IV CLASE METABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE ENERGIA El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que se producen en las células grac gracia iass al fluj flujo o de ener energí gíaa y a la part partic icip ipac ació ión n de las las enzi enzima mas. s. El térm términ ino o de metabolismo incluye dos tipos de procesos: catabolismo (destrucción de los alimentos para obtener energía) y anabolismo (uso de alimentos en la síntesis de las células). En el catabolismo las moléculas grandes y complejas son descompuestas en moléculas más pequeñas y sencillas con la liberación de energía. energía. En este proceso de catabolismo, la mayoría de las moléculas utilizadas como fuente de energía se convierten en produ pro ducto ctoss de des desech echoo , aunq aunque ue part partee de esta estass molé molécu cula lass más más simp simple less pued pueden en incorporarse a rutas anabólicas. En el anabolismo se sintetizan moléculas más complejas a partir de otras más sencillas con consumo de energía. energía . Aquí sucede lo contrario de lo anterior, los nutrientes se conv convie iert rten en en comp compon onen ente tess celul celulare aress (pare (pared d celu celula lar, r, memb membran ranaa cito citopl plasm asmáti ática, ca, cromosoma, citoplasma, etc.). En el catabolismo, la energía química es liberada cuando se oxidan los compuestos orgánicos o inorgánicos; siendo la mayor parte de reacciones exotérmicas, es decir, se libera energía. Las reacciones anabólicas son endotérmicas. La energía necesaria es aportada por las reacciones catabólicas, haciendo que el metabolismo en su conjunto sea un proceso energéticamente favorable. Todo el proceso ocurre a una velocidad velocidad mayor que si se tratara de una simple mezcla de los sustratos implicados. Esto se debe a la participación de las enzimas = catalizadores orgánicos que disminuye la energía de activ activaci ación ón,, aume aument ntan ando do la velo veloci cida dad d de las las reacc reaccio ione nes, s, y que que hace hace posi posibl blee el funcionamiento de los seres vivos. Muchos Muchos alimentos alimentos son insolubles insolubles en agua y son grandes y complicadas complicadas moléculas moléculas que no pasan directamente a través de las membranas celulares. Las que no las pueden utilizar hasta que no lo degraden en moléculas más pequeñas, que sean solubles. A menudo estos nutrientes insolubles están hechos de unidades repetitivas de moléculas muy pequeñas. Por ejemplo, el almidón está formado de muchas moléculas de azúcar entrela entrelazad zadas as entre entre sí hasta hasta formar formar largas largas cadena cadenass ramific ramificada adas. s. Las proteí proteínas nas están están hechas hechas por la polime polimeriz rizació ación n de muchos muchos aminoá aminoácid cidos, os, consti constituy tuyénd éndose ose una larga larga cadena. Al invertir este proceso de síntesis, se obtiene pequeñas moléculas solubles que son susceptibles de penetrar a la célula y ser utilizado como energético. Hay enzimas que catalizan este tipo de hidrólisis. Esta enzimas son extracelulares se difunden a través del medio ambiente, y catalizan la degradación de largas moléculas en pequeñas. Cada vez que se realiza la reacción, reacción, se rompe una una unidad de la macromolé macromolécula cula al mismo tiempo, siempre se consume una molécula de agua. Por esta razón se le denomina al proceso hidrólisis, lisis (rompimiento) por medio de agua. De esta manera el almidón se hidroliza obteniéndose un azúcar soluble, la maltosa. Las proteínas se hidrolizan en unidades unidades más pequeñas pequeñas llamadas llamadas péptidos; y las grasas (lípidos) (lípidos) se hidrolizan hidrolizan hasta ácidos grasos y glicerol.
PAPEL DEL ATP Para sintetizar nuevo material celular se requiere requiere energía. energía. La obtención obtención de esta energía es una de las principales ocupaciones de una célula bacteriana.
En la célula, la transferencia de electrones desde donadores a aceptores se realiza a través de intermediarios conocidos como transportadores. Al donador inicial se le conoce como donador primario , y al aceptor último, aceptor final de electrones. El cambio neto de energía de la reacción completa está determinada por la diferencia entre el potencial de reducción del donador primario y del aceptor final. Los transportadores pueden ser de dos tipos: libres, que difunden en el medio acuoso de los compartimientos celulares, y anclados a enzimas, que están unidas a las membranas de la célula. Entre los transportadores que difunden libremente, están las coenzimas: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP). Ambos son transportadores de hidrógeno y siempre transfieren dos átomos de hidrógeno al siguiente transportador de la cadena. Sin embargo, funcionan en procesos distintos dentro de la célula NAD / NADH está directamente involucrados en reacciones catabólicas y NADP / NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido trifosfato-con hidrógeno) participan en las reacciones anabólicas. La energía liberada en los procesos catabólicos de óxido reducción se almacena para ser utilizada en las funciones celulares. La energía para la biosíntesis proviene del ATP (adenosina – trifosfato), éste no es más que el ribonucleótido de adenosina con tres moléculas de fosfato unidas en serie. La energía de sus enlaces se suele emplear en las reacciones biosintéticas y otras funciones celulares; el cual, es el mismo compuesto utilizado por todas las formas de vida para almacenar y transferir energía. Además de los compuestos altamente energéticos con fosfato, en la célula también se producen otros con capacidad para almacenar la energía generada en el catabolismo. Entre estos están los derivados de la coenzima A (como la acetil-CoA), que contiene enlaces sulfoanhídrido con suficiente energía libre par sintetizar enlaces fosfato de alta energía.
PAPEL DEL ATP La eliminación de un fosfato del ATP da como resultado una cantidad adecuada de energía suficiente para llevar a cabo los diferentes pasos de las reacciones involucradas en la síntesis de materiales como CHO, proteínas, lípidos y otras como ácido murámico.
TIPOS DE REACCIONES QUE SUMINISTRAN ENERGÍA 1.
La respiración aeróbica . Es en la que se producen reacciones que suministran energía y que dependen del oxígeno. Si el sustrato es un azúcar simple y se le extrae el máximo de energía, obtenemos la siguiente reacción: C6 H12O6
+
6 O2
6CO2
+
6H2O
y
además,
se forma cerca de 38 moléculas de ATP. Todos los átomos de hidrógeno son removidos y reaccionando con el oxígeno forman agua, que es otro producto microbiano. Los átomos de carbono son separados uno del otro y adheridos al oxígeno con el fin de producir dióxido de carbono que es otro producto microbiano. En vista que el oxígeno desempeña un papel prominente debido a
que reacciona con los átomos de hidrógeno y de carbono se reconoce a esta reacción como oxidación. Las Bacterias son muy versátiles en cuanto a la gran variedad de compuestos orgánicos que utilizan en la respiración aeróbica. Esta respiración incluye todas las reacciones que proveen energía a la célula, siempre y cuando el oxígeno sirva como aceptor del hidrógeno. Se dice que el oxígeno es el aceptor terminal del hidrógeno, o bien, de los electrones que acompañan a los átomos de hidrógeno. La definición más precisa de respiración aeróbica es: la serie de reacciones que suministran energía, en las cuales el oxígeno es el aceptor final de electrones.
2.
3.
La respiración anaeróbica. Es el término que se emplea para describir las reacciones que suministran energía, en las cuales el sulfato, carbonato, o el nitrato actúan como aceptores finales de electrones. Estas reacciones se verifican en condiciones anaeróbicas. Cuando se usa el sulfato el producto microbiano es H2S, que es el análogo correspondiente al H 2O formado en la respiración aeróbica. La Fermentación. Describe las reacciones que proveen de energía y mediante las cuales algunos compuestos orgánicos actúan como aceptores finales de electrones. Por ejemplo el alcohol etílico es el producto que se obtiene cuando el acetaldehído es el aceptor final de los electrones. Cada tipo de fermentación posee un sistema para obtener energía a expensas de los compuestos orgánicos, sin usar para nada el oxígeno. Muchas bacterias y levaduras fermentadoras tienen la capacidad de vivir en medios ambientales privados de aire. Los organismos que viven por medio de la fermentación o por respiración anaeróbica se les llama anaerobios. Muchas fermentaciones producen algo de dióxido de carbón, además de que el sustrato inicial nunca es degradado por completo, y por esta razón se produce menor número de moléculas de ATP que en las respiraciones aeróbicas. C6 H12 O6 + zimasa 2 C 2 H5 OH + 2 CO2 .
2C6 H10 O5 + H2 O + diastasa 4 C 2 H5 OH
C12 H22 O11 + maltasa = 2 C 6 H12 O6 + zimasa H2O
+ 4 CO2 .
Una de las series de reacciones más importantes es la que conduce a la oxidación completa del ácido pirúvico hasta el dióxido de carbono y agua, la cual es realizada por organismos aeróbicos. Esta es una serie de reacciones cíclicas conocidas como ciclo de Krebs o del ácido cítrico, o ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los hidrógenos sustraídos durante este ciclo son oxidados por una serie de citocromos hasta ser finalmente aceptados por el oxígeno. Algunas bacterias y levaduras son capaces de utilizar las vías metabólicas respiratorias que requieren del oxígeno o bien otras vías que utilizan otro tipo de aceptor de electrones, esto, dependiendo de las circunstancias ambientales en que se encuentran. Se les dice que son anaeróbicas facultativas
ACCIONES QUIMICAS PRODUCIDAS POR LAS BACTERIAS Las bacterias, levaduras y hongos, como todas las células, producen sus procesos metabólicos, por medio de enzimas, agentes responsables de todas sus actividades sintéticas (anabólicas) y analíticas (catabólicas). Los microorganismos pueden atacar una gran cantidad de sustancias inorgánicas y orgánicas, obteniendo la energía para su normal metabolismo, así como material para su crecimiento. Cuando utilizan alimento para obtener energía provocan un proceso catabólico y esta energía la pueden extraer de los carbohidratos o de otras sustancias. Cuando utilizan alimento para crecer el sustrato es descompuesto, y de estos productos de degradación se llega a sintetizar el protoplasma celular. Todos estos procesos son llevados a cabo por enzimas. Las enzimas son proteínas simples o conjugadas, solubles, que son producidas por un organismo vivo y tienen por función catalizar reacciones específicas. Las enzimas son catalizadores orgánicos, es decir sustancias que por su presencia, cambian la velocidad de una reacción química. No inician la reacción, puesto que, sin la enzima también se realiza dicha reacción, aunque en forma sumamente lenta. Los catalizadores o enzimas al terminar la reacción en la cual intervienen se los encuentra sin modificación alguna. Por acción de las enzimas los azúcares son transformados en ácidos, las proteínas en amoniaco y los compuestos amoniacales en nitritos y nitratos. Sin enzimas no se concebiría la vida bacteriana. Esta tienen una actividad específica y cada una efectúa un determinado trabajo. Las enzimas de las bacterias pueden ser divididas en dos grupos según permanezcan confinadas dentro de las células , o sean segregadas al medio circundante . A las del primer grupo se les llama enzimas endocelulares o intracelulares y a las del segundo grupo, extracelulares o exoenzimas. Las enzimas extracelulares son las encargadas de los procesos digestivos y convierten los compuestos coloidales indifusibles, en sustancias más simples, difusibles; que pueden pasar a través de la membrana celular. Casi todas son de naturaleza proteica y a varias de ellas se les ha conseguido obtener en estado cristalizado. Ej. Tripsina, pepsina, ureasa, amilasa. A las enzimas, se las ha clasificado según su modo de actuar entre otras en enzimas amilolíticas, (que hidrolizan los almidones), proteolíticas (que hidrolizan las proteínas), lipolíticas (que hidrolizan los lípidos ). Otra designación obedece al sustrato sobre el que actúan , con la terminación “asa” . Así, una enzima que actúa sobre la lactosa, se llama lactasa, sobre la arginina se llama arginasa, etc.
La acción enzimática está influenciada en forma marcada, por la temperatura, existiendo una temperatura máxima y mínima, sobre y bajo las cuales la actividad disminuye. La mayoría de enzimas, son destruidas entre 70º y 100º C y su mayor actividad la desarrollan entre 35º y 45º C. El pH también juega un papel muy importante en la actividad enzimática. Cada enzima tiene su pH óptimo, así hay unas que actúan eficientemente a pH 7, otras a pH 9, y otras con un pH ácido. Las sales de metales como Hg, Ag, Zn, Ni, Co actúan inhibiendo la acción enzimática, formándose un compuesto complejo (“sal-metálica-enzima”). Las enzimas son en general específicas con respecto al sustrato sobre el que actúan, así, una enzima que fermenta o ataca a un disacárido, no ataca a otros; también se ha demostrado algún grado de especificidad, en las enzimas que atacan las proteínas; en cambio no se ha demostrado una especificidad marcada en las enzimas que atacan a las grasas (lipasas), pudiendo la misma enzima atacar a varias clases de grasas. Las enzimas oxidantes y reductoras parecen ser las menos específicas. Las exoenzimas o enzimas extracelulares, segregadas por los microorganismos en el medio circundante pueden ser obtenidas ya por filtración o centrifugación del medio de cultivo. En los medios que contienen carbohidratos las bacterias producen acidez y otras producen acidez y gas. La acidez se pone de manifiesto con indicadores o determinando el pH del medio por métodos colorimétricos y el gas se pone de manifiesto en campanitas (Campana de Durham) que se colocan dentro del medio de cultivo líquido, en las cuales se acumula el gas. Las enzimas proteolíticas se ponen de manifiesto en sustratos nitrogénicos (proteínas o sus productos de degradación, en la práctica se emplea las peptonas, pero mejor son las triptonas). Algunas bacterias producen como resultado de la proteólisis compuestos inodoros; otros en cambio descomponen los aminoácidos produciendo compuestos de olor desagradable. Así por ejemplo algunas bacterias atacan al triptófano (aa) produciendo como producto final: ácido-indol acético, ó ácido indol propiónico. La formación de indol puede ser detectada en los medios por diferentes métodos. El método más sencillo consiste en introducir asépticamente en el tubo con el medio de cultivo sembrado con el microorganismo una tira seca de papel filtro embebida en una solución saturada de ácido oxálico u oxalato de amonio y luego secada. La tira se coloca paralela a la pared del tubo y acodada en ángulo obtuso sobre la superficie del cultivo. Esto se hace antes de llevar el cultivo a la estufa. Se tapa con el tapón de algodón y su lectura se hace después de las 48 horas de incubación, si hay producción de indol los cristales de ácido oxálico toman color rosado. Otro de los resultados de la acción de las diastasas sobre las proteínas es la producción H2S, en este caso el sustrato sobre el cual las bacterias actúan es el aminoácido cistina. El H2S formado se investiga generalmente en los cultivos bacterianos aprovechando el ennegrecimiento que forma dicho ácido con ciertas sales como Fe, Pb, por formación del sulfuro correspondiente. Para efectuar esta reacción se sigue dos métodos: 1. Incorporando las sales metálicas en el medio de cultivo. 2. Utilizando tiras de papel de filtro embebidas en soluciones saturadas de las sales metálicas citadas y que se han dejado secar en estufa.
CH3 COO Pb
+
H 2S
PbS
+
2CH 3 - COOH
COO CH3 Acetato de plomo
+
sulfuro de H
Sulfuro de Pb + ácido acético
Otra de las enzimas proteolíticas de las bacterias (gelatinasa) tiene la propiedad de licuar a la gelatina; otras actúan sobre la leche, otras permiten a las bacterias utilizar los nitritos.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS Si queremos conocer las características de un microorganismo determinado, es necesario poder cultivarlo y mantenerlo en el laboratorio, separado de otros precedentes de su mismo hábitat, o de contaminantes ambientales. Por tanto, para cultivar un microorganismo con vistas al estudio de sus características genéticas, bioquímicas, fisiológicas u otras, son necesarios dos requisitos: primero, conseguir un medio en el que pueda crecer y, segundo obtener un cultivo puro. Anteriormente ya hemos hablado de los medios de cultivo y sus clases, ahora vamos hablar cultivos puros y la siembra de los microorganismos
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Sembrar una bacteria, es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo con las exigencias vitales del microorganismo, que permite así su desarrollo y multiplicación, si se lo coloca a una temperatura adecuada y un tiempo conveniente. Dos pueden ser las finalidades de las siembras en medios de cultivo: a) Transplante, b) Aislamiento.
Transplante.- El material que se siembra contiene una sola especie bacteriana, y su objeto es renovar el medio de cultivo, ya para perpetuar la especie de que se trate, o bien para conocer algunas de sus propiedades culturales o biológicas.
Aislamiento.- El material que se siembra contiene mezclas de especies bacterianas y su objeto es separarlas, obteniendo cultivos al estado puros.
Obtención de cultivos puros Un cultivo puro es aquel que contiene un único tipo de microorganismos y se obtiene mediante aislamiento de la progenie de una sola célula.
En 1882 Roberto Koch y sus colaboradores emplearon por primera vez agar como agente solidificante del medio de cultivo. El uso del agar supuso un avance enorme y contribuyó a la identificación de muchos de los agentes patógenos productores de enfermedades infecciosas. El agar es un polisacárido complejo obtenido de las algas rojas. En agua funde a unos 95º C y permanece líquido al enfriarse a 40º C, luego se solidifica. Para el aislamiento de microorganismos, los medios de cultivo de agar se disponen en placas de Petri, debidamente esterilizadas, en donde se vierte el medio sólido fundido. Para aislar microorganismos en placas de agar nutritivo u otros medios en placa se hace empleando métodos de siembra en placa. Este método implica la separación e inmovilización de los microorganismos individuales sobre o dentro del medio sólido. Cada microorganismo viable da origen, al crecer, a una colonia, que puede transferirse fácilmente. Siembra en placa por estría Con un asa de siembra previamente esterilizada, se toma una porción de la mezcla microbiana y se va extendiendo sobre la superficie del agar haciendo estrías en sucesivas secciones de la placa; esterilizando el asa de siembra para cada sección y al final obtendremos un agotamiento del contenido de la muestra y así podremos obtener células aisladas, por lo que obtendremos un cultivo puro. Siembra en placa en superficie o por extensión En este caso es necesario hacer diluciones de una muestra en un líquido estéril y con una pipeta estéril se pone una pequeña cantidad de la mezcla microbiana, que ya está diluida, se coloca en el centro de una placa y se extiende uniformemente sobre la superficie con una varilla doblada de vidrio estéril o con el asa de siembra., si se ha hecho correctamente obtendremos colonias aisladas. Siembra en profundidad o por vertido Se hace una serie de diluciones de la muestra original, como en el caso anterior. Alícuotas de los últimas diluciones se deposita en tubos con agar fundido y enfriarlo hasta 45º C y se mezcla por agitación. Luego se vierte a placas de Petri estériles, se deja solidificar y luego se incuba. Algunas colonias quedarán atrapadas en el interior del agar y otras crecerán en la superficie. Las técnicas de incubación varían según se trate de bacterias aeróbicas, anaeróbicas o microaerófilas; haciéndose la siembra en todos los casos en una forma más o menos parecida. Las muestras que se remiten o reciben en el laboratorio para efectuar un aislamiento pueden ser las siguientes:
1. Secreciones
Saliva Leche Semen Moco vaginal
2.- Excreciones
Orina Heces
3.- Fluidos del organismo
Sangre Suero sanguíneo Líquido cefalo- raquídeo
4.- Exudados
Pus Exudado abdominal o toráxico Exudado uterino
5.- Fragmentos de órganos y tejidos afectados
EMPLEO DE ANIMALES DE LABORATORIO EN EL AISLAMIENTO Para efectuar el aislamiento de algunos microorganismos puede emplearse animales de laboratorio, los que son inoculaos con las muestras y una vez que mueran víctimas de la inoculación o que sean sacrificados se obtendrá muestras que serán inoculadas en medios de cultivo adecuados y de estos se hará el aislamiento de la especie bacteriana en forma pura. Los animales que pueden emplearse en el laboratorio son: conejos, cobayos, ratones, ratas, hámsteres y algunos animales domésticos. Las vías de inoculación en los animales pueden ser: 1.- Administración por la vía oral. 2.- Instalación en la conjuntiva. 3.- Administración por la tráquea. 4.- Inoculación cutánea 5.- Inoculación intravaginal o intrauterina 6.- Inoculación vesical 7.- Inoculación intranasal. 8.- Inoculación intramamaria 9.- Inoculación parenteral la que a su vez puede ser: intradérmica, subcutánea, endovenosa, intramuscular, intracraneal, intraperitoneal, epidural o raquídea.
ESTUDIO SISTEMÁTICO DE LOS MICROORGANISMOS Las bacterias así como los hongos, levaduras y algas son identificados principalmente por su tamaño, forma, estructura, color, composición química, caracteres de cultivo, patogenicidad para animales etc. En cambio los virus y rickettsias son identificadas casi exclusivamente sobre la base de su estructura antigénica, huésped susceptible y aspectos inmunológicos.
Procedimiento en la identificación 1.- Morfología y tensión. Una vez aislada la bacteria, la primera etapa en su identificación es determinar a que grupo importante pertenece para esto debe estudiarse: la movilidad, (es móvil o inmóvil) utilizándose la observación por gota colgante de
cultivos frescos en medios apropiados; la morfología y propiedades tintoriales, debe determinarse primero si es bacilo o coco o espirilo, luego el tamaño y forma del mismo. En cuanto a sus características tintoriales debe determinarse si es Gram positivo o Gram negativo, así mismo si posee o no cápsula, si es ácido resistente o no. 2.-Caracteres de cultivo .-Debe hacerse un estudio cuidadosote las exigencias nutritivas del germen, exigencias de oxígeno, clases de colonias que producen (forma, tamaño, bordes, etc), fermentación de los carbohidratos y diversas pruebas bioquímicas que se tiene que realizar para cada bacteria aislada. 3.- Patogenicidad para animales de laboratorio.-Finalmente debe determinarse la patogenicidad del germen en estudio para los animales de laboratorio. Por ejemplo el Bacillus anthracis es patógeno para todos los animales de laboratorio (no para las aves).
