Transmisión
Antecedentes: 1924
De Broglie
describió el movimiento de los electrones
1926
Busch
los campos magnéticos con la dimensión y forma apropiada pueden utilizarse como
1932 Knoll y Ruska Berlín 1935 1939
lentes para enfocar un haz de electrones Diseñan el primer me con dos lentes electromagnéticas de aumento y un haz de electrones
ELPRIMER ME de alta resolución Alemania (SIEMENS y AEG)
COMERCIALIZACIÓN.
TIPOS DE ME: TEM ME transms ió n Transmi ss io n electro n mi cr osco pe CEM (Conventional EM) CTEM (Conventional TEM) SEM
ME de barr id o
Scann in g elect ro n mi cr os co pe
OTROS TIPOS STEM
Combinación de TEM y SEM
HVEM
MEdealtovoltaje
Scanning transmission electron microscope cortesmásgruesos
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO EN ESENCIA Fundamentos: Las radiaciones electromagnéticas poseen una longitud de onda de propagación muy corta. Los electrones se desvían de su trayectoria recta de propagación cuando atraviesan un campo magnético circular. Al producirse un alto vacío los electrones se desprenden de la fuente luminosa formada por wolframio incandescente. Fuente y flu jo de electr ones La fuente es un cátodo constituido por un filamento de wolframio incandescente. Los electrones son térmicamente arrancados a baja velocidad. Los electrones son acelerados mediante la creación de un alto potencial (cilindro de Wehnelt), el cual permite una trayectoria rectilínea de los electrones de muy baja longitud de onda. Los electrones se desvían de su trayectoria al atravesar un campo electromagnético (lente electromagnética). La desviación se acentúa al colocar varias lentes Un haz muy desviado, muy abierto, se recoge en una pantalla fluoroscópica para poder ser visible al ojo humano.
Un MET consta fundamentalmente de: Una columna Un Sistema de vacío Una fuente de alta tensión eléctrica Un sistema de refrigeración Un control de mandos
La COLUMNA consta de: Fuente de iluminación (cañón de electrones) Las lentes El sistema de visualización
El diseño básico de la columna es comparable al microscopio de luz
Comparación entre el diseño de un microscopio de luz y un TEM.
El cañón de electrones es un sistema que genera un flujo de electrones con la velocidad y dirección adecuadas. Está formado por: Un filamento o cátodo Un ánodo perforado Un cilindro protector (cilindro de Wehnelt)
Filamento (o cátodo) de wolframio (tungsteno) o hexacarburo de lantano:
1. Está conectado a una fuente de alta tensión 2. La diferencia de potencial ánodo-cátodo hace que los electrones adquieran energía 3. Son acelerados hacia el ánodo 4. El cilindro protector tiene la base perforada, garantizando la orientación correcta de los electrones.
La columna consta de: Fuente de iluminación (cañón de electrones)
Las lentes El sistema de visualización
Las lentes son bobinas electromagnéticas por las que circula corriente eléctrica generando un campo electromagnético.
Los primeros microscopios incluían tres lentes: Condensador Objetivos Lente proyectora
El inyector de muestra se sitúa entre el condensador y el objetivo
Los microscopios modernos poseen más lentes: 2 ó más condensadores Lentes intermedias 2 ó más lentes proyectoras
Las lentes intermedia y proyectoras Se sitúan por debajo Magnifican la imagen obtenida Magnifican aumentos en función del campo magnético obtenido
Además, existen diafragmas o aperturas de las lentes que son atravesados por el haz de electrones
Microscopio electrónico de transmisión
Microscopía electrónica de transmisión
PORTAOBJETOS Se utilizan rejillas de cobr e, níquel o ro dio . El haz de electrones no atravesaría el vidrio. Los obstáculos al paso de los electrones: La propia muestra Entramado de la rejilla
Portamuestras (rejilla)
Para visualizar la imagen srcinada por los electrones es necesario convertir la imagen visible por el ojo humano. Esta imagen se puede obtener de dos maneras Visualización directa en una pantalla fluorescente Mediante la génesis de una imagen fotográfica o digitalizada
Resolución del microscopio electrónico Poder de resolución: Capacidad de distinguir como dos imágenes distintas dos puntos muy cercanos. Distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse: * Ojo humano: 0,23 mm = 230 mm = 23 X 104 nm * Mic. óptico: 0,23 mm X 1000 = 23 X 107 nm * Mic. Electrón: 0,23 mm X 1000 X 240 = 23 X 240 X 107 nm
Resolución del microscopio electrónico Ecuación de Abbe:
AN puede variarse para disminuir el LR. depende del voltaje aplicado, que según la
Ecuación de De Brogli e:
Al emitirse un haz de electrones puede ocurrir: 1. Transmisión de electrones a través de la muestra 2. Retrodispersión de electrones (electrones primarios) 3. Emisión de electrones de la propia muestra (electrones secundarios) 4. Emisión de otras radiacciones
Formación de la imagen 1. Los electrones no dispersados descienden hasta impactar con la pantalla. 2. Los electrones dispersados, dependiendo del ángulo, pueden abandonar el campo de visión
Preparación de muestras para TEM Ø
Inclusión y corte fino
Ø
Desintegración y obtención de extensiones
Ø
Réplicas de superficie
Inclusión y corte
Fij aci ón de la muestra Fijación física ( crio fijación ) Inmersión en propano líquido Impacto metálico
Fijación química Glutaraldehido 2 % Paraformaldehido 6 % Mezclas de fijadores
Post-fijación Tetróxido de osmio 1 %
Inclus ión en resina Lavado Deshidratación (acetona o metanol) Aclaramiento (óxido de propileno) Infiltración Resinas acrílicas (Lowicryl) Resinas epoxi (Epon)
Confe cció n de los bl oques
Prepa ración de rejil las Realización de cortes con Ultramicrotomo Ultracriotomo Colocación sobre rejillas
Microscopía Electrónica
REALIZA CIÓN DE SEMIFINOS: Por ello es frecuente hacer secciones de
0.5 a 1-2 µm de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas.
REALIZA CIÓN DE ULTRAFINOS: Secciones de 10 a 100 nm de grosor
con el ultramicrotomo.
Portamuestras (rejilla)
Película de soporte (Formvar)
Contraste de los cortes Acetato de uranilo Lavado Citrato Lavadode plomo Secado
Prepa raci ón de muest ras p ara TEM Ø
Inclusión y corte fino
Ø
Desintegra ción y ob tención de extension es
Ø
Réplicas de superficie
ESTUDIO DE EXTENSIONES Deben ser finas para estudiarlas con distintos métodos de contraste. Son ejemplos: 1. Contr aste negativo de extensio nes (19 55) 2. Sombreado metálico (1946)
Con trast e nega ti vo d e extens io nes Los pasos a seguir son: 1. Fijaci ón 2. Embeber el material en f ase líquida qu e rodea las partículas 3. Secar: Se form a una pelí cul a sóli da densa a los electrones
Con trast e nega ti vo d e extens io nes Las partículas se observan claras y rodeadas de material oscuro (efecto contrario). Da un aspecto tridimensional: se resalta el relieve de la muestra
Con tr aste nega tivo d e ext ens io nes Los materiales son sales de metales pesados muy solubles en agua (no precipita) y de pequeño tamaño: 1. Sales de fos fot ungst ato 2. Sales d e Urani lo 3. Sales d e Cadmio 4. Sales de Moli bdeno
Mitocondria tras un choque hipotónico. Contraste negativo con fosfotungstato
TEM, tinción negativa
Actina F
Bacteriófago T4
TEM, tinción negativa
ADN y cápside, bacteriófago T4
Som br eado m etálic o Se usan metales pesados, pero no sus sales. El metal se evapora sobre su superficie, sólo a un lado de la muestra y queda la sombra del otro lado
Som breado metálic o La imagen que se observa es la de un objeto oscuro junto a una sombra clara. Se pueden obtener imágenes invertidas. Puede ser unidireccional (un foco de evaporación) o rotatorio (la estructura queda bien delimitada).
Som breado metálic o Los metales más usados son: 1. Platino 2. Paladi o 3. Iridi o 4. Tungsteno 5. Tántal o
Som breado metálic o Es muy útil para estudiar macromoléculas como: 1. Filament os 2. Ácidos nucl eicos
TEM, sombreado Miosina
Virus del Mosaico del Tabaco TEM, sombreado
TEM, tinción negativa
Prepa raci ón de muest ras p ara TEM Ø
Inclusión y corte fino
Ø
Desintegración y obtención de extensiones
Ø
Répli cas de sup erfi ci e
Répl ic as d e su perfic ie Consiste en la copia de la superficie fina y transparente para su observación al TEM. Se utilizan materiales plásticos.
Répl ic as d e su perfic ie 1.Se utilizan materiales plásticos, carbono y materiales similares. Las más resistentes son las plásticas. 2. La separación se hace por medios químicos como disolución, oxidación o digestión de la muestra
Réplicas de superficie Algunas veces se sombrea antes de recoger la réplica
Criotécnicas Su finalidad es reducir los cambios introducidos por protocolos químicos convencionales. Suelen comenzar por una criofijación Las ventajas:
1. Se reduce la perdida de componentes solubles (no hay extracción) 2. Se conserva mejor la conformación molecular: FACILIDAD DE DETECTAR ANTIGENOS.
Criotécnicas Desventajas:
1. No suelen ser de rutina 2. Aparataje especial.
Ejemplos:
1. Criofractura 2. Criograbado.
Criofractura
Criofractura y réplica. Criograbado 1. 2. 3. 4.
Criofijación Fractura Sublimación del hielo en vacio Réplica
5. Eliminar la muestra biológica 6. Sombreado
Criofractura y sombreado
Célula Vegetal
TEM Criofractura y sombreado Cloroplasto
Unión gap, Miocardiocito
Criofractura y criograbado
TEM, criograbado
Filamentos de actina
TEM, criograbado
Actina y miosina, célula muscular
TEM, criograbado
cloroplasto
TEM, criograbado
Citoesqueleto, vesículas revestidas
Microscopio Electrónico de Alto Voltaje
Mayor poder de penetración Muestras más gruesas Reconstrucción tridimensional
