REKAYASA GENETIKA
1.
Pengertian Rekayasa Genetika
Rekayasa genetika ad adal alah ah su suat atu u te tekn knik ik bi biot otek ekno nolo logi gi ya yang ng di digu guna naka kan n un untu tuk k mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan. DNA Rekombinan adalah Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ kendaraan pemindah!. Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut" # $e $eknik knik mengisolasi mengisolasi DNA% # $e $eknik knik memotong DNA dengan menggunakan en&im retriksi endonuklease% endonuklease% # $e $eknik knik menggabung/ menyambung menyambung DNA dengan dengan menggunakan en&im ligase% # $e $eknik knik memasukkan DNA kedalam sel hidup 'vektor( # )e )ektor ktor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa. Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu plasmid dan en&im. *(
+lasmid
+lasmid +lasmi d ada adalah lah mol moleku ekull DNA berantai berantai ran rangka gkap p dan ber berben bentuk tuk cin cincin cin.. +la +lasmi smid d ditemukan didalam sel bakteri dan dapat berbiak secara bebas, lepas dari kromosom induk. Dalam rekayasa genet genetika, ika, plasmi plasmid d berpe berperan ran sebagai vektor 'kend 'kendaraan( araan( yang digun digunakan akan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing. euntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke sel yang lain, misalnya melalui cara transformasi. etika satu gen asing! 'biasanya diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik( telah disisipkan ke dalam satu plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut gen ke dalam sel bakteri. +lasmid yang membaa gen tersebut siap di absorpsi dan di replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang dihasilkan akan mearisi gen- gen baru. elanutnya, setiap bakteri didalam kultur gen- gen akan menginstruksi, misalnya hasilkan hormon insulin manusia!. Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah" # onugasi" pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar kedua sel. # $ransformasi" pengambilan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan lingkungan sekitarnya. # $ransduksi" pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui perantara
0(
1n&im
Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan penting. edua macam bahan kimia tersebut adalah enzim pemutus (retriksi endonuklease) dan en&im perekat (ligase). Enzim retriksi endonuklease merupakan en&im khusus dari bakteri yang berguna sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya untuk melaan DNA asing yang menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa genetika, en&im tersebut bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi untuk memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus. 1n&im retriksi endonuklease memiliki dua keutamaan. +ertama, memiliki fungsi kera spesifik. Dalam hal ini en&im mampu mengenal dan memotong urutan nukleotida tertentu pada DNA. edua, mampu menghasilkan potongan- potongan runcingketika memotong rantai ganda DNA. 2ragmen- fragmen yang dihasilkannya adalah berupa uung runcing 'uung lengket( yang terdiri atas untaian tunggal. etiap uung dari fragmen memiliki bagian yang menorok dengan urutan basa yang dapat dikenali dan dipasangi oleh basa yang terletak di uung untaian lainnya. Misalnya, uung untaian tunggal dengan urutan basa AA$$ pada satu uung dan $$AA pada uung yang lain. edua fragmen tersebut dapat disambungkan sehingga membentuk satu untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim ligase berfungsi untuk merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/ potongan- potongan DNA.
2.
a(
Teknik- teknik Rekayasa Genetika
$eknik +lasmid Rekayasa 3enetika Melalui teknk plasmid dalam rekayasa genetika, para ahli dibidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit, adaptif kekeringan dan kondisi tanah yang tidak subur, hean transgenik dan lain- lain.
3ambar. Rekayasa genetika dengan plasmid bakteri
b(
$eknik 4ibridoma $eknik hibridoma adalah penggabungan dua sel dari organisme yang sama ataupun dari sel organisme yang berbeda sehingga menghasilkan sel tunggal berupa sel hibrid 'hibridoma( yang memiliki kombinasi sifat dari kedua sel tersebut. 5ontoh teknik hibridoma adalah pembuatan antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel klon yang hanya mengenal satu enis antigen. +embentukan antibodi monoklonal dilakukan dengan menggunakan kelinci atau tikus. 6angkah pertama adalah mengineksikan antigen ke tubuh kelinci atau tikus percobaan, kemudian limpanya dipisahkan. elanutnya dilakukan peleburan sel- sel limpa dengan selsel mieloma 'sel- sel kanker(. ekitar *7 dari sel limpa adalah sel plasma yang menghasilkan antibodi. edangkan *87 sel hibridoma akhir terdiri dari sel yang menghasilkan antibodi. etiap sel hibridoma hanya menghasilkan * antibodi. Disini teknik seleksi dikembangkan untuk mengidentifikasi sel hibridoma, kemudian dilakukan pengembangan atau pengklonan berikutnya. lon yang diperoleh dari hibridoma berupa antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal dapat disimpan beku, kemudian dapat diineksikan ke dalam tubuh hean atau dibiakkan dalam suatu kultur untuk menghasilkan antibodi dalam umlah besar.
3ambar. $ehnik pembuatan antibodi monoklonal oleh ohler dan Milstein egunaan antibodi monoklonal" 9 +ara ilmuan berharap dapat menggunakan antibodi monoklonal dalam pemgobatan kanker. 9 :ntuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin '453( dalam urine anita hamil.
9 :ntuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan kelebihan obat digo;in dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini. 9 Mencegah penolakan aringan terhadap sel hasil transplantasi aringan lain.
a(
$eknik $erapi 3enetik
$erapi gen diartikan sebagai upaya memperbaiki atau mengganti gen- gen yang menyebabkan suatu penyakit. $erapi ini dilakukan dengan mengganti gen- gen yang tidak dapat bekera dengan salinan gen yang normal ke dalam sel. +ada pertengahan tahun *<<8, terapi genetik untuk mengobati penyakit menurun dan kanker kulit ganas. +ara ahli berusaha melaan gen- gen perusak dalam inti sel itu dengan berbagai cara, upaya yang dirintis tersebut dikenal dengan terapi genetik. ayangnya penemuan itu tidak segera dapat diterapkan. Dalam rekayasa genetika ada kode etik yang melarang keras percobaan ini pada manusia. Rekayasa ini dikhaatirkan disalahgunakan untuk mengubah gen pembaa sifat manusia, misalnya untuk membuat manusia super. Namun para ahli tidak selamanya bersikap kaku sebab berbagai penyakit fatal memang susah disembuhkan kecuali dengan terapi genetik. Maka munculah pendapat tentang perlu adanya dispensasi. Dispensasi itu dikeluarkan oleh omite Rekayasa 3enetik Nasional Institut of Healt 'N=4( di Amerika erikat yang mengi&inkan penerapan terapi genetik untuk dua enis penyakit yaitu penyakit menurun yang sangat arang seperti Adenosine Deaminase Deficiency 'ADD( dan seenis kanker kulit yang ganas. ADD adalah kelainan yang menyebabkan penderitanya tidak memiliki daya tahan tubuh sama sekali. ontak dengan kuman apapun akan menyebabkan kematian. Rusaknya kekebalan pada ADD teradi akibat sel- sel darah tidak mampu memproduksi en&im Adenosine Deaminase 'AD( yang diperlukan untuk membangun daya tahan tubuh. b(
$eknik loning
loning berasal dari kata >unani kuno, clone yang berarti ranting atau cangkokan. Dalam bahasa =nggris,clone 'klona( digunakan untuk menyebut sekelompok makhluk hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual. =stilah clone 'klona( pertama diusulkan oleh Herbert Webber pada tahun *<8?. loning dapat dilakukan dengan transfer gen, transfer embrio dan transfer inti. @rganisme hasil kloning akan memiliki salinan genetika yang sama persis dengan makhluk hidup yang lain. . !ransfer "en loning ini dilakukan dengan menyisipkan potongan gen yang dikehendaki dari suatu spesies lain sehingga spesies ke spesies lain sehingga spesies yang di klon tadi akan memiliki sifat tambahan sesuai dengan gen yang telah di sisipkan ke dalam sel tubuhnya. 0.
!ransfer Embrio $ransfer embrio ini dilakukan dengan alan mengambil ovum kemudian membuahinya dengan sperma, setelah teradi &igot yang akan berkembang menadi embrio, embrio- embrio ini di transfer atau ditanam dalam rahim individu betina sampai lahir menadi individu deasa.
?.
!ransfer Inti +rinsip dari transfer inti yaitu dengan memasukkan inti sel 'nukleus( dari satu spesies ke dalam sel spesies lain yang sebelumnya inti selnya telah dibuang atau dikosongkan. +ada tahun 1952 R!bert "rigs dan T#!$as %. King 'A( mencoba teknik kloning pada katak. epuluh tahun kemudian &19'2( %!#n ". G)r*!n uga mencoba teknik kloning pada katak, namun prcobaannya menghasilkan banyak katak yang abnormal atau cacat. 3urdon kemudian menyempurnakan percobaannya sehingga menghasilkan banyak katak yang tumbuh normal dan berkembang menadi deasa. +ada tahun 19+', Steen Wikka*sen '=nggris( mengklona sapi dengan tuuan komersial dengan metode transfer inti. =a bekera sama dengan 6embaga 3renada 3enetics. +ada tahun 199' Ian Wi,$)t mengklona domba. =a menggunakan sel kelenar susu domba finn dorset sebagai donor inti dan sel telur domba blackface sebagai resipien. el telur domba blackface dihilangkan intinya dengan cara mengisap nukleusnya keluar dari sel menggunakan pipet mikro. emudian, sel kelenar susu domba finn dorset difusikan dengan sel telur blackface yang tanpa nukleus. 4asil fusi ini kemudian berkembang menadi embrio dalam tabung percobaan dan kemudian dipindahkan ke rahim domba blackface. emudian embrio berkembang dan lahir dengan ciri- ciri sama dengan finn dorset . Domba hasil kloning ini diberi nama Dolly. Dolly disuntik mati pada tanggal * februari 088? karena menderita penyakit yang sulit disembuhkan. +erlu diperhatikan baha Bilmut melakukan 0CC percobaan kloning dan dari sekian banyak percobaan, hanya 0< yang berhasil menadi embrio domba yang dapat ditransplantasikan ke rahim domba, dan hanya satu yang menadi domba normal. Dengan demikian, tingkatkeberhasilan kloning domba masih sangat rendah '+urves et al. 088(.
+lasmid dan +enggunaannya dalam Rekayasa 3enetika A. Pengertian P,as$i* Sebagai ekt!r *a,a$ Rekayasa Genetika
)ektor merupakan molekul DNA yang membaa suatu DNA asing kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi dalam sel inang. alah satu vektor yang bisa digunakan untuk membaa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. +lasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa genetika.
a. b. c. d.
*. 0. ?. .
+lasmid adalah molekul DNA sirkuler 'lingkaran tertutup( yang berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. +lasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. +lasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. +lasmid inilah yang berfungsi sebagai pembaa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. +lasmid memilki ciri-ciri antara lain " berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda 'double stranded( dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti terdapat di luar kromosom secara genetik dapat ditransfer secara stabil Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat diantaranya sebagai berikut " ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya mempunyai sekurang-kurangnya 0 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing memiliki titik aal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang
Menurut tuuan penggunaannya, plasmid dibedakan menadi 0 yaitu " *. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid p:5 *< dan pR ?00 0. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid $i 3ambar plasmid pR ?00 dengan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar*.
3ambar *. +lasmid pR ?00 3ambar plasmid p:5 *< dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat dilihat pada gambar0.
3ambar 0. +lasmid p:5 *< ". Keg)naan P,as$i* +lasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membaa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut. . Pr!ses /engg)naan /,as$i* *i *a,a$ rekayasa genetika
*.
0.
?.
. E.
+enggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. +roses penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut " penentuan terlebih dahulu enis plasmid yang hendak digunakan sebab ada beberapa enis plasmid seperti pR ?00 dan p:5*< yang bisa digunakan untuk prokariot dan plasmid $i yang bisa digunakan untuk organisme eukariot bila plasmid telah ditentukan maka selanutnya adalah menentukan tempat pengenalan en&im restriksi 'pemotongan( yang hendak digunakan sebagai tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel inang apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah selanutnya adalah menyiapkan en&im restriksi sebagai pemotong plasmid. 1n&im yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal " 1coR* langkah selanutnya adalah plasmid dipotong dengan en&im restriksi yang sesuai pada daerah potongannya plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang telah dipotong uga dengan en&im restriksi yang sama dengan pemotong plasmid
0. Eni$ restriksi sebagai /e$!t!ng /,as$i* :ntuk memotong plasmid digunakan en&im restriksi. 1n&im restriksi adalah en&im yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. 1n&im restriksi disebut sebagai gunting biologi. 1n&im ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. +rinsip kera en&im restriksi adalah" *. 1n&im restriksi yang digunakan adalah en&im endonuklease restriksi. 1n&im pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut 0. itus pengenalan en&im restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya ?. +emotongan en&im restriksi akan menghasilkan potongan yaitu uung kohesif 'sticky end( dan uung rata 'blunt end(.
+erbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end dapat dilihat pada tabel *. berikut ini.
erbagai contoh restriksi en&im yang mengenali pada situs pemotongan tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 0.
+roses pemotongan DNA digambarkan pada gambar ?. berikut ini
3ambar ?. +emotongan en&im restriksi pada DNA E. Eni$ igase sebagai /enye$b)ng /,as$i* *engan 0NA asing 1n&im ligase adalah en&im yang berfungsi untuk menyambung dua uung potongan DNA. 1n&im ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. #oli dan DNA ligase dari $age !%. +rinsip kera en&im ligase sebagai berikut" *. 1n&im ligase menyambung dua uung DNA yang semulanya terpotong 0. penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 0 uung DNA melalui ikatan kovalen antara uung ?F@4 dari utas satu dengan uung EF+ dari utas yang lain ?. +enggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua uung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menadi s atu.
3ambar struktur en&im ligase dapat dilihat pada gambar berikut ini "
3ambar . truktur en&im ligase
+roses penyambungan DNA ligasi pada daerah pemotongan digambarkan pada gambar E.
3ambar E. +enyambungan DNA ligase pada potongan DNA 3. Pe$!t!ngan *an /enya$b)ngan /,as$i* *an 0NA asing se#ingga *i#asi,kan P,as$i* Rek!$binan :ntuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan plasmid yang ada. +lasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. ecara sederhana prosedur untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut" *. menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu 0. menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor ?. pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan en&im restriksi semisal dari 1. coli
.
pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan en&im restriksi yang sama yaitu 1. 5oli E. hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan menggunakan en&im penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat uung ?F@4 dengan uung EF+ dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu G. terbentuklah plasmid rekombinan yang membaa DNA asing dengan sifat tertentu tersebut. +lasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh organisme transgenik 3ambar proses terbentuknya +lasmid rekombinan sebagai hasil penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat pada gambar G berikut ini.
3ambar G. +enyambungan +lasmid dengan DNA asing G. P,as$i* Ti el-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning, akan tetapi ada suatu bakteri yaitu Agrobacterium tumefaciens yang dapat membaa plasmid berukuran 088 kb dan disebut dengan plasmid $i '$umor inducing atau penyebab tumor(. akteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil khususnya padi. etika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid $i yang disebut dengan $-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman menyebabkan pertumbuhan sel-sel yang tak terkendali, akibatnya akan terbentuk tumor.
+lasmid $i rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah $-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. 3en target ini selanutnya akan diekspresikan dengan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam prakteknya ukuran plasmid yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun ternyata apabila bagian $-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid $i, integrasi DNA tanaman masih dapat teradi asalkan $-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada dalam satu sel Agrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya
dilakukan pada $-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid 1. 5oli. elanutnya plsmid $-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciensyang membaa plamid $i tanpa bagian $-DNA. +erbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada $DNA.
3ambar. +lasmid $i +emanfaatan plasmid $i dalam rekombinan tumbuhan sudah banyak dimanfaatkan seperti plasmid $i Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk pembuatan tanaman kapas t yang tahan terhadap hama ulat. :lat yang memakan tanaman akan mengalami kematian. +emanfaatan plamid ini uga untuk meningkatkan produksi tanaman. Misalkan saa tanaman yang mengandung protein tertentu setelah direkayasa dengan menggunakan plasmid rekombinan ini. ehingga pada saat makan tanaman ini sudah mengandung protein tertentu.
3ambar. Rekayasa tanaman dengan menggunakan +lasmid $i
Dari gambar di atas dapat dielaskan baha penggunaan plasmid $i dilakukan dengan cara menyambung plasmid dengan DNA asing. +emotongan DNA dilakukan dengan menggunakan en&im restriksi kemudian masing-masing potongan dilekatkan dengan ligasi DNA terbentuklah plasmid rekombinan. ebagai hasilnya plasmid rekombinan dimasukan dalam nukleus tanaman melalui fusi protoplasma dan plasmid rekombinan akan berfusi dengan inti tanaman. +rotopalasma selanutnya dikulturkan dalam media kultur aringan kemudian setelah terbentuk tanaman, setelah itu tanaman ditumbuhkan pada habitatnya. $anaman yang dihasilkan akan memiliki sifat tertentu sesuai dengan sifat DNA asing yang digunakan. ehingga apabila kita memakan tanaman tersebut berarti telah mengkonsumsi protein tertentu. ifat inilah yang mulai dikembangkan pada tanaman.
