., Griffin H.M., Sotlar K. and Nakahara T. (2003) Organisation of the human papillomavirus productive cycle during neoplastic progression provides a basis for the selection of diagnostic markers. J Virol 77: 10186–201. 167.Miranda F., Kopeyan C., Rochat C., Rochat H., Lissitzky S. (1970) Purification of animal neurotoxins. Isolation and characterization of eleven neurotoxins from the venoms of the scorpions Androctonus australis hector, Buthus occitanus tunetanus and Leiurus quinquestriatus quinquestriatus. Eur J Biochem 16: 279 – 291. 168.Molloy P., Brydon L., Porter A.J. and Harris W.J. (1995) Separation and concentration of bacteria with immobilized antibody fragments. J Appl Bacteriol 78: 359-65. 169.Morrow J. (2001) Biopharm manufacturing capacities. Genet Eng News 21: 1-85. 170.Munoz N. (2006) A review of the phase III clinical data for the quadrivalent human papillomavirus vaccine. Eurogin 23–6. 171.Munoz N. et al. (2004) Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective. Int J Cancer 111: 278–285. 172.Munoz N., Bosch F.X., Castellsague X., Diaz M., de Sanjose S., Hammouda D., et al. (2004) Against which human papilomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective. Int J Cancer 111: 278–85. 173.Muyldermans S. (2001) Single domain camel antibodies: current status. J Biotechnol 74(4): 277–302. 174.Muyldermans S. (2001) Single domain camel antibodies: current status. Rev Mol Biotechnol 74: 277–302. 175.Muyldermans S., Baral T.N., Cortez-Retamozzo V., De Baetselier P., De Genst E., Kinne J., Leonhardt H., Magez S., Nguyen V.K., Revets H., Rothbauer U., Stijlemans B., Tillib S., Wernery U., Wyns L., Hassanzadeh-Ghassabeh Gh., Saerens D. (2008) Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet Immunol Immunopathol. Afr J Biotechnol 2652 1-6. 176.Muyldermans S., Cambillau C. and Wyns L. (2001) Recognition of antigens by single domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends Biochem Sci 26: 230–235. 177.Myers G., Bernard H-U., Delius H., Favre M., Icenogel J., Van Ranst M., Wheeler C., editors. Human papillomaviruses a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences. 1st ed. Los Alamos, USA: Theoretical Biology and biophysics group T-10, Los Alamos National Laboratory; 1994. 178.Nardelli-Haefliger D., Wirthmer D., Schiller J.T., Lowy D.R., Hildesheim A., Ponci F., et al. (2003) Specific antibody levels at the cervix during the menstrual cycle of women vaccinated with human papillomavirus 16 Virus-like particles. J Natl Cancer Inst 95: 1128–37. 179.Neumann E., Schaefer-Ridder M., Wang Y. and Hofschneider P.H. (1982) "Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in hig electric fields." EMBO Journal 1: 841-845.
~ 204 ~
Références Bibliographiques 180.Nguyen V.K., Zou X., Lauwereys M., Brys L., Bruggemann M. and Muyldermans S. (2003) Heavy-chain only antibodies derived from dromedary are secreted and displayed by mouse B cells. Immunology 109: 93–101. 181.Noren C. J., Anthony-Cahill S.J., Griffith M.C. and Schultz P.G. (1989) A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science 244: 182-188. 182.Olichon A. and Surrey T (2007) Selection of genetically encoded fluorescent single domain antibodies engineered for efficient expression in Escherichia coli. J Biol Chem 282(50): 36314–36320. 183.Omidfar K., Rasaee M.J., Modjtahedi H., Forouzandeh M., Taghikhani M., Bakhtiari A., Paknejad M., Kashanian S., (2004a) Production and characterization of a new antibody specific for the mutant EGF receptor, EGFRvIII, in Camelus bactrianus. Tumor Biol. 25: 179–187. 184.Omidfar K., Rasaee M.J., Modjtahedi H., Forouzandeh M., Taghikhani M., Golmakany N., (2004b) Production of a novel camel single-domain antibody specific for the type III mutant EGFR. Tumor Biol 25: 296–305. 185.Pant N., Hultberg A., Zhao Y., Svensson L., Pan-Hammarstrom Q., Johansen K., Pouwels P.H., Ruggeri F.M., Hermans P., Frenken L., Boren T., Marcotte H., Hammarstrom L. (2006) Lactobacilli expressing variable domain of llama heavychain antibody fragments (lactobodies) confer protection against rotavirus-induced diarrhea. J Infect Dis 194(11): 1580–1588. 186.Parkin DM, Misani P, Ferlay J. Global cancer statistics. A Cancer J Clin 1999; 49:33–64. 187.Pavlou A.K. and Reichert J.M. (2004) Recombinant protein therapeutics: success rates, market trends and values to 2010. Nat Biotechnol 22: 1513-9. 188.Peh W.L., Middleton K., Christensen N., Nicholls P., Egawa K., Sotlar K., et al. (2002) Life cycle heterogeneity in animal models of human papillomavirus-associated disease. J Virol 76: 10401–16. 189.Pfister H. (2003) Chapter 8: human papillomavirus and skin cancer. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 31:52–56. 190.Philipp H. and Peter J.H. (2005) Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136. 191.Pini A. and Bracci L. (2000) Phage display of antibody fragments. Curr Protein Pept Sci 1(2): 155–169. 192.Pisani P., Parkin D.M., Munoz N. and Ferlay J. (1997) Cancer and infection: estimates of the attributable fraction in 1990. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 6: 387–400. 193.Porath J., Carlsson J., Olsson I. and Belfrage G. (1975) Metal chelate affinity Chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258: 598–599. 194.Rahbarizadeh F., Rasaee M.J., Forouzandeh M. and Allameh A.A. (2005) High expression and purification of the recombinant camelid anti-MUC1 single domain antibodies in Escherichia coli. Protein Expression Purif 44: 32–38. 195.Rahbarizadeh F., Rasaee M.J., Forouzandeh M., Allameh A.A. (2006) Over expression of anti-MUC1 single-domain antibody fragments in the yeast Pichia pastoris. Mol Immunol 43: 426-435. ~ 205 ~
Références Bibliographiques 196.Ramoz N., Rueda L.A., Bouadjar B., Montoya L.S., Orth G. and Favre M. (2002) Mutations in two adjacent novel genes are associated with Epidermodysplasia verruciformis. Nat Genet 32: 579–81. 197.Raskin I., Ribnicky D.M., Komarnytsky S., Ilic N., Poulev A., Borisjuk N., Brinker A., Moreno D.A., Ripoll C., Yakoby N., O'neal J.M., Cornwell T., Pastor I. and Fridlender B. (2002) Plants and human health in the twenty-first century. Trends in Biotechnology 20(12): 522-531. 198.Reichert J. and Pavlou A. (2004) Monoclonal antibodies market. Nat. 3: 383-384. 199.Revets H., De Baetselier P. and Muyldermans S. (2005) Nanobodies as novel agents for cancer therapy. Expert Opin Biol Theor 5: 111-124. 200.Riechman L. and Muyldermans S. (1999) Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. J Immunol Methods 231: 25-38. 201.Ritz D. and Beckwith J. (2001) Roles of thiol-redox pathways in bacteria. Annu Rev Microbiol 55: 21-48. 202.Rochat H., Rochat C., Miranda F., Lissitzky S. and Edman P. (1970) The amino acid sequence of neurotoxin I of Androctonus australis hector. Eur J Biochem 17: 262– 266. 203.Rohini V.K. and Sankara Rao K. (2000) "Embryo Transformation, A Practical Approach for Realizing Transgenic Plants of Safflower (Carthamus tinctorius L.)" Annals of Botany 86(5): 1043-1049. 204.Roitt I.M. and Delves P.J. (2001) Roitt’s essential immunology. In: Blackwell Publishing. Receptor localization. United Kingdom: Oxford. pp37. 205.Romanos M.A., Scorer C.A. and Clare J.J. (1992) Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 8: 423-488. 206.Roovers R.C., Laeremans T., Huang L., De Taeye S., Verkleij A.J., Revets H., De Haard H.J., Van Bergen en Henegouwen PMP (2007) Efficient inhibition of EGFR signalling and of tumor growth by antagonistic anti-EGFR nanobodies. Cancer Immunol Immunother 56: 303-317. 207.Rose R.C., Reichmann R.C. and Bonnez W. (1994) Human papillomavirus (HPV) type 11 recombinant virus-like particles induce the formation of neutralizing antibodies and detect HPV-specific antibodies in human sera. J Gen Virol 75: 2075–9. 208.Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. (2006) Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nat Methods 3(11): 887– 889. 209.Roux K.H., Greenberg A.S., Green L., Strelets L., Avila D., Mckinney E.C., Flajnik M.F. (1998) Structural analysis of the nurse shark (new) antigen receptor (NAR): Molecular convergence of NAR and unusual mammalian immunoglobulins. Proc Natl Acad Sci 95: 11804-11809. 210.Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. (2004) Single-domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J Biol Chem 279(10): 51965-51972. ~ 206 ~
Références Bibliographiques 211.Sagt C.M.J., Kleizen B., Verwaal R., De Jong M.D.M., Ller W.H.Mu., Smits A., Visser C., Boonstra J., Verkleij A.J., and Verrips C.T. (2000) Introduction of an Nglycosylation site increases secretion of heterologous proteins in yeasts. App Env Microb 66(11): 4940–4944. 212.Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A. and Arnheim N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354. 213.Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 214.Sanford J. C. (1988) Regarding early claims of pollen-mediated transformation. in Ed. F.A. Valentine. Forest and Crop Biotechnology -Progress and Prospects. SpingerVerlag, NY. pp: 163-173. 215.Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. 216.Schiffman M., and Kjaer S.K. (2003) Chapter 2: natural history of anogenital human papillomavirus infection and neoplasia. J Natl Cancer Inst Monogr 31:14–19. 217.Schiller J.T. and Lowy D.R. (2004) Human papillomavirus vaccines for cervical cancer prevention. Chapter 45. In: Plotkin SA, Orenstein WA, editors. Vaccines, 4e édition. Philadelphia: 1259–65. 218.Serruys B., Van Houtte F., Verbrugghe P., Leroux-Roels G. and Vanlandschoot P. (2009) Llama-derived single-domain intrabodies inhibit secretion of hepatitis B virions in mice. Hepatology 49(1): 39–49. 219.Sleep D., Belfield G.P., Ballance D.J., Steven J., Jones S., Evans L.R., Moir P.D. and Goodey A.R. (1991) Saccharomyces cerevisiae strains that overexpress heterologous proteins. Bio/Technology 9: 183-187. 220.Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., and Klenk D.C., (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85. 221.Snijders P.J., Steenbergen R.D., Heideman D.A. and Meijer C.J. (2006) HPV-mediated cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications. J Pathol 208:152–164. 222.Spirin A.S. (2004) High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally active proteins. Trends Biotechnol 22. 223.Spiro R.G. (2002) Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology 12: 43R-56R. 224.Stemmer W.P.C. (1994) "DNA Shuffling by Random Fragmentation and Reassembly: In vitro Recombination for Molecular Evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51. 225.Stijlemans B., Conrath K., Cortez-Retamozo V., Van Xong H., Wyns L., Senter Revets H.P.D., De Baetselier P., Muyldermans S. and Magez S. (2004) Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single-domain antibodies: African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem 279: 1256-1261. 226.Sulkowski E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol 3: 1–7.
~ 207 ~
Références Bibliographiques 227.Swartz J.R. (2001) Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol 12: 195-201. 228.Szentirmay Z. et al. (2005) Human papillomavirus in head and neck cancer: molecular biology and clinicopathological correlations. Cancer Metastasis Rev 24:19–34. 229.Taira A.V., Neukermans C.P., Sanders G.D. (2004) Evaluating human papillomavirus vaccination programs. Emerg Infect Dis 10: 1915–23. 230.Tanha J., Xu P., Chen Zh., Ni F., Kaplan H., Narang S.A., MacKenzie C.R. (2001) Optimal design features of camelised human single-domain antibodies libraries. J Biological Chem 276: 24774-24780. 231.Tanner W. and Lehle L. (1987) Protein glycosylation in yeast. Biochimica and Biophysica Acta 906 (1): 81-99 232.Thomassen Y.E., Meijer W., Sierkstra L. and Verrips C.T. (2002) Large-scale production of VHH antibody fragments by Saccharomyces cerevisiae. Enz Microb Technol 30: 273-278. 233.Tinland B. (1996) "The integration of T-DNA into plant genomes." Trends in Plant Science 1(6): 178-184. 234.Tinland B., Hohn B. and Puchta H. (1994) "Agrobacterium tumefaciens transfers singlestranded transferred DNA (T-DNA) into the plant cell nucleus." Proc. Natl Acad. Sci. USA 91(17): 8000-4. 235.Trieu A.T. and Harrison M.J. (2000) "Genetic Transformation without the need for in vitro regeneration." Agricell Report : a plant tissue culture newsletter 35(2): 9-10. 236.Twyman R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. and Fisher R. (2003) Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology 21(12): 570-578. 237.Uchimiya H., Fushimi T., Hashimoto H., Harada H., Syono K. and Sugawara Y. (1986) "Expression of a foreign gene in callus derived from DNA-treated protoplasts of rice (Oryza sativa L.)." Mol General Genetics: MGG 204: 204-207. 238.Vaeck M. (2004) The therapeutic potential of nanobodies. Drug discovery Innovations Pharmaceutical Technol. pp. 8-42. 239.Van Ballegooijen M. and Hermens R. (2000) Cervical cancer screening in the Netherlands. Eur J Cancer 36: 2244–6. 240.Van den Steen P., Rudd P.M., Dwek R.A., Opdenakker G. (1998) Concepts and principles of O-linked glycosylation. Crit Rev Biochem Mol Biol 33: 151-208. 241.Van der Linden R.H.J., Frenken L.G.J., Geus B., Harmsen M.M., Ruuls R.C., Stok W., Ron L.D., Wilson S., Davis P. and Verrips C.T. (1999) Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragmentsand mouse monoclonal antibodies. Biochim Biophys Acta 1431: 37–46. 242.Villa L.L., Costa R.L., Petta C.A., Andrade R.P., Ault K.A., Giuliano A.R., et al. (2005) Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16, and 18) L1 viruslike particle vaccine in young women: a randomized double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncol 6: 271–8.
~ 208 ~
Références Bibliographiques 243.Walboomers J., Jacobs M., Manos M.M., Bosch F., Kummer J., Shah K., et al. (1999) Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 189: 12–19. 244.Waldo G.S., Standish B.M., Berendzen J. and Terwilliger T.C. (1999) Rapid proteinfolding assay using green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 17: 691-5. 245.Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J., Unger M., Juarez K., Urrutia M., Cauerhff A., Danquah W., Rissiek B., Sceuplein F., Schwarz N., Adriouch S., Boyer O., Seman M., Licea A., Serreze D.V., Goldbaum F.A., Haag F. and Koch-Nolte F. (2009) Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol 198: 157-174. 246.Wickner S., Maurizi M.R. and Gottesman S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science 286: 1888-93. 247.Wilkinson B. and Gilbert H.F. (2004) Protein disulfide isomerase. Biochem Biophys Acta 1699: 35-44. 248.Wright T.C., Jr. Cox J.T., Massad L.S., Twiggs L.B., and Wilkinson E.J. (2002) 2001 consensus guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities. Jama. 287: 2120–2129. 249.Wu T.T., Johnson G., Kabat E.A. (1993) Length distribution of CDRH3 in antibodies. Proteins 16(1): 1–7. 250.Wurm F.M. (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol 22: 1393-8. 251.Yang B.H., Bray F.I., Parkin D.M., Sellors J.W. and Zhang Z.F. (2004) Cervical cancer as a priority for prevention in different world regions: an evaluation using years of life lost. Int J Cancer 109: 418–424. 252.Zhang Z., Gildersleeve J., Yang Y.Y. et al. (2004) A new strategy for the synthesis of glycoproteins. Science 303: 371-3. 253.Zur Hausen H. (2002) Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2: 342–350.
~ 209 ~