Apuntes de clases. 2012 Técnicas para fibras colágenas y elásticas del Tejido Conjuntivo.
Prof. TM Patricia Toledo Rodríguez En el tejido conjuntivo se identifican varios elementos: músculo liso, estriado, eritrocitos, fibras y otros tipos celulares .Las fibras colágenas están constituidas por grupos fuertemente catiónicos dependiente de los aminoácidos que forman su cadena polipeptídica (glicoproteínas básicas) con alta proporción de glicina, hodroxiprolina y prolina, además de pequeñas cantidades de hidroxilisina de manera que se aprovecha esa característica para ser identificados con colorantes aniónicos. Se identifican cerca de 20 tipos diferentes de colágenas, reconocidas por su secuencia de aminoácidos, y sus propiedades físicas e inmunológicas. En mamíferos destacan cuatro: Tipo I : colágeno de tendones Tipo II: componente de cartílago hialino Tipo III: Piel y músculos, membranas basales Tipo IV.: principal colágeno de membranas basales (en asociación con otras proteínas) es no birrefringente. Dentro las metodologías de identificación de las fibras colágenas, destacan las técnicas Tricromicas (tres colores). Las técnicas tricrómicas tienen siempre un colorante nuclear y al menos dos colorantes aniónicos que se utilizan asociados a una molécula de heteropoliácido (HPA). Se discuten tres teorías del mecanismo de tinción. 1.- Los HPA: los más usados son el ácido fosfomolibdico PMA y el ácido Fosfotungstico PTA; éstas moléculas se usan en pasos sucesivos o en asociación a los colorantes aniónicos. Los HPA tienen la propiedad de unirse a proteínas y aminoácidos, pero no a hidratos de carbono, el e efecto fecto es la coloración selectiva de las fibras fibras de colágeno por uno de los colorantes aniónicos, cartílago y algunas
mucosustancias muestran la misma afinidad tintorial pero más leve. El ácido fosfomolíbdico no solamente produce una tinción intensa de las fibras de tejido conectivo por colorantes de grupos aniónicos, sino que también reduce la tinción del citoplasma. Los HPA forman enlaces coordinados con molibdatos o tungstato o iones de ácido fosfóricos. Son colorantes aniónicos: azul de anilina, fucsina ácida, fast green y verde luz. El uso de los HPA además favorece colorear en un medio fuertemente ácido, el pH óptimo es cerca de 1,5 (a pH 2,5 hay pérdida de un 50% de la afinidad). 2. Los HPA generarían una fuerte negatividad en la carga de las fibras de colágeno, similar a la función de un MORDIENTE. Esta teoría tiene detractores, pues deja absolutamente de lado la conocida composición de la fibras de colágeno, además de generarse un conflicto con la hemoglobina de los eritrocitos, pues tiene una alta proporción de aminoácidos básicos y no se tiñe igual que las fibras de colágeno. Se sugiere que los colorantes se unirían por fuerzas iónicas a los HPA que ya estarían unidas a las fibra de colágeno. 3. Los HPA tendrían dos maneras de unirse a los tejidos, primero por uniones ionicas de los HPA con proteínas del citoplasma que inhibirían las uniones de los colorantes en el citoplasma, la unión de los HPA a las fibras de colágeno serían por uniones no iónicas. Esta teoría tiene detractores. En general, para éstas técnicas no se recomiendan alcoholicos; los mejores resultados se obtienen con mezclas en base de mercurio (recordar desenkerizar los cortes), Formalina logran buenos resultados. Se pueden mordentaciones de las muestras fijadas con formalina con fijadora de Bouin.
fijadores fijadoras Bouin y realizar solución
Se prefiere realizar tinción nuclear con Hematoxilina de Weiger, debido a que la laca formada es más fuerte que las aluminicas, además de no requerir proceso de diferenciación. Se postula que el mecanismo de coloración no es solo atribuible al efecto de los HPA, sino que además intervendrían factores como la malla molecular formada por el entrecruzamiento de las proteínas durante la fijación lo que genera grados de permeabilidad al paso de
los colorantes, motivo por el que muestras fijadas con dialdehídos (Glutaraldehído, glioxal, etc) no son recomendables en éstas técnicas. Esto explicaría que colorantes de peso molecular menor (ácido pícrico, orange G, biebrich, azofloxina, etc) son capaces de penetrar algunas estructuras como citoplasma (poro fino) produciéndose una coloración diferencial con aquellas estructuras con una red más laxa. Según J.A. Kiernan la selectividad de éstas técnicas es aun poco entendida. En resumen: los cortes primero se tiñen con un colorante nuclear (hematoxilinas férricas frecuentemente), luego al menos dos colorantes ácidos junto a HPA, que sumado a diferencias de permeabilidad se genera la tinción selectiva de citoplasma y fibras de colágeno.
1. Método de Masson Se utiliza en general para diferenciar las fibras colágenas del músculo liso. Mecanismo: los colorantes utilizados en éste método son Solución acuosa de Biebrich Scarlet (CI 26905) + Fucsina ácida (42685) ambos en solución con ácido acético. Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (denominados colorantes sin colorear), tiñendo citoplasma, queratina y fibras musculares de color rosado a rojo. Azul de anilina (CI 42755) en medio ácido que tiñen las fibras colágenas. El azul de anilina puede ser reemplazado por verde luz al 2% (CI 42095) o fast green FCF (CI 42053) en medio ácido. Tinción nuclear con Hematoxilina de Weigert, núcleos negros
2. Método Picro-fuscina de Van Gieson Mecanismo: Se inicia con la tinción nuclear con Hematoxilina de Weigert. Luego es una solución en medio ácido se entrega a los aminoácidos carga positiva (prolina, glicina e hidroxilisina), permitiendo la coloración con la fucsina ácida (CI 42685) o el ponceau que van junto a una solución acuosa saturada de ácido pícrico, Fibras colágenas rojas. Por otra parte al ser el ácido pícrico una molécula de pequeño tamaño logra teñir el citoplasma célular de color amarillo ( un buen control son los glóbulos rojos que estén presentes en el corte histológico).
3. Método de Mallory (1905) Metodo: los colorantes utilizados son Fucsina ácida 0,1- 0,5 % en solución acuosa (CI 42685), dando la tinción nuclear. Una solución de azul de anilina (CI 42755, tener la precaución de no usar el colorante soluble en alcohol) o azul de metileno (CI 42780) para fibras colágenas; con Orange G (CI 16230) el que es una partícula muy difusible (citoplasmas) y ácido Fosfotungstico 2% o Fosfomolibdico (heteropoliácido que forma una laca entre el colágeno y el colorante).
4. Coloración diferencial de colágenas tipo I, II y III Rojo Sirius. Método: Utiliza una solución de picro sirius (rojo sirius F3BA CI 35780 0.1% - 1% en una solución acuosa saturada de ácido pícrico), los resultados son fibras de color rojo y citoplasma amarillo; las láminas al ser observadas en microscopio de polarización, la tinción lograda no es selectiva, pero ofrece una oportunidad de identificar especialmente las fibras de colágenas neo formadas, las colágenas tipo I amarillo brillante, naranja o rojo, las II (de acuerdo a orientación) azules o amarillas claras, III verde. Las fibras colágenas y reticulares son anisotrópicas en cortes longitudinales (birrefringencia amarilla) e isotrópicas en cortes transversales.
5. Método de Gomori:
Método: es un método en un paso. Utiliza una solución de Hemalumbre de Gomori (hematoxilina + alcohol absoluto + alumbre de potasio + dióxido de mercurio + agua destilada) y Colorante de Gomori (agua destilada + Chromotro 2R CI 16570+ Fast green FCF CI 42053 + ácido fosfotúngstico y ácido acético); el pH de la solución es de 2,5 a 2,7 levemente superior al óptimo para fibras colágenas, por lo que puede presentar una coloración incompleta y difusa del componente fibrilar más fino; resultando los núcleos y fibras musculares de color violeta, fibras colágenas verde y los citoplasmas rosados.
Otros métodos para fibras colágenas son: tricromicro Azan de Heidenhein, Método rápido de Mallory- Heidenhein, Tricromico de Cason, Gallegos, Gabe, Método de Ramon y Cajal para fibras reticulares, colágenas y elásticas., Método de Arteta, Método de “Allchrome” de Lillie Colorantes utilizados: Fucsina ácida: es generada a partir de la F. básica mediante la adición de grupos sulfónicos (que le dan el carácter ácido) Rojo Sirius: colorante poliazo, es una molécula de un PM más alto que la Fucsina, pero planar. Puede ser reemplazada por el colorante benzo azul BB (CI 22610), la birrefringencia ahora obtenida es azul-violeta a amarillo.
Verde Luz:
Azul de anilina: hasta el día de hoy se dan dos fórmulas diferentes de éste colorante, por lo que es posible que en las presentaciones comerciales se encuentran ambas. Acido Pícrico:
IDENTIFICACION DE LAS FIBRAS ELASTICAS. Las fibras elásticas están constituidas en un 92% por elastina y un 8% por microfibrillas. La elastina es una proteína hidrofóbica que contiene muy pocos aminoácidos con cadenas laterales ionizables, es rica en aminoácidos no polares. Las microfibrillas son ricas en aminoácidos polares, posee gran cantidad de cisternas (por lo tanto abundan los grupos SH) y un 5% de ellas corresponde a hexosas-hexosaminas (glicoproteínas). Los colorantes no serán atraídos a la elastina con fuerzas iónicas electroéstaticas, si no que se postula sea por fuerzas de Van der Waals y puentes de Hidrógeno cuando la solución colorante es alcohólica. Si se realiza un bloqueo de los grupos reactivos, se genera poco efecto en la coloración y la prevención de puentes de hidrógeno disminuye levemente la coloración, el tipo de uniones que estaría jugando un papel muy importante son las fuerzas de Van der Waals.
Mecanismo de acción Hematoxilina de Verhoeff. HEMATOXILINA: colorante aniónico ALCOHOL ABS.: solvente de la hematoxilina CLORURO FERRICO: acción de mordiente y oxidante SOLUCION DE YODO: estabilizador de la hematoxilina Las teorías que explican el mecanismo de tinción de la HV son empíricas. La capacidad de tinción de la solución de yodo disminuye en el tiempo (horas) y el efecto del yodo es aumentar la vida útil de la H Férrica. El hecho que la capacidad de tinción disminuya en el tiempo se debe a que los iones fierro están en exceso (cloruro férrico al 10%) forman un complejo metal-colorante, epro estas solucione no son indifenidamente estables. Por otro lado, el yodo puede cambiar la oxidación de los grupos SH y las microfibrillas que componen la fibras elásticas; esto resulta importante pues la unión del colorante al tejido es por puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals.
El método se realiza en dos pasos: 1. Se realiza una sobresaturación de las fibras elásticas con la Hematoxilina ferrica. 2. Se realiza una diferenciación con cloruro ferrico al 2%, el cual extrae el colorante unido inespecíficamente. Es opcional una tinción de contraste
Método de ORCEINA La Orceína es un colorante natural que se utiliza en solución alcohólica puesto que no es muy soluble en agua. Mecanismo: complejo colorante, oxaxina y azino oxaxinas básicas, se cree que une por puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o uniones no específicas con grupos aromáticos. El colorante es insoluble en agua por lo que se disuelve en alcohol; es muy importante el pH ácido se utiliza para aumentar las posibilidades de uniones por fuerzas de Vander Waals y puentes de H. Pues si se trabaja a pH neutro es un colorante ácido y colorea más fuertemente las fibras de colágeno, obteniéndose coloraciones poco selectivas. La tinción se realiza por sobresaturación y luego se diferencia con alcohol clorhídrico al 1%.
BIBLIOGRAFIA: Guía de Técnicas de Histología y Citología, segunda edición U de Chile. Manual de laboratorio clínico diagnóstico. Raimundo García del Moral, 2001 Técnicas en histología y biología celular. Luis Montuenga . 2009 Histological and histochemical Methods J.A. Kiernan 4°edición Apuntes UC
