GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS- CUESTIONARIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1) Por PCR se amplificó un segmento del gen de la -globina de 800 kpb. El mismo contiene una secuencia de corte por SmaI a 400 kpb del extremo 5´, y otra secuencia de corte por Eco RI a 700 kpb desde el extremo 5´. a) Dibuje en el esquema cuál sería la distribución de bandas en un gel teñido con bromuro de etidio, donde en cada calle se corrió el fragmento sin cortar o los productos obtenidos luego de cortar el mismo con Sma I, Eco RI y con las dos enzimas: SmaI + Eco RI. calle 1: SmaI calle 2: Eco RI calle 3: SmaI + Eco RI calle 4: Fragmento sin cortar • • • •
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kpb
1000 -800 -600 -400 -200 -100 b) Si a partir del gel corrido en el item a) se realiza un Northern-blot utilizando una sonda radioactiva cuya secuencia es complementaria a las primeras 100 kpb desde el extremo 5´del fragmento, cómo esperaría ver la autorradiografía . Dibuje.
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1000 -800 -600 -400 -200 -100
c) Si en lugar de la sonda nombrada en el item b) se utilizara una sonda de 200 pb que hibrida con el fragmento en la secuencia comprendida entre las 300 y 500 pb a partir del extremo 5´, cómo esperaría ver el resultado de la autorradiografía. Dibuje.
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1000 -800 -600 -400 -200 -100 2) Se efectúa una PCR con los siguientes reactivos: ADN a amplificar, oligonucleótidos complementarios que delimitan una región de 300 pb (primers), buffer, Mg2+ y Taq polimerasa. Los productos obtenidos luego de las reacciones de amplificación fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Luego de la corrida electroforética, en el gel se observa: a) 1 banda a la altura del marcador de tamaño de 300 bases. b) No hay producto de amplificación. c) Varias bandas inespecíficas. d) 2 bandas. 3) A continuación se muestra el mapa de restricción de un fragmento de ADN.
SmaI
SmaI
500
900
1300 pb 1
1300
Los productos obtenidos luego de cortar el fragmento con SmaI se analizan por Southern blot utilizando una sonda de 200 nucleótidos que hibrida entre los pares de base de posición 800 y 1000 del fragmento del esquema. En la autorradiografía se visualiza: a) Dos bandas de 400 y una de 500 pb respectivamente b) Solamente una banda de 200 pb c) Dos bandas de 200 y 400 pb respectivamente d) Solamente una banda de 400 pb 4) Se realiza la técnica de detección de mutaciones con sonda alelo-específica. ¿Qué resultados espera encontrar si el paciente presenta una enfermedad recesiva? a) Que sólo hibride la sonda normal.
b) Que sólo hibride la sonda mutada c) Que no se pueda cortar con ninguna enzima de restricción d) Que tanto la sonda normal como la mutada hibriden en dos muestras de ADN del paciente. 5) Un bioquímico realiza un Southern blot de ADN genómico humano siguiendo los siguientes pasos: 1) corte del ADN genómico con enzimas de restricción, 2) separación electroforética de los fragmentos, 3) transferencia a membrana de nitrocelulosa, 4) bloqueo de la membrana con ADN de esperma de salmón, 5) calentamiento de la membrana para desnaturalizar el ADN, 6) incubación con una sonda radiactiva simple cadena de 500 bases específica para el gen que codifica para la tiroglobulina, 7) exposición con película y obtención de la autorradiografía. En la autorradiografía se puede visualizar: a) Una banda que coincide con el marcador de 500 pb. b) Se revela la membrana completa. c) Una banda que coincide con el número de bases que posee el gen de la tiroglobulina. d) Varias bandas de distinto número de bases. 6) ¿Qué resultado esperaría usted de un Southern –blot dónde el operador se olvidó de sumergir la membrana en álcali y continuó correctamente con los pasos siguientes? a) Se observa la banda específica. b) No se observa banda alguna. c) Se observan numerosas bandas inespecíficas. d) Se revela toda la membrana. 7) ¿Qué resultado esperaría usted de un Western –blot dónde el operador se olvidó de agregar el anticuerpo primario? a) Se observa la banda específica. b) No se revela nada. c) Se observan numerosas bandas inespecíficas. d) Se revela toda la membrana. 8) Para sintetizar ADNc doble cadena a partir de ARNm se necesita: a) Primers específicos, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa. b) Primers específicos, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa, nucleasa S1. c) oligo dT, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa, nucleasa S1. d) Primers específicos, oligo-dT, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA poli merasa, nucleasa S1.
9) En la reacción de PCR, cuál es el paso siguiente a la desnaturalización del ADN: a) Hibridación de los cebadores al ADN templado. b) Enfriamiento de la reacción a 72 °C. c) Extensión del cebador. d) Agregado de la Taq polimerasa. 10) Para amplificar un fragmento de ADN por PCR se debe: a) Conocer toda la secuencia a amplificar. b) Conocer las secuencias flanqueantes a dicho fragmento. c) Conocer una secuencia interna del fragmento a amplificar. d) Conocer una secuencia flanqueante y una interna del fragmento a amplificar. 11) ¿Qué resultado esperaría usted de un Northern –blot dónde el operador se olvidó de lavar la membrana luego de agregar la sonda radioactiva: a) Se observa la banda específica. b) No se revela nada. c) Se observan numerosas bandas inespecíficas. d) Se revela toda la membrana. 12) La técnica de “huellas dactilares de ADN” se utiliza actualmente en: a) diagnóstico de enfermedades hereditarias
b) la introducción de un gen de una especie no relacionada en otra especie. c) criminalística y reconocimiento de individuos por parentezco familiar. d) la detección de mutaciones en genes que producen diversas enfermedades. 13) Por PCR se amplificó un segmento del gen de la albúmina de 1000 kpb. El mismo contiene una secuencia de corte por SmaI a 200 kpb del extremo 5´, y otra secuencia de corte por Eco RI a 500 kpb desde el extremo 5´. a) Dibuje en el esquema cuál sería la distribución de bandas en un gel teñido con bromuro de etidio, donde en cada calle se corrió el fragmento sin cortar o los productos obtenidos luego de cortar el fragmento con Sma I, Eco RI y con las dos enzimas: SmaI + Eco RI. • • • •
calle 1: SmaI calle 2: Eco RI calle 3: SmaI + Eco RI calle 4: Fragmento sin cortar
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1000 -800 -600 -400 -200 -100 b) Si a partir del gel corrido en el item a) se realiza un Northern-blot utilizando una sonda radioactiva cuya secuencia es complementaria a las primeras 100 pb desde el extremo 5´del fragmento, cómo esperaría ver la autorradiografía . Dibuje.
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c) Si en lugar de la sonda nombrada en el item b) se utilizara una sonda de 200 pb que hibrida con el fragmento en la secuencia comprendida entre las 400 y 600 pb a partir del extremo 5´, cómo esperaría ver el resultado de la autorradiografía. Dibuje.
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1000 -800 -600 -400 -200 -100 14) Las vacunas obtenidas por técnicas de recombinación de ADN, son más seguras que las que se fabricaban antiguamente porque: a) Se producen en levaduras y no en bacterias. b) Se usan vectores de clonado. c) Se usan animales transgénicos d) No se utiliza el virus atenuado o inactivado, por lo cual se elimina el riesgo de infección.
15) En la terapia génica, se inserta una secuencia genética correcta para reemplazar material genético defectuoso, en un organismo vivo entero o en algunas de sus células. Para introducir eficientemente ese material genético, pueden usarse como vectores: a) plásmidos o cósmidos b) retrovirus, adenovirus o liposomas. c) adenovirus solamente d) retrovirus solamente 16) Una enfermedad está relacionada con una mutación que afecta el sitio de corte de una enzima de restricción. Este conocimiento puede ser utilizado para desarrollar un método de diagnóstico basado en a) huellas dactilares de ADN b) RFLP c) Clonado de ADN
d) Northern blot 17) Indique cuál de los siguientes pasos NO corresponde a la detección de huellas dactilares de ADN. a) corte con enzimas de restricción b) transferencia a membrana de nitrocelulosa c) hibridación con sondas alelo específicas d) electroforesis en gel de agarosa
18) Si necesitamos amplificar un fragmento específico de ADN, las técnicas que actualmente pueden utilizarse son: a) Secuenciación y Northern blot. b) Southern blot c) Clonado en bacterias mediante vector y Reacción en cadena de la polimerasa d) Amplificar el ADN específico en bacterias utilizando un vector de expresión. 19) ¿Cómo deberíamos proceder si queremos producir una vacuna para Hepatitis B por técnicas de ADN recombinante? a) Necesitamos conocer la secuencia del ADN correspondiente a una proteína glicosilada de superficie del virus de Hepatitis B y expresarlo en levaduras. b) Necesitamos inactivar el virus de Hepatitis B y clonar el ADN de todas sus proteínas. c) Necesitamos conocer la secuencia del ADN correspondiente a un antígeno glicosilado de superficie del virus de Hepatitis B y expresarlo en bacterias. d) Necesitamos inactivar el virus de Hepatitis B y clonar el ADN de algunos de sus antígenos de superficie y expresarlos en bacterias. 20) Para la realización de un Northern Blot ¿qué pasos cree conveniente seguir? e) Digerir el ADN, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. f) Aislar el ARN total, digerirlo con enzimas de restricción, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. g) Aislar el ARN mensajero, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. h) Desnaturalizar el ADN por calor, correrlo en un gel de agarosa, transferir a una membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. 21) Usted está trabajando en la industria farmacéutica y le proponen producir insulina por biotecnología a gran escala. a) Indique que información necesita y cuáles son las herramientas de biología molecular con las que debería contar. b) Explique paso a paso cómo procedería y las técnicas a utilizar. c) ¿Le parece que este sistema es más económico que el de purificar la proteína desde el páncreas de vaca o cerdo? ¿Por qué? d) ¿Qué puede comentar acerca de la seguridad de su utilización en individuos diabéticos frente a la insulina extraída desde vacas o cerdos? 22) Para la realización de un Southern Blot, ¿qué pasos cree conveniente seguir? a) Aislar el ARN total, separar por tamaño, transferir a una membrana e identificar un fragmento b) Aislar el ADN, digerirlo con enzimas de restricción, separar por tamaño, transferir a una membrana, desnaturalizarlo e identificar un fragmento de interés mediante el uso de una sonda. c) Aislar las proteínas de un tipo celular, separarlas por tamaño en gel de poliacrilamida-SDS, transferirlas a una membrana y reconocer una proteína de interés mediante el uso de anticuerpos. d) Desnaturalizar el ADN por calor, cortarlo con enzimas de restricción, separarlo por tamaño, transferir a una membrana e identificar un fragmento mediante el uso de una sonda. 23) Las bibliotecas de ADN copia son: a) Las que contienen todos los fragmentos de ADN derivados de un genoma particular.
b) Las que contienen las secuencias de los ARNm de los genes que se expresan en una determinada célula o tejido. c) Las que contienen los genes que se expresan en un grupo de tejidos de un genoma particular. d) Las que contienen las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificados en los genes de un organismo. 24) Con el objetivo de producir insulina por ingeniería genética a gran escala, necesitaremos: a) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de clonado para cada cadena en bacterias. b) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de expresión en un organismo eucariota como las levaduras. c) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de clonado para cada cadena en bacterias y luego unir las cadenas in vitro. d) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de expresión en bacterias para cada cadena, purificarlas y luego unir las cadenas in vitro. 25) A usted lo contratan en el Ministerio de Salud para diseñar proyectos para el estudio epidemiológico de enfermedades genéticas conocidas. Después de una evaluación exhaustiva de la situación, se decide a utilizar la técnica de “sondas alelo- específicas”. a) ¿Cuál es la información previa que debería tener para aplicar correctamente esta técnica? b) Explique brevemente todos los pasos necesarios para la obtención de los resultados por esta técnica. c) Si en una familia donde existen individuos que sufren de una determinada enfermedad genética, le da como resultado de la técnica que son todos normales ¿Qué se le ocurre que podría haber pasado? d) Un médico del mismo grupo le informa que Usted podría haber utilizado también la técnica de “testeo de mutaciones por PCR”. Explique en qué se basa esta afirmación. 26) Usted necesita realizar un estudio de detección de enfermedades genéticas conocidas dentro de una población. Si dichas mutaciones no ocurren dentro de sitios de restricción de endonucleasas, qué técnicas podría utilizar? a) Sondas alelo-específicas y/o testeo de mutaciones por PCR. b) Huellas digitales de ADN o DNA fingerprint. c) Clonado de ADN en bacterias y Southern Blot. d) Polimorfismos en el tamaño de fragmentos de restricción (RFLP). 27) ¿Cuál de los siguientes procedimientos NO es parte del proceso normal para la obtención de un clon de ADN recombinante en bacterias? a) Digestión del ADN celular y plasmídico con endonucleasas de restricción. b) Producción de un ADN recombinante usando ADN ligasa y una mezcla de de ADN celular y plasmídico digerido con enzimas de restricción. c) Separación del ADN recombinante por electroforesis usando la técnica de Southern blot para determinar el tamaño del fragmento deseado. d) Transformación de bacterias con el plasmido recombinante y selección usando antibióticos 28) Explique en qué consiste paso a paso la técnica de Secuenciación de Sanger. a) Se secuenció un fragmento de ADN de un individuo normal y de un paciente. El patrón de bandas obtenido se muestra abajo. Leyendo la secuencia de nucleótidos escriba ambas secuencias marcando la diferencia entre ambas. Normal A
C
Paciente G
T
A
C
G
T
29) ¿Cuál de las siguientes afirmaciones NO CORRESPONDE a la técnica de Reacción en cadena de la polimerasa? a) Se agregan alta concentración de primers, los cuatro deoxirribonucleótidos fosfato, ADN polimerasa termoresistente y la muestra de ADN específica. b) La muestra de ADN específica se trata con álcali para ser desnaturalizada. c) Luego de separar las cadenas del ADN específico, se baja la temperatura para que los primers puedan complementar con el fragmento de ADN. d) La ADN polimerasa termoestable cataliza la síntesis del ADN específico en dirección 5´ a 3´. 30) Se denomina biblioteca genómica a: a) Un listado informatizado de secuencias de ADN conocidas. b) Bacterias con plásmidos que contienen fragmentos de ADN representando la información genética de un organismo. c) Bacterias con plásmidos que contienen secuencias de ADNcopia representando la infor mación genética de un tejido específico. d) Una recopilación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas en los genes. 31) ¿Cuál de las siguientes herramientas de la tecnología del ADN recombinante está INCORRECTAMENTE apareada con su uso? a) endonucleasas de restricción - producción de fragmentos de ADN para el clonado de genes. b) ADN ligasa - enzima que corta ADN y crea extremos cohesivos. c) transcriptasa reversa - producción de ADNc a partir de ARNm. d) electroforesis - análisis del polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RLFP). 32) Usted está trabajando en el Plan Nacional de Investigación en Diabetes y necesita clonar el gen de la Acetil CoA Carboxilasa, una enzima de la síntesis de ácidos grasos, con el objetivo de estudiar la regulación de dicho gen por insulina en diferentes condiciones metabólicas. a) ¿Qué técnica utilizaría para estudiar la expresión del gen de la Acetil Coa Carboxilasa? b) Explique brevemente en qué consiste la técnica que eligió y qué elementos necesitaría en este caso en particular. c) En un plan de detección de enfermedades genéticas, descubre que existe un porcentaje de individuos que posee una mutación del gen de la Acetil CoA Carboxilasa, que genera un nuevo sitio de restricción para Eco RI dentro del mismo. Utilizando una sonda marcada radioactivamente como se indica en la figura, ¿cuál le parece que sería la calle de la autorradiografía correspondiente a la muestra de un individuo normal, cuál de un portador y cuál de un individuo enfermo? Justifique. El gen entero mide 2 Kb. I------------------ 2 Kb ----------------------I 1,5 Kb
0,5 Kb
I---------------------------------- I--------------I
Eco RI
Eco RI (sitio mutado) Eco RI
Sonda
1
2
3
33) Se transforman bacterias Escherichia coli competentes con un plásmido recombinante el cual posee un gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que codifica para la -galactosidasa el cual está interrumpido por fragmento de ADNc. Se ponen a crecer las bacterias en agar nutritivo con ampicilina (en presencia de IPTG y sustrato cromogénico X-Gal) en estufa a 37ºC. Al día siguiente se observa: a) Un sobrecrecimiento bacteriano. b) Un número reducido de colonias azules. c) Un número reducido de colonias blancas. d) No crecieron bacterias. 34) Se transforman bacterias Escherichia coli competentes con un plásmido recombinante que posee el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que codifica para la beta-galactosidasa. Este último está interrumpido por el fragmento de ADNc. Se ponen a crecer las bacterias en agar nutritivo con el sustrato cromogénico X-gal y tetraciclina en estufa a 37ºC. Al día siguiente se observa: a) Un sobrecrecimiento bacteriano. b) Un número reducido de colonias azules. c) Un número reducido de colonias blancas. d) No crecieron bacterias 35) ¿Qué esperaría obtener para un resultado satisfactorio de clonado de ADN realizado con un vector que confiere resistencia a Ampicilina y cuyo sitio de clonado múltiple contiene el gen de la βgalactosidasa, tras colocarse el sustrato de dicha enzima en el medio de cultivo: a) Colonias azules en ausencia de ampicilina. b) Colonias azules en presencia de ampicilina. c) Colonias blancas y azules en ausencia de ampicilina. d) Colonias blancas en presencia de ampicilina.
