1. OBJETO 1.1. Describir la formar de preparar el estándar de solución solución Mc Farland.
2. DESRIPCIÓN 2.1.
EQUIPOS Y MATERIALES M ATERIALES::
Frascos volumétricos de 100 ml.
Pipetas automáticas de 0.50 ml
Tubos de ensayo tapa rosca
Gradilla
2.2.
REACTIVOS.
Acido sulfúrico 95 -98 % (H2SO4) Cloruro de bario dihidratado, p.a. (BaCl2.2H2O). Agua destilada.
2.3. LA ESCALA Mc FARLAND La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina al 0.9% o solución de peptona al 0.1% en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual). La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y una suspensión bacteriana. Creamos 10 estándares (en la tabla aparece la composición de estos) y por espectrofotometría, creamos una recta patrón, de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados). La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido sulfúrico. La escala de MacFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato de bario con el número presente en la muestra
Mc Farland
BaCl2 1% (p/v)
H2SO4 1% (v/v)
u.f.c/ml
0.5
0,5
99,5 99,5
1,5x10 1,5x10
1
0,1
9,9
3,0x10 3,0x10
2
0,2
9,8
6,0x10 6,0x10
3
0,3
9,7
9,0x10 9,0x10
4
0,4
9,6
1,2x10 1,2x10
5
0,5
9,5
1,5x10 1,5x10
6
0,6
9,4
1,8x10 1,8x10
7
0,7
9,3
2,1x10 2,1x10
8
0,8
9,2
2,4x10 2,4x10
9
0,9
9,1
2.7x10 2.7x10
10
1,0
9,0
3,0x10 3,0x10
2.4. PRERACION DE LA SOLUCION Mc FARLAN 0.5 Los estándares de turbidez de Mc Farland se utilizan para estandarizar el número de bacterias aproximado en una suspensión comparando la turbidez de la misma con la turbidez del estándar. Los estándares de Mc Farland se preparan agregándole cloruro de bario a una solución de ácido sulfúrico para obtener un precipitado de sulfato de bario. Se pueden preparar estándares con varios grados de turbidez, ajustando los volúmenes de ambos reactivos, lo que representa distintas concentraciones de bacterias. El estándar usado más comúnmente en el laboratorio de microbiología para 8 los métodos de sensibilidad de rutina es de 0.5, el cual representa 1.5x10 bacterias por ml.
Reactivos Acido sulfúrico 1% v/v (H2SO4)
Agregar aproximadamente 90 ml de agua destilada en un frasco graduado de 100 ml. Con una pipeta de 1 ml agregar 1 ml de H 2SO4 Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar. Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por más de un año.
Cloruro de Bario.2H20 (1.75% p/v) (BaCl2)
Pesar 1.175 g BaCl2. 2H2O y pasarlo a u frasco graduado de 100 ml. Agregar aproximadamente 50 ml de agua destilada y mezclar bien hasta disolver. Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar. Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por más de un año.
Procedimiento.
Agregar aproximadamente 85 ml de H2SO4 (1%, v/v) a un frasco graduado de 100 ml. Con una pipeta de 0.5 ml agregar 0.5 ml de BaCl 2.2H2O (1.175% p/p) gota a gota al H2SO4 (1%, v/v) manteniendo agitación constante. Llevar a 100 ml de volumen con H2SO4 (1%, v/v) Examinar la solución visualmente para asegurarse de que sea homogénea sin precipitados visibles. Fraccionar en tubos similares a los que se van a utilizar para preparar los inóculos bacterianos (3-5 ml). Cerrar los tubos y sellarlos con Parafilm o parafina. Conservar en oscuridad a temperatura ambiente por 3 meses o más. Para tener una referencia de la turbidez, la solución se le puede medir en un turbidímetro. Cuando se realice la preparación de suspensión de microorganismos con equivalencia de 0.5 en la escala de Mc Farland se debe medir ambas soluciones, debiéndose obtener valores cercanos de turbidez.
Control de Calidad.
o
Cada vez que se a utilizar el estándar controlar si hay precipitados visibles y comprobarlo con un estándar que no este uso. Si se observan precipitados, descartar el estándar. Controlar cualquier evidencia de evaporación. Esto puede hacerse dibujando una línea en el tubo señalando el menisco en el momento de llenar los tubos. Si al usarlo el nivel de líquido está por debajo de esa marca, descartar el estándar. Luego de tres meses de uso leer la densidad óptica de un estándar
