Rekayasa Genetika Pada Tembakau

MAKALAH REKAYA REKAYASA GENETIKA GENE TIKA Penyisipan Gen Apoptin Disertai GFP pada Tanaman Tembaka o!e" #akteri Agrobacterium #akteri Agrobacterium Tumofaciens Tumofaciens

Ke!ompok $ Fas Fasti tina na Prima Prima %&'( %&'()' )')* )*'$ '$ Fami Fami!a !a Anin Anindi dia a %&'( %&'()' )')+ )+,' ,' Gio-a o-anni A. P %&'()%$%// M". A. A. H. 0in1i 0in1i %&'()'&&,' %&'()'&&,' Nadia Tada Tada A %&'()%&)$$ %&'()% &)$$ Sonia Limoes %&'()%$%)$

PR2GRAM ST3DI TEKN2L2GI #I2PR2SES DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAK3LTA FAK3LTAS S TEKNIK TEK NIK 3NI0ERSITAS 3NI0 ERSITAS IND2NESIA IND2NESI A

DEP2K4 $'%/

[1]

KATA PENGANTAR Puji serta syukur penulis panjatkan atas kehadiran Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat limpahan nikmat akal dan rahmat-Nya penulis ini dapat menyelesaikan menyelesaikan makalah tepat waktu. Segala halangan dan rintangan yang penulis hadapi selama pembuatan makalah ini menjadi pemacu bagi penulis untuk t etap terus belajar dan memperbaiki diri. Makal Makalah ah ini berisi berisi cara cara trans trans!r !rmas masii gen ap!pt ap!ptin in ke tanama tanaman n tembak tembakau au yang yang dirangkai penulis berdasarkan hasil re"iew jurnal penelitian. #p!ptin yang merupakan gene of interest  interest  ditra ditrans ns!rm !rmasi asi ke tanama tanaman n menggu menggunak nakan an Ti plasm plasmid id yang yang dikan dikandun dung g !leh !leh  Agrobacterium  Agrobacterium Tumefaciens Tumefaciens. $asilnya, tanaman tembakau yang terineksi akan mengalami tum!r. %i tempat tum!r itulah %N# tanaman tembakau termutasi dengan gene ap!ptin. Bapak Dr. Dr. Muhama Muhamad d Sahla Sahlan n M.Eng  M.Eng  Penuli Penulis s mengu mengucap capkan kan terima terima kasih kasih kepad kepada a Bapak selaku selaku d!sen d!sen dan Chandra Dwi   selaku asisten d!sen pengampu mata kuliah &ekayasa 'enetika. Tanpa bantuan serta bimbingan mereka penulis tidak akan mampu menyelesaikan makalah dengan baik. Selain itu, penulis juga berterima kasih kepada semua pihak yang memberikan k!ntribusi baik secara langsung maupun tidak langsung. Penulis Penulis menyadar menyadarii bahwa bahwa makalah makalah 5Penyisipan Gen Apoptin Disertai GFP pada Tanama naman n Tembak mbaka a o!e" o!e" #akt #akter erii  Agrobacterium Tumofaciens6 Tumofaciens6 masi masih h jauh jauh dari dari sempurna. (leh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik serta saran membangun dari pembaca. %ep!k, )* N!"ember +* Tim Penulis

[2]

DAFTAR ISI

#T# PEN'#NT#&................................................................................................................+ %#/T#& 0S0............................................................................................................................ ) 1#1 0 2 PEN%#$343#N.........................................................................................................5 ..

4#T#& 1E4##N'...........................................................................................5

.+.

&3M3S#N M#S#4#$.......................................................................................5

.).

T363#N............................................................................................................ 5

1#1 00 2 PEM1#$#S#N.......................................................................................................... +

Persiapan trans!rmasi gen ke tumbuhaN................................................................

+.

7hicken #nemia 8irus........................................................................................

+.+

#p!ptin..............................................................................................................9 +.+.

+.)

Mengis!lasi #p!ptin dari %N# 7#8............................................................: '/P ;'reen /lu!rescent Pr!tein<......................................................................=

+.). +.5

Mengis!lasi '/P........................................................................................> #gr!bacterium tumeaciens...............................................................................>

+.5.

Plasmid Ti.................................................................................................

+.5.+

&egi!n 'en 8irulensi...............................................................................+

+.5.)

&egi!n Transer-%N# ;T-%N#<.................................................................)

+.5.5

Mekanisme 0neksi 'enetik #gr!bacterium ke Tanaman..........................)

).

Trans!rmasi...........................................................................................................9

)..

Teknik Trans!rmasi #gr!bacterium ke Tanaman melalui 8ekt!r 1iner............9

).+.

M!diikasi 'en #p!ptin dengan Penambahan  Green luorescent !rotein ;'/P< ??????????????????????????????????=

5

Trans!rmasi Plasmid &ek!mbinan ke dalam #gr!bacterium.................................+

5.

Trans!rmasi Plasmid E. 7!li e %alam #gr!bacterium..................................++

5.+

Tahapan Trans!rmasi Plasmid E. 7!li e %alam #gr!bacterium...................+)



0neksi 'enetik e Tembakau %engan Menggunakan #gr!bacterium.....................+)

.

Persiapan #gr!bacterium dan Tembakau........................................................+5

.+

0n!kulasi dan !kulti"asi.................................................................................+5

.)

Seleksi dan &egenerasi...................................................................................+

1#1 000 2 ES0MP34#N.........................................................................................................+9 %#/T#&

P3ST##..............................................................................................................+:

[3]

#A# I PENDAH3L3AN %.%. LATAR #ELAKANG  #p!ptin merupakan pr!tein yang mampu memr!gam kematian sel ;ap!pt!sis<. #p!ptin ditemukan pada 7hicken #nemia 8irus ;7#8< yang menyerang anak ayam. 8irus ini menyebabkan anemia pada anak-anak ayam karena sel darah merahnya mengalami ap!pt!sis. Siat tersebut dapat dimanaatkan sebagai terapi gen sel-sel yang mengalami kanker.

Secara alamiah, #p!ptin berada pada sit!plasma setiap sel. 6ika sel tersebut telah tua dan telah tiba saatnya untuk mati, ap!ptin tersebut akan pindah ke dalam nukleus dan merilis pr!gram kematiannya. #kan tetapi, pada sel kanker gen ap!ptin terjebak dalam nukleus tanpa bisa berekspresi dan memr!gam kematiannnya. 0tulah sebabnya sel kanker  terus berkembang secara tidak n!rmal. Pembuatan pr!duksi ap!ptin pr!tein sebagai yang mampu untuk menekan kanker  sudah terbukti. Yi Tang, pr!es!r kimia dan teknik bi!-m!lekul dari "ni#ersit$ of California %os Angeles  ;374#< berhasil mengembangkan kapsul kecil dari p!limer larit air yang aman mampu mengantarkan pr!tein k!mpleks ke inti sel kanker untuk memicu kematian. @at penghancur kanker, ap!ptin, adalah sebuah pr!tein k!mpleks yang berasal dari "irus anemia pada burung, Chicken Anemia &irus ;7#8<. umpulan pr!tein ini akan terakumulasi dalam inti sel kanker dan memberikan sinyal ke sel kanker untuk melakukan pr!gram penghancuran diri. %alam melakukan misinya tidak mengkhawatirkan karena tidak akan membahayakan sel n!n kanker. Menurut Yi, pr!ses ini tidak akan menyebabkan risik! mutasi genetik yang ditimbulkan !leh terapi gen untuk kanker atau risik! yang membahayakan sel-sel sehat akibat kem!terapi yang diketahui tidak eekti dalam membedakan antara sel sehat dan sel kanker. %.$. R3M3SAN MASALAH . #pakah ungsi ap!ptin dan '/PA

+. 1agaimana cara mendapatkan gen ap!ptin dan '/PA ). 1agaimanakah prinsip trans!rmasi gen pada tanaman ;terutama tanaman tembakau
+. Mempelajari cara is!lasi ap!ptin dari ayam yang terineksi 7#8 ). Mempelajari cara is!lasi '/P dari hewan  Ae'uorea #ictoria 5. Mengetahui prinsip trans!rmasi gen ke tumbuhan . Memilih "ekt!r dan h!st yang tepat untuk pr!ses menyisipkan gen ke tumbuhan

[4]

#A# II PEM#AHASAN

$

Persiapan trans8ormasi 9en ke tmb"aN

1. Iisolasi apoptin dari CAV (Chicken Anemia Virus )

'. ransformasi  plasmid rekombinan ke dalam E. coli

. *creenin" E. coli

2. Modifikasi plasmid,  penambahan G! men""unakan plasmid

&. Insersi "en ke dalam E. coli (plasmid  bakteri)

+. ransformasi  plasmid rekombinan di  E. coli ke dalam  plasmid Agrobacterium (rekombinasi homolo")

#. !emilihan host dan  plasmid

$. %i"asi G! dan apoptin

. Infeksi  Agrobacterium (ada apoptin dan GFP) ke tenaman tembakau

$.% :"i1ken Anemia 0irs 7hicken #nemia 8irus ;7#8< merupakan "irus yang hanya menyerang ayam dari semua unggas. 7#8 pertama kali dijabarkan !leh Yuasa et al . pada tahun >:>. 8irus ini ditemukan pada ayam yang diternakkan secara massal. 7#8 merupakan "irus tanpa selubung, berbentuk ic!sahedral dengan besar sekitar + nm. 8irus ini termasuk dalam genus 'yr!"irus dan memiliki %N# untai tunggal sirkular sepanjang ++>=-+)> pasang basa. 'en!me 7#8 mengandung ) k!de pr!tein "iral yakni 8P ;pr!tein yang terekspresikan menjadi kapsid<, 8P+ ;Pr!tein untuk pelipatan 8P dan berpengaruh pada pr!ses replikasi in "i"!<, dan 8P) ;#p!ptin, menginduksi kematian sel yang terineksi<. 8irus ini memiliki ketahanan tubuh yang cukup t inggi, ia tahan terhadap panas maupun disinektan.

[5]

;a<

;b<

Gambar %. ;a< Struktur (&/ 7hicken #nemia 8irus, ;b< 1entuk "irus ic!sahedral (Sumber) Swiss *nstitute of Bioinormatics+

Seperti namanya, 7#8 menyebabkan anemia pada anak ayam yang baru menetas. Selain itu, 7#8 juga menyebabkan penghancuran sel eritr!blast!id di sumsum tulang belakang dan timus di jaringan timus. 7#8 dapat menyebar secara h!ris!ntal ;dari sistem pernapasan maupun k!t!ran yang tidak segera dibersihkan< maupun "ertikal ;telur ditularkan !leh ayam betina terineksi<.  #nak-anak ayam yang terineksi akan menyebarkan "irus tersebut ke sesama anak ayam yang memiliki antib!di lemah turunan induk mereka. Memberikan "aksin kepada para betina sebelum mereka bertelur merupakan salah satu cara pencegahan penularan "irus. $.$ Apoptin  #p!ptin mengandung sinyal Bipartite,t$pe -uclear %ocaliation Se'uence  ;atau N4S dan N4S+< pada rentang asam amin! =+-== untuk N4S dan pada rentang asam amin! + untuk N4S+ atau pada ujung c-terminalnya, serta -uclear E/port Signal   ;NES< yang mempunyai rentang asam amin! >:-* yang menunjukkan adanya p!tensi perpindahan dari nukleus ke sit!plasma dan sebaliknya. N4S, N4S+, dan NES merupakan se'uence yang memungkinkan #p!ptin untuk keluar dan masuk ke dalam nucleus

Gambar $.

Pembentukan multimer k!mpleks dapat terjadi melalui interaksi antara wilayah hidr!!bik yang kaya akan pr!lin pada ujung N-terminal ;asam amin! -9>< dari setiap m!n!mer. 3jung 7 terminal dari setiap m!n!mer, mengandung N4S dengan situs !s!rilasi ;Thr-*=< yang memperb!lehkan terjadinya interaksi dengan pr!tein lain dan untuk m!diikasi !leh kinase. Pada suatu injeksi mikr! dari multimer ap!ptin ke dalam sit!plasma sel tum!r, terbukti bahwa k!mpleks ap!ptin dapat berpindah ke nukleus dan menyebabkan kematian sel ;ap!pt!sis<. 1agaimanapun, ap!ptin hanya dapat menginduksi sel tidak n!rmal ;kanker< dan tidak menyerang sel n!rmal.

[6]

Gambar &. Mekanisme perpindahan #p!ptin dari sit!plasma menuju nukleus (Sumber) -CB*+

$.$.%

Men9iso!asi Apoptin dari DNA :A0 Pada dasarnya, langkah mengis!lasi ;memurnikan< %N# dari sel adalah dengan merusak struktur sel sehingga didapatkan lisat, memisahkan %N# terlarut dari hancuran sel dan material sel lain yang tidak terlarut, dan memurnikan %N# yang diinginkan dari pr!tein dan asam amin! lain yang terlarut. Pada awal perkembangannya, is!lasi gen dapat dilakukan dengan ekstraksi !rganik menggunakan kl!r!!rm dan presipitasi menggunakan etan!l.

1

61

 ATGAACGCTC

TCCAAGAAGA TACTCCACCC GGACCATCAA CGGCGTTCAG GCCACCAACA

AGTTCACGGC CGTTGGAAAC CCCTCACTGC AGAGAGATCC

GGATTGGTAT CGCTGGAATT

121 ACAATCACTC TATCGCTGTG TGGCTGCGCG AATGCTCGCG CTCACACGCT AAGATCTGCA

Gambar ). 'en!me seCuence #p!ptin (Sumber) -CB*+

Tahapan is!lasi gen dari ap!ptin adalah melakukan pemisahan dari %N# 7#8 dari k!mp!nen "irus lain. 4angkah pertama adalah mengambil sebagian sampel dari anak ayam yang terineksi "irus 7#8. 3mumnya "irus 7#8 menyerang kelenjar timus, hati, dan sumsum tulang belakang sehingga sampel dapat ditemukan di tempat-tempat tersebut. #mbil sampel sumsum tulang belakang ayam menggunakan suntikan. Selanjutnya, sampel disuspensi dengan larutan buffer   pada suhu ): !7 selama satu malam atau 9 !7 selama + jam. andungan larutan buffer  yang digunakan teridiri dari ;+**mm Na7l, **mm Tris p$ :,, +*mm E%T#, p$ =, D S%S<. Setelah pr!ses inkubasi, suspen dipanaskan pada suhu 9 !7 selama +* menit untuk mendenaturasi jaringan lain dan menyisakan %N# "irus. 4angkah selanjutnya menambahkan en!lkl!r!!rm jenuh dengan "!lume yang sebanding dengan "!lume sampel dan k!c!k menggunakan "!rte selama ) menit. Penambahan en!lkl!r!!rm berungsi memisahkan asa-asa "irus. /asa !rganik akan terikat pada en!lkl!r!!rm yang mempunyai siat sesama n!n p!lar. 4arutan en!lkl!r!!rm akan mengikat pr!tein-pr!tein berat seperti kapsid. emudian k!mp!nen %N# akan terikat pada asa cair yang lebih ringan.  #gar perbedaan antar asa lebih jelas berbeda, campuran tersebut kemudian disentriugasi selama  menit dengan kecepatan 5*** rpm. Selanjutnya menambahkan Natrium #setat )M. Tambahkan lagi etan!l sebanyak + "!lume sampel dan k!c!k dengan "!rte selama ) menit. %inginkan sampel pada suhu -+* !7 selama )* menit. emudian sentriugasi kembali pada 5*** rpm selama  menit hingga terbentuk pelet. Memisahkan pelet dari supernatan menggunakan pipet secara perlahan. Pelet dibiarkan mengering. $asil

[7]

pelet yang kering kemudian disuspensi dengan aCuades. 4arutan %N# siap digunakan untuk eksperimen. Seiring dengan perkembangan tekn!l!gi, met!de-met!de untuk memurnikan %N# semakin beragam, mudah, dan eisien. 7!nt!hnya Pr!mega yang menawarkan pemurnian %N# dengan cara cepat dan aman. Pr!mega menggunakan garam 7ha!tr!pic untuk mengancurkan struktur sel, mendenaturasi sel menggunakan deterjen atau alkali, dan lisat dipisahkan dengan sentriugasi, iltrasi, ataupun magnet. Penggunaan en!lkl!r!!rm mulai ditinggalkan berkaitan dengan akt!r keamanan dan biaya pr!ses ekstraksi !rganik. 4angkah selanjutnya ialah mem!t!ng %N# hanya pada bagian yang diinginkan. Pem!t!ngan atau restriksi bisa menggunakan P7& ataupun dengan menggunakan enFim restriksi yang sesuai pada tempat yang ingin dip!t!ng. Namun penggunaan P7& lebih eisien ketimbang enFim restriksi karena P7& dapat sekaligus memperbanyak %N# is!lat. $.& GFP ;Green F!ores1ent Protein< 'reen /lu!rescent Pr!tein ;'/P< merupakan pr!tein yang mampu mengeluarkan cahaya hijau dari serapan energi cahaya di lingkungan sekitar. '/P secara alamiah dimiliki !leh ubur-ubur  Ae'uorea #ictoria yang hidup di laut dingin Pasiik 3tara. #slinya, ubur-ubur   A. #ictoria  memiliki bioluminescent  ae'uorin   yang mengeluarkan pendar warna biru. #kan tetapi, keberadaan pr!tein '/P ditambah interaksi i!n kalsium mengubah warna pendaran biru menjadi hijau yang lebih sedikit meng!nsumsi energi. '/P merupakan pr!tein dengan +)= asam amin! yang sangat stabil pada range p$ , - + dan suhu mencapai 9 !7. '/P memiliki banyak kegunaan dalam penelitian. Siatnya yang dapat memendarkan cahaya di bawah sinar 38 membuat ia sering digunakan untuk meng!ntr!l keberhasilan ekspresi maupun l!kasi keberadaan genGpr!tein tertentu. 1erikut adalah beberapa kegunaan '/P pada berbagai bidang2

Chemist ry of Life $)o&utio n

Mengidentikasi struktur Protein 1!" 2!" 3!#

$n)iron tmenta&

Menentukan kandungan o'at farmasi#

and -ea&th *(ien(e

.eneti( s

$n%im dan kata&isis Pemisahan 'iomo&eku& se(ara kromatogra *e&eksi anti'iotik dan resistensi gen Mekanisme se&eksi +da,tasi &ingkungan

Mikro'io&ogi Pene&iitian .M/" nutrisi" dan 'ioremediasi 0++ egu&asi gen dan faktor transkri,si

Biomarker

Secara umum '/P digunakan sebagai bi!sens!r. Penggunaannya semudah menempelkan '/P pada pr!tein ataupun gen yang direkayasa. etika mutan berpendar saat disinari 38, maka pr!tein ataupun gen rek!mbinan berhasil terkspresikan. 4!kasi yang berpendar  sekaligus menunjukkan keberadaan ekspresi gen atau pr!tein rek!mbinan. 1agaimana '/P mendeteksi cahayaA Seperti !rgan penglihatan manusia ;mata<, pr!tein ini juga memiliki ungsi k!mpleks yang saling menunjang. 6ika pada mata terdapat retina yang berungsi sebagai penerima cahaya di b!la mata. '/P memiliki ) sekuens unik yakni, 'lycine, Serine ;atau Thre!nine<, dan Tyr!sine yang berungsi sebagai pendeteksi cahaya ;7hr!m!ph!re<.

[]

etiga sekuens tersebut melesak ke dalam lipatan pr!tein saat pr!tein melipat. Pr!tein tersebut perlu melalui tahapan tertentu untuk akhirnya bisa menjadi chromophore. Tahap pertama sesudah pelipatan pr!tein ialah reaksi antara 'lysine dan Serine yang membentuk siklik. emudian tahap dehidrasi sehingga terbentuk ikatan rangkap pada siklik tersebut. Selang satu jam, !ksigen dari lingkungan menyerang daerah siklik sehingga terjadi !ksidasi yang menyempurnakan pembentukan chromophore.

Gambar /. Mekanisme pelipatan pr!tein 'reen /lu!rescent Pr!tein (Sumber) http)00www.biotek.com0+

$.&.%

Men9iso!asi GFP '/P merupakan pr!tein yang bersiat sangat hidr!!bik, salah satu cara mengis!lasi pr!tein hidr!!bik ialah dengan $ydr!ph!bic 0nteracti!n 7hr!mat!graphy ;$07<. %i mana kr!mat!grai ini memanaatkan siat hidr!!bik sampel agar menempel pada k!l!m dalam larutan bergaram tinggi dan meluruhkan pr!tein tertentu dengan mengelusi dengan larutan berkadar garam rendah. Tahap pertama yang harus dilakukan ialah dengan melisiskan bagian ubur-ubur yang diperkirakan mengandung pr!tein '/P secara mekanis kemudian kimiawis. Pelisisan secara mekanis berarti mencacah bagianG!rgan sampel dari ubur-ubur. emudian larutkan cacahan sampel pada deterjen atau enFim nanas untuk mer!bek dinding sel yang terdiri dari lipid sehingga %N# dapat keluar dari !rganel maupun nukleus. Sentriugasi larutan akan menghasilkan supernatan dan pelet. 1uang supernatan dan mengencerken pelet dengan larutan berkadar garam tinggi. Setelah larutan berisi pr!tein '/P siap, tahap selanjutnya ialah mempersiapkan k!l!m $07. Siapkan k!l!m berisi hidr!!bik beads pada asa diam. Seperti yang telah dijelaskan, beads ini akan mengikat '/P dan beberapa pr!tein pada larutan berkadar garam tinggi. Pr!tein lain yang tidak diinginkan memiliki tingkat hidr!!bik yang lebih rendah dicuci dengan mengalirkan larutan buffer  resin sebagai ase bergerak. Terakhir, di dalam k!l!m hanya tersisa '/P yang memiliki tingkat hidr!!bik yang paling tinggi. '/P dalam k!l!m diluruhkan dengan mengalirkan larutan buffer   berkadar  garam rendah sebagai ase gerak. '/P yang diper!leh kemudian siap digunakan diadisi dengan ap!ptin sebagai '(0. 2.4  Agrobacterium

tumefaciens Species Agrobacterium terg!l!ng bakteri gram negati yang terg!l!ng bakteri aer!b dan mampu hidup baik sebagai sapr!it maupun parasit. #gr!bacterium berbentuk batang, berukuran *,9 H ,* Im sampai , H ),* Im, dalam bentuk tunggal atau berpasangan.  #gr!bacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak ;m!tile< dan memiliki -9 lagela peritrich!us serta merupakan bakteri tak bersp!ra. Suhu !ptimal pertumbuhan bakteri ini adalah +-+=J7. umpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. #gr!bacterium diis!lasi dari tanaman yang terineksi 7r!wn 'all.   Agrobacterium tumefaciens  dan spesies  Agrobacterium  lainnya telah dikenal luas sebagai pat!gen bagi tanaman sejak awal abad ke-+*. Namun, dalam dua dekade terakhir, kemampuan yang dimiliki  Agrobacterium untuk mentranser %N# ke dalam sel tanaman telah banyak dimanaatkan untuk keperluan rekayasa genetik khususnya pada tanaman.

[]

Gambar (. Agrobacterium tumefaciens (sumber) http)00www.bio.da#idson.edu  +

 Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang secara alami dapat mengineksi tanaman dengan penyakit crown gall tumor  ;tum!r mahk!ta empedu< pada tanamantanaman dik!tiled!n. Penyakit ini dinamakan demikian karena terdapatnya tum!r besar yang membengkak yang terdapat pada tanaman. Penyakit ini adalah salah satu penyakit yang paling umum diketahui karena perubahan yang ditimbulkannya pada sistem bi!l!gis tanaman. Secara mendasar, ketika bakteri ini mengineksi tanaman, sebagian dari materi %N#-nya dipindahkan ke gen!m tanaman yang akhirnya menyebabkan tum!r dan perubahan pada sistem metab!lisme tanaman. $al ini dapat terjadi karena materi genetik yang diberikan kepada tanaman salah satunya mengandung gen pengk!de h!rm!n pertumbuhan tanaman yang dalam jumlah berlebih akan menyebabkan pertumbuhan tidak terkendali dan pada akhirnya menyebabkan kanker atau tum!r. 1akteri yang terg!l!ng ke dalam gram negati ini memiliki sebuah plasmid besar  yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi akt!r "irulensi penyebab ineksi bakteri ini pada tanaman. 3ntuk memulai pembentukan tum!r,  Agrobacterium tumefaciens  harus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanaatkan p!lisakarida asam yang akan digunakan untuk mengk!l!niasiGmenguasai sel tanaman. Selain tanaman dik!tiled!n, tanaman m!n!k!tiled!n seperti jagung, gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam gen!m tanaman.  Agrobacterium tumefaciens  adalah bakteri pat!gen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.

[1]

Gambar +. Siklus Penyakit Crown Gall  ;Sumber 2 https)00www.cals.ncsu.edu0  <

Siatnya yang unik ini membuat bakteri  Agrobacterium tumefaciens  digunakan sebagai alat pada pr!ses pengembangbiakan tanaman. 'en yang diinginkan, seperti gen insectisidal to/in genes   atau herbicide,resistance dapat dimasukan ke dalam %N# bakteri dan kemudian dimasukan ke dalam gen!m tanaman. Penggunaan bakteri ini tidak hanya memperpendek waktu pengembangbiakan tanaman, tetapi juga memungkinkan tanaman untuk memiliki siat baru yang tidak dimiliki tanaman pada umumnya. Trans!rmasi menggunakan #gr!bacterium ternyata lebih disenangi dibandingkan dengan met!de lain karena memilikin keunggulan antara lain <. Eisiensi trans!rmasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi, +<. %apat dilakukan dengan peralatan lab!rat!rium yang sederhana, dan )< Ekspresi gen transer yang stabil cukup banyak. 'en dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa dan biasanya bersegregasi mengikuti p!la pewarisan Mendel. $.).%

P!asmid Ti 'en penyebab penyakit yang disebabkan !leh #gr!bacterium umumnya tidak ditemukan pada kr!m!s!mnya, melainkan pada plasmidnya, yang dinamakan tumor, inducing  plasmid ;plasmid Ti<.  Agrobacterium tumefaciens memiliki Ti-plasmid yang menyebabkan penyakit tum!r mahk!ta empedu pada tanaman dengan mentranser bagian dari %N# nya ke dalam gen!m tanaman ketika pengineksian. Ti-plasmid Ti-plasmid memiliki panjang sekitar +**kbp dengan 5 regi!n2 regi!n T-%N#, regi!n gen "irulensi, regi!n gen katab!lisme !pine, dan origin of replication  ;(&0<.

[11]

Gambar *. Plasmid Ti (sumber) http)00www.cambia.org0   +

1agian penting dari plasmid Ti, yaitu2 T-%N# border se'uences , yamg membatasi segmen %N# ;T-%N#< yang akan ditranser ke gen!m tumbuhan. T-%N# akan dijelaskan pada bagian selanjutnya. &irulence genes, yang dibutuhkan untuk mentranser daerah T-%N# ke tanaman tetapi tidak memindahkan seluruh plasmid ke tanaman. T-%N# term!diikasi, dimana gen yang ingin ditranser diletakan sehingga dapat dipindahkan ke dalam tanaman tetapi tidak menyebabkan tum!r pada tanaman. •

•

•

$.).$

Re9ion Gen 0ir!ensi &irulence genes  yang terdapat pada plasmid Ti berperan dalam mediasi dan transer T%N# ke dalam sel tanaman inang. #da sekitar ) gen #ir yang disusun dalam = !per!n gen pada Ti-plasmid2 8ir #, 8ir 1, 8ir 7, 8ir %, 8ir E, 8ir /, 8ir ', dan 8ir $, yang keseluruhannya memiliki panjang 5*kbp dan masing-masing !per!n mengk!dekan enFim-enFim yang berperan dalam ungsi-ungsi tertentu untuk mentranser T-%N# ke dalam sel tanaman inang. %engan masing-masing ungsinya adalah sebagai berikut2 "ir# mengk!dekan pr!tein resept!r acet!syring!ne, juga mengakti"asi 8ir' dengan !s!rilasi yang menyebabkan ekspresi k!nstituti pada keseluruhan gen !per!n "ir1 mengk!dekan pr!tein membran, berperan dalam pembentukan l!r!ng k!njugasi di mana T-%N# ditransp!rtasikan. "ir7 mengk!dekan enFim helikase yang merelaksasi untaian T-%N# dan mengikat o#erdri#e se'uence. "ir% mberperan dalam akti"itas t!p!is!merase, dan "ir%+ yang mempr!duksi end!nuclease yang mentarget sekuens batas dari daerah T-%N#. "irE yang mengikat untai T dan melindunginya dari serangan nuklease dan menginterkalasinya dengan lemak dan menciptakan ruang bagi k!mpleks T untuk menuju sel tanaman. "ir/ belum diketahui akti"itasnya. "ir' berperan sebagai r!tein %N#-binding master controller1 8ir# mengakti"asi 8ir' dengan !s!rilasi, 8ir' mendimer dan menakti"asi ekspresi k!nstituti semua !per!n "ir. "ir$ belum diketahui akti"itasnya. •

•

•

•

•

• •

•

[12]

$.).&

Re9ion Trans8er=DNA ;T=DNA< T-%N# atau transferred %N# adalah bagian %N# dari plasmid Ti yang dipindahkan ke gen!m tumbuhan, berukuran +5kb, yang diintegrasikan ke dalam gen!m tanaman di dalam nukleus. 1agian ini dibatasi !leh + pasang basa nitr!gen yang sama pada kedua ujungnya, yaitu 4et-1!rder ;41< dan &ight-1!rder ;&1< yang bersekuens sama. Pr!ses transer dimulai pada batas kanan dan diakhiri pada batas kiri. Penghapusan &1 menggagalkan transer T%N#, namun penghapusan 41 tidak berpengaruh terhadap transer T-%N# secara signiikan. %aerah T-%N# pada plasmid Ti mengandung gen yang mengk!de enFim pensintesi opines dan it!h!rm!n atau h!rm!n pertumbuhan tanaman. %engan memindahkan materi genetik tersebut ke tanaman, bakteri secara langsung menyebabkan tum!r pada tanaman akibat banyaknya jumlah h!rm!n pertumbuhan sehingga tidak terk!ntr!l. Maka dari itu, ketika  #gr!bacterium digunakan untuk mentranser gen tertentu kepada tanaman, daerah ini akan dihilangkan dan diganti dengan gen yang diinginkan dan penanda yang berguna untuk menentukan tanaman yang sudah terineksi dan belum. 7!nt!h dari penanda yang sering digunakan adalah neom$cin phosphotransferase dan h$grom$cin B phosphotransferase. Pada area T-%N#, terdapat 5 segmen utama, yakni2 'en (nk!genik 'en !nk!genik merupakan gen yang mensintesis auksin dan sit!kinin ;it!h!rm!nK h!rm!n pertumbuhan< yang menginduksi pembentukan tum!r. Tiplasmid yang tidak memiliki gen !nk!genik disebut sebagai L disarmed Ti,plasmid , artinya Ti-plasmid yang tidak memiliki gen penyebab tum!r. Disarmed Ti,plasmid  dik!nstruksi !leh insinyur genetik dan digunakan dalam t ranser genetik termediasi  Agrobacterium. •

•

•

'en (pine (pine adalah senyawa ber-Mr rendah yang ditemukan pada tum!r tanaman terineksi penyakit crown gall . 1i!sintesis !pine dikatalisis !leh enFim spesiik yang dik!dekan !leh gen !pine pada T-%N# yang merupakan bagian dari Ti-plasmid. (pine tersebut digunakan bakterium sebagai sumber nitr!gen dan energi. Sejauh ini, ditemukan  A. tumefacies yang mengkatalisis jenis !pine yang berbeda, yaitu n!paline ;dik!dekan !leh gen noc < dan !ct!pine ;dik!dekan !leh gen occ <. etika  A. tumefaciens dikultur pada temperatur di atas +=!7, Ti-plasmid kadang hilang. 1akteri  A. tumefaciens yang kehilangan Ti-plasmid menjadi a"irulen dan juga kehilangan kemampuannya untuk mengkatab!lisis asam amin! turunan spesiik. Namun, ketika Ti-plasmid ditrans!rmasi lagi ke dalam  A. tumefaciens a"irulen atau dengan k!njugasi !leh  A. tumefaciens "irulen, maka  A. tumefaciens menjadi "irulen kembali dan dapat mengkatalisis !ct!pine atau n!paline. 6ika d!n!r Ti-plasmid adalah strain !ct!pine, resipiennya menjadi strain !ct!pine, tanpa pengaruh apakah resipien merupakan strain !ct!pine atau n!palineK dan sebaliknya. Strain !ct!pine dan n!paline mengklasiikan tipe Tiplasmid menjadi dua2 Ti-plasmid !ct!pine dan Ti-plasmid n!paline, yang hampir  h!m!l!g. 6enis Ti-plasmid ini menentukan apakah !ct!pine atau n!paline yang akan disintesis di dalam sel tum!r dan juga gen yang mengkatalisis sintesisnya. %eft,Border  ;41< dan 2ight,Border  ;&1< 41 dan &1 merupakan sekuens sama panjang ;+5bp< dan berbasa sama yang mengapit kedua ujung regi!n T-%N#. Sekuens tersebut misalnya adalah ''7#''#T#TT7##TT'T###T-). %ua b!rder tersebut memiliki peran penting dalam transer T-%N# ke dalam gen!m tanaman. 41 dan &1 adalah target akti"itas end!nuklease !leh pr!duk salah satu gen "irulen 8ir%.

$.).)

Mekanisme In8eksi Genetik Agrobacterium ke Tanaman Pr!ses transer genetik dari #gr!bacterium pada sel tanaman melalui beberapa tahap ;gambar >< yaitu 2

[13]

Gambar ,. Mekanisme Transer 'enetik dari  Agrobacterium ke Tumbuhan ;Sumber2 http2GGsta.uny.ac.idG  <

Ko!onisasi bakteri Merupakan tahapan awal yang penting untuk menginduksi terbentuknya tum!r. Tahap ini berperan pada saat #gr!bacterium menempel pada permukaan sel tanaman. P!lisakarida yang terdapat pada permukaan sel #gr!bacterium berperan penting dalam pr!ses k!l!nisasi. Indksi sistem -ir!en bakteri ;Nomor % "in99a /< Transer T-%N# ditunjukkan dengan pr!duk yang dik!de !leh )*-5* kb daerah 8ir  pada Ti plasmid. %aerah ini sedikitnya terdiri dari enam !per!n esensial ; 8ir #, 8ir 1, 8ir 7, 8ir %, 8ir E dan 8ir '< dan !per!n n!n esensial ;8ir / dan 8ir $<. 6umlah gen masing-masing !per!n berbeda, 8ir #, 8ir ' dan 8ir / hanya terdiri dari satu genK 8ir  7, 8ir E dan 8ir $ terdiri dari dua genK sedangkan 8ir % dan 8ir 1 mempunyai masing-masing empat dan tujuh gen. 8ir #-8ir ' merupakan dua k!mp!nen sistem yang mengaktikan transkripsi pada gen 8ir yang lain. 8ir # yang terakti"asi mempunyai kapasitas untuk mentrnser !sat menjadi residu aspartat yang sesuai dengan %N# sit!plasmik binding pr!tein 8ir '. /ungsi 8ir ' adalah sebagai akt!r  transkripsi yang mengatur regulasi ekspresi gen 8ir pada saat ter!s!rilasi !leh 8ir #. %aerah 7-terminal bertanggung jawab dalam mengikat %N#, sedangkan N-terminal merupakan d!main !s!rilasi yang menunjukkan h!m!l!gi dengan d!main sens!r  8ir #. #kti"asi sistem 8ir juga tergantung pada akt!r eksternal seperti temperatur dan p$. Pada tempertur lebih dari )+!7, gen 8ir tidak akan terekspresi karena mengubah k!n!rmasi !lding 8ir # yang menginduksi terjadinya inakti"asi. Pengaruh temperatur  pada 8ir # ditekan dalam bentuk mutan 8ir ' ;8ir '!<, yang mengaktikan ekspresi gen 8ir.

[14]

Pembentkan 9enerasi komp!ek T=DNA ;Nomor ( "in99a *<  #kti"asi gen 8ir menghasilkan generasi m!lekul single strand ;ss< yang menghadirkan c!py strand T-%N#. %N# yang terletak diantara batas T-%N# akan ditrnaser ke dalam sel tanaman sebagai ss%N#, dan kemudian berintegrasi ke dalam gen!m tanaman. Pr!tein 8ir % dan 8ir %+ merupakan pr!tein yang berperan penting pada tahap ini, dengan mengenali sekuen batas T-%N# dan nicking ; akti"itas end!nuklease< pada strand bawah di setiap batas. Pada daerah nick diasumsikan sebagai tempat inisiasi dan terminasi untuk pemulihan strand T. Setelah terjadi pem!t!ngan end!nukle!tida, 8ir %+ secara k!"alen akan menempel pada ujung O pada ss strand T. #s!siasi ini mencegah eks!nukle!litik pada ujung O pada ss strand T dan membedakan ujung  sebagai pemeran penting dalam k!mplek transer T%N#. Trans8er T=DNA me!ipti da mode! ntk trans!okasi komp!eks T=DNA ;Nomor  ,< Sarana transer ke dalam nukleus tanaman adalah k!mplek pr!tein ssT-%N#. 0ni harus ditransl!kasi ke dalam nukleus tanaman melalui tiga membran, dinding sel tanaman dan ruang seluler. 1erdasrkan m!del yang paling banyak diterima adalah k!mpleks ss T-%N# 8ir %+ yang dilingkupi 9> k%a pr!tein 8ir E+, ss%N# binding pr!tein. #s!siasi ini mencegah nuklease dan penambahan perpanjangan strand ss T%N# sehingga mengurangi diameter k!mpleks sekitar + nm. $al ini mengakibatkan transl!kasi melalui membran menjadi lebih mudah. alaupun demikian, as!siasi tersebut tidak dapat menstabilkan k!mpleks T-%N# dalam #gr!bacterium. 8ir E+ terdiri dari dua signal tanaman yaitu N4S ;nuclear l!cati!n signal< dan 8ir %+ terdiri dari satu N4S. /akta ini menunjukkan bahwa kedua pr!tein rupanya berperan penting dalam sel tanaman sebagai perantara transer k!mpleks T-%N# ke dalam nukleus. 8ir 

E diperlukan untuk eksp!r 8ir E+ ke dalam sel tanaman, walaupun ungsi spesiik yang lain belum diketahui. M!del alternati lain yaitu bahwa k!mpleks transer berupa ss%N# secara k!"alen terikat pada ujung O dengan 8ir %+, tetapi tanpa dilingkupi !leh pr!tein 8ir E+. Eksp!r independen 8ir E+ ke dalam sel tanaman merupakan pr!ses alami, dan sekali k!mpleks ssT-%N# 8ir%+ tersebut masuk dalam sel tanaman, akan dilingkupi !leh pr!tein 8ir E+. $al ini juga memungkinkan pr!ses tersebut dapat terjadi sebagai alternati pada saat k!ndisi terineksi. Inte9rasi T=DNA da!am 9enom tanaman ;Nomor %' "in99a %$< Pada sel tanaman, k!mpleks ssT-%N# merupakan target nukleus untuk melewati membran nukleus. %ua pr!tein 8ir telah diketahui penting dalam tahap ini, yatitu 8ir  %+ dan 8ir E+ adalah yang paling penting, dan kemungkinan 8ir / memberikan sidikit peran pada pr!ses ini. Signal N4S dari 8ir %+ dan 8ir E+ berperan penting sebagai target nukleus dalam mengantarkan k!mpleks ssT-%N# sebagai gambaran awal. 8ir  %+ mempunyai satu N4S ungsi!nal. !mpleks ss T-%N# merupakan k!mpleks nukle!pr!tein berukuran besar sekitar diatas +* kb yang hanya terdiri dari satu ujung O secara k!"alen menempel pada pr!tein 8ir %+ per k!mpleks. Setiap k!mpleks dilingkupi m!lekul 8ir E+ dengan ukuran besar yaitu sekitar 9** per +* kb T-%N#, dan masing-masing terdiri dari + N4S. %ua N4S dari 8ir E+ ini telah dipertimbangkan sebagai sesuatu yang penting untuk kelanjutan imp!r nukleus k!mpleks ss-T%N#, kemungkinan dengan menjaga kedua sisi p!ri nukleus yang terbuka secara simultan. 0mp!r nukleus ini kemungkinan diperantarai !leh N4S spesiik binding pr!tein, yang terdapat dalam sit!plasma tanaman.

Tahapan akhir dari transer T-%N# adalah integrasi T-%N# ke dalam gen!me tanaman. 1erdasarkan m!del di atas, pasangan sedikit basa yang dikenal sebagai mikr!-h!m!l!gi diperlukan untuk tahap pre-annealing antara pasangan strand T-%N# dengan 8ir %+ dan %N# tanaman. $!m!l!gi ini sangat kecil dan mempunyai sedikit

[15]

spesiitas dalam pr!ses rek!mbinasi dengan memp!sisiskan 8ir %+ untuk ligasi. Pada ujung )O atau sekuen yang berdekatan pada T-%N# terdapat beberapa h!m!l!gi sedikit dengan %N# tanaman yang menghasilkan k!ntak awal ;sinapsis< antara stran T dan %N# tanaman dan membentuk gap pada strand )O-O %N# tanaman. Pemindahan %N# tanaman akan mem!t!ng pada ujung )O pada gap !leh end!nuklease, dan nukle!tida pertama pada O menempel pada pasangan 8ir %+ dengan nukle!tida pada ujung ;O-)O< strand %N# tanaman. Pada )O !"erhang, T-%N# bersama dengan pemindahan %N# tanaman merupakan peristiwa digesti baik !leh end!nuklease atau )O-O eks!nuklease. emudian, O menempel pada akhiran 8ir %+ dan ujung )O lain pada stand T ;berpasangan dengan %N# tanaman selama sejak tahap awal pada pr!ses integrasi< tepat di bawah strand %N# tanaman. 0nilah pengenalan strand T pada strand )O-O %N# tanaman terjadi sempurna, pilinan yang diikuti dengan nick pada lawan strand %N# tanaman dihasilkan. Situasi ini mengaktikan mekanisme repair pada sel tanaman dan strand k!mplementer yang disintesis melalui sisipan awal strand T-%N# sebagai cetakan ;'usta!, dkk., >>=<. &. Trans8ormasi &.%. Teknik Trans8ormasi A9roba1terim ke Tanaman me!a!i 0ektor #iner  emampuan  A. tumefaciens ber-Ti-plasmid yang mengandung T-%N# yang dapat ditranserkan ke dalam gen!m tanaman membuat  A. tumefaciens digunakan sebagai agen penyisip gen rekayasa dalam rekayasa genetik tanaman. T-%N# dalam Ti-plasmid direkayasa !leh insinyur genetik dengan mengubah regi!n T-%N#2 gen !nk!genik dan gen !pine, dengan gen kl!na yang diinginkan beserta penanda seleksinya.

Gambar %'. Peta Plasmid Ti-Plasmid

Gambar %%. Peta Plasmid Disarmed TiPlasmid yang sudah disisipi 'en l!na

;Sumber2 http2GGnptel.ac.inGc!ursesG*+*)*)Gm!duleG pr!blemsG.html<

;Sumber2 http2GGnptel.ac.inGc!ursesG*+*)*)Gm!duleG pr!blemsG.html<

Pada rekayasa genetika tanaman dengan met!de  Agrobacterium, terdapat dua met!de yang menggunakan "ekt!r tertentu yaitu co,integrati#e #ector s$stem  dan binar$  #ector s$stem untuk dapat menyisipkan gene of interest  ke dalam Agrobacterium. a

Metode Co-integrative Vector System Pada sistem ini, digunakan "ekt!r intermediet yang mengandung marker untuk seleksi, gen target, b!rder kanan, !rigin ! replicati!n E. c!li, dan gen marker untuk bakteri. 'en yang ingin disisipkan dimasukkan ke dalam "ekt!r ini yang kemudian di induksi ke sel  Agrobacterium yang mengandung Ti-plasmid. 8ekt!r c!-integrated berek!mbinasi dengan Ti plasmid tidak berbahaya ;disarmed< yang sudah tidak memiliki gen pemr!duksi tum!r dan b!rder kanan dari T-%N# di dalam #. tumeacies, dan akhirnya keseluruhan bekt!r ini akan berintegrasi ke dalam disarmed Ti-plasmid untuk membentuk Ti-plasmid rek!mbinan. Ti plasmid rek!mbinan ini kemudian ditranser ke sel tanaman yang dituju.

[16]

8ekt!r intermediet tidak dapat direplikasi !leh  Agrobacterium, tetapi dapat melakukan rek!mbinasi ke dalam daerah T-%N# dari Ti-plasmid yang dituju. #gar sel tanaman yang ingin disisipkan tidak tumbuh dengan abn!rmal, maka perlu dilakukan inakti"asi satu atau lebih gen untuk bi!sintesis regulat!r pertumbuhan. Met!de ini k!mpleks karena perlu adanya pr!ses rek!mbinasi antara "ekt!r integrati dan Ti-plasmid secara in #i#o.

b

Metode #inary 0e1tor  Pada sistem ini, digunakan plasmid kecil, -ektor biner4  yang dapat dimanipulasi secara in #itro. Plasmid ini mengandung border repeats yang akan disisipkan dengan gen yang kita inginkan di antara kedua b!rder tersebut yang kemudian di trans!rmasi ke dalam E coli . %alam kasus dimana tidak terdapat gen #ir dalam "ect!r biner, biasanya digunakan sebuah "ect!r pen!l!ng lain ;helper "ect!r< berupa disarmed Ti plasmid yang memiliki gen "ir keseluruhan, namun tidak memiliki daerah T-%N#. %isarmed Ti-plasmid ;mengandung gen #ir< terdapat dalam plasmid yang berbeda dengan "ekt!r biner yang memiliki T-%N#, namun tetap berada di dalam satu h!st  Agrobacterium yang sama. Sehingga dalam system ini digunakan + macam "ect!r ; binar$+ , yaitu "ect!r dengan T-%N#, dan sebuah disarmed Tiplasmid yang memiliki gen #ir.

Gambar %$. Binar$ &ector S$stem ;Sumber 2 $!we, +**:<

%alam perancangan ini, sisgtem "ect!r biner lebih dipilih karena mempunyai kelebihan dibandingkan c!-integrated "ect!r, antara lain2 - Tidak ada pr!ses rek!mbinasi yang berlangsung di antara m!lekul-m!lekul yang terlibat - 8ekt!r biner berukuran cukup kecil dibandingkan dengan disarmed Ti,plasmid  rek!mbinan, sehingga meningkatkan eisiensi transer dari E. coli ke Agrobacterium. - 3kuran "ekt!r biner kecil karena "ir regi!n-nya dipisah ke plasmid yang berbeda ;disebut helper plasmid+ 8ekt!r biner yang digunakan dalam mentranser gen ap!ptin ke tanaman tembakau adalahh pGreenII'$$, dengan "ect!r helpernya, pS!up . 8ekt!r p'reen00 *++> adalah "ekt!r  shuttle3 sehingga dapat diperbanyak baik di dalam   E. coli   maupun  Agrobacterium karena memiliki dua 42*  ;origin of replication <, yakni ColE*,42* memungkinkan replikasi di E. coli  dan pSA,42* memungkinkan replikasi dalam  strain Agrobacterium yang sesuai.

[17]

Gambar %&.Peta Plasmid p'reen00-*++> dan pS!up ;Sumber 2 http2GGwww.snapgene.c!mG<

pGreen adalah "ekt!r biner di mana tiga k!mp!nen utamanya ;T-%N# Q M7S, marker untuk seleksi, dan !ri< telah di!ptimalkan untuk meningkatkan trans!rmasi #gr!bacterium ke tanaman. #dapun alasan penggunaan plasmid p'reen00*++> adalah2 R 3kurannya yang relati"e kecil ;5)bp<. 3kuran yang kecil ini menguntungkan, karena meningkatkan eisiensi trans!rmasi ke dalam E. coli. R p'reen00 adalah "ect!r biner yang sudah dim!diikasi dari p'reen0, sehingga meningkatkan stabilitasnya dalam E. coli  R Memiliki marker seleksi, yaitu gen resistan antibi!tik kanamycin (-pt*+

'en ap!ptin nantinya akan diligasi ke dalam p'reen00*++>, namun terlebih dahulu dilakukan m!diikasi dari ap!ptin dan p'reen00*++>, yaitu penambahan sekuens '/P. &.$. Modi8ikasi Gen Apoptin den9an Penamba"an Green Fluorescent Protein ;GFP< 3ntuk mengetahui keberhasilan ekspresi gen ap!ptin pada h!st ;misalnya E. coli+, dapat dibantu dengan penambahan sebuah penanda ; marker+ yang ditambahkan pada ujung N atau ujung 7 ap!ptin. Marker yang digunakan dalam perancangan ini adalah green lu!rescent pr!tein ;'/P<. Green luorescent !rotein  adalah pr!tein yang dapat berpendar yang secara alami dihasilkan !leh ubur-ubur. '/P kini digunakan secara luas dalam studi-studi ekspresi gen maupun mikr!sk!pik karena aplikasinya yang relati mudah. $anya dengan adanya pendaran cahaya dapat menunjukkan bahwa gen yang kita teliti terekspresi. Pada '/P terdapat +)5 residu asam amin!. '/P menjadi istimewa karena ia bersiat aut!-katalitik, tidak membutuhkan k!akt!r  atau enFim lain agar ia bekerja. Selain itu '/P dapat digabung ;usi< dengan pr!tein lain tanpa saling mengganggu ungsi masing-masing. Sehingga '/P dapat digunakan secara luas di berbagai !rganisme. Penambahan '/P pada ap!ptin dapat dilakukan pada "ect!r biner p'reen00*++> dengan prinsip restriksi-ligasi. Pemi!i"an P!asmid dan Host.

Plasmid yang digunakan pada perancangan rekayasa genetika tanaman adalah plasmid biner p'reen00*++> dengan "ect!r helpernya yaitu pS!up. p'reen00*++>

[1]

adalah plasmid biner yang memiliki origin of replication  dari E. coli  dan  Agrobacterium tumeaciens sehingga dapat bereplikasi di kedua bakteri tersebut. Adapn "ost yang digunakan untuk berlangsungnya pr!ses cl!ning plasmid ini adalah dari jenis bakteria Escherichia Coli , yaitu E. Coli   strain DH/a . Pemilihan strain ini berdasarkan pada siat jenis strain ini yang c!c!k digunakan untuk pr!ses cl!ning bakteria, karena eisiensi replikasinya yang tinggi. Penamba"an GFP pada pGreenII'$$,

p'reen.c!.uk menyediakan gen '/P yang dim!diikasi dengan penambahan &E site Bam$0 dan Sac 0. Namun '/P ini belum memiliki pr!m!ter dan terminat!r pada tanaman sehingga tidak bisa diekspresikan dalam tanaman.

Gambar %). Peta %N# '/P m!diikasi ;sumber 2 http2GGwww.pgreen.c!.ukG<

Penambahan pr!m!ter dan terminat!r pada '/P dilakukan dengan merestriksi sekuens pr!m!t!r )S-7aM8 cassette3 yaitu pada situs 1am$0 dan Sac0. emudian dilakukan ligase.

Gambar %/. Peta %N# )S-7aM8 Cassette ;sumber 2 http2GGwww.pgreen.c!.ukG<

$asil dari tahap ini adalah '/P yang sudah memiliki pr!m!ter )S-7aM8 dan terminat!r 7aM8 p!ly#.

Gambar %(. 0nsersi '/P pada )S 7aM8 cassette ;sumber 2 http2GGwww.pgreen.c!.ukG<

[1]

BgIRight Borde 3347# r '/P diinsert ke dalam p'reen00*++> dengan teknik restriksi-ligasi, p'reen00 *++> direstriksi dengan enFim restriksi Ec!&8 dan diligasi dengan T5 %N# 4igase.

(RB)

$asil ligase adalah2

Gambar %+. %iagram Susunan $asil 0nsersi '/P pada T-%N# p'reen00*++> ;sumber 2 0lustrasi penulis<

Penamba"an RE site pada Apoptin den9an Teknik P:R

Sekuens gen ap!ptin dapat dimasukkan kedalam area  M7S atau ) M7S pada p'reen00*++>. %alam kasus ini, gen ap!ptin akan disisipkan pada area enFim restriksi ba0 dan 1am$0, pada ujung ) '/P. Sebelum memasukkan ap!ptin p'/P, ap!ptin harus diberi tambahan situs &E ba0 dan 1am$0 dengan P7&. #dapun primer-primer yang digunakan2 •

Primer /!rward  H basa tambahan H ba0 site H 'en #p!ptin H ) /6 > :GA T:TAGA ATGAA:G:T: T:: H ) Pan?an9 $$ pasan9 basa4 G: 1ontent /'@4 Tm /)4*o:

•

Primer &e"erse  H basa tambahan H 1am$0 site H 'en #p!ptin re"erse c!mplement H ) /6 > G:: GGAT:: TTA:AGT:TTATA:A > &6 Pan?an9 $) basa4 G: 1ontent )(@4 Tm //4+o: ; Tm'4,o:<

$asil P7& adalah ap!ptin yang telah memiliki situs &E bagi ba0 pada ujung  dan 1am$0 pada ujung ), yakni BbaI > Apoptin > #amHI.

Gambar %*. %iagram $asil P7& Sekuens #p!ptin ;sumber 2 0lustrasi penulis<

Li9asi Apoptin ke da!am pGFP

Tahap selanjutnya adalah memasukkan #p!ptinB&E ini ke dalam p'reen00*++>, atau dikenal dengan tahap ligase. #p!ptin dan p'reen00*++> terlabih dahulu diberi enFim restriksi ba0 dan 1am$0 untuk membentuk sticky end pada kedua ujungnya, sehingga dapat terjadi penyambungan pada gen ap!ptin dan gen pada p'reen00*++>, atau dikenal dengan istilah ligase. 4igasi dilakukan menggunakan enFim T5 %N# 4igase. $asil ligase ini adalah plasmid p'reen00*++> yang sudah berhasil dimasuki dengan #p!ptin dan '/P

[2]

Trans8ormasi pGreenII='$$, Rekombinan ke da!am E. Coli DH/C

$asil ligase ap!ptin ke dalam p'/P kemudian ditrans!rmasikan ke dalam h!st, yaitu E. Coli  strain %$. Pr!ses trans!rmasi dilakukan dengan teknik elektr!!rasi, yang memanaatkan kejutan listrik untuk merusak membran sel bakteri sementara dan membentuk p!ri-p!ri pada membran sel. %N# plasmid yang sudah di elektr!p!rasi kemudian ditambahkan 41 cair untuk pemulihan sel dan diinkubasi selama ) jam pada incubator shaker . $asil inkubasi kemudian diratakan pada permukaan medium 41 padat dengan penambahan antibi!tin untuk seleksi. Medium tersebut kemudian diinkubasi dengan suhu )*U7 selama 5= jam. Selanjutnya, E. Coli  yang sudah memiliki plasmid rek!mbinan p'reen00*++> ditumbuhkan dalam plat agar, untuk selanjutnya dilakukan pr!ses seleksi.

Se!eksi

Pr!ses seleksi adalah tahapan dimana kita hendak mengetahui apakah gen of  interest   yang kita sisipkan dalam plasmid benar-benar sudah ditrans!rmasikan ke dalam h!st. 7aranya dapat menggunakan seleksi dengan antibi!tik atau dengan seleksi blue,white screening. Seleksi pada kasus ini dilakukan dengan uji antibi!tik dan uji marker gene '/P, karena dalam p'reen00*++> terdapat gen resistan terhadap antibi!tik kanamycin, yaitu -pt* . 6ika kita menumbuhkan E. Coli   %$a yang sudah ditran!rmasi dengan plasmid rek!mbinan ke dalam media agar yang mengandung kanamycin, maka k!l!ni yang dapat bertahan hidup adalah k!l!ni yang sudah berhasil dimasuki plasmid rek!mbinan. Namun sebaliknya, jika E. Coli  %$a tidak dapat bertahan hidup dalam media, maka sudah dapat dipastikan bahwa E. Coli   tersebut tidak memiliki plasmid rek!mbinan. Selain itu, dalam media juga dapat kita lihat secara langsung bahwa E. c!li yang berhasil disisipi p'reen00*++> akan memendarkan cahaya hijau jika disinari cahaya 38, karena p'reen00*++> sudah memiliki gen '/P.

Gambar %,. 7!nt!h $asil Seleksi E. 7!li dengan gen '/P ;sumber 2 https2GGs).amaF!naws.c!mGiles.digicati!n.c!mGM=+:a9aecd+=)be*:)e*5b9*=b5.jpg<

 #dapun tahapan yang dapat dilakukan untuk uji seleksi2 Mengkultur bakteri pada %B,  plate yang mengandung ** VgGml ! kanamicin, =* VgGml -gal segar, dan +* mM 0PT'. Penambahan kanamicin berguna untuk mencegah pertumbuhan E. Coli   yang tidak mengandung plasmid p'reen00*++> rek!mbinan. Setelah didapatkan bakteri E. Coli  yang mengandung plasmid p'reen00*++> rek!mbinan, maka selanjutnya kita dapat mengkultur kembali bakteri ini sehingga

[21]

didapatkan jumlah yang cukup untuk trans!rmasi ke dalam  Agrobacterium tungefasiens. )

Trans8ormasi P!asmid Rekombinan ke da!am A9roba1terim Setelah plasmid dim!ikasi lalu dilakukan pr!ses trans!rmasi ke dalam inang perantara yaitu E. coli3 plasmid term!diikasi tersebut akan ditrans!rmasi ke dalam  Agrobacterium. 1erikut adalah beberapa met!de yang dapat digunakan untuk melakukan pr!ses trans!rmasi tersebut2 • 

•

•

Metode Freee!T"a#  etika %N# plasmid murni tersedia, met!de freee0thaw   memberikan alternati  yang cepat dan mudah. Mekanisme secara tepat dari bagaimana keberhasilan met!de ini masih belum dapat dimengerti dengan baik. Secara kesimpulan, pemasukkan %N# bergantung pada perusakan dinding sel yang terpapar !leh kati!n di"alent dan perubahan temperatur yang sangat cepat yang menghambat luidisasi dari membran sel. Metode E!ektroporasi Elektr!p!rasi bergantung kepada penggunaaan kejutan listrik untuk membuat p!ri dalam membran lipid dari bakteri. P!ri tersebut cukup besar sehingga m!lekul %N# dapat masuk ke dalam sel. Parameter kesuksesan dari met!de ini bergantung pada pengendalian dari kekuatan medan listrik dan durasi kejutannya. Metode Tri-$arental %ating  Tri-parental Mating merupakan met!de yang eekti untuk memindahkan plasmid n!n-k!njugati tetapi mobiliable ke dalam  Agrobacterium. Met!de ini menggunakan dua jenis E. coli dengan plasmid berbeda. Yang pertama adalah E. coli yang mengandung plasmid helper  yang mengk!de pr!tein yang mem!rmasikan dan menjembatani perpindahan "ekt!r biner ke dalam  Agrobacterium. Yang kedua adalah E. coli yang mengandung "ekt!r biner tersebut yang berisi %N# asing atau gen yang diinginkan. $al ini dapat terjadi karena ungsi dari !rigin oriT  yang ada pada plasmid helper  dapat membantu "ekt!r biner. Skema kerja met!de tri,parental mating adalah sebagai berikut,

Gambar $'. Skema erja Tri,parental Mating  ;sumber2 ise #rlene, et. al . +**9<

[22]

%engan # adalah E. coli dengan plasmid helper sebagai pembantu pr!ses transmisi plasmid. 1 adalah E. coli dengan plasmid berisi "ekt!r biner beserta gen yang diinginkan. 7 adalah E. coli dengan kedua plasmid tersebut di dalamnya. % adalah  Agrobacterium penerima. E adalah  Agrobacterium tumefaciens yang sukses memiliki "ekt!r biner rek!mbinan. ).% Trans8ormasi P!asmid E. :o!i Ke Da!am A9roba1terim Met!de trans!rmasi yang digunakan dalam kasus ini adalah Tri Parental Mating. !mp!nen yang terlibat adalah sebagai berikut2 E.c!li dan plasmid d!n!r  Strain E.c!li yang digunakan adalah %$ yang telah disisipi plasmid p'reen00*++> yang telah dim!diikasi dan mengandung gen ap!ptin dan '/P. Plasmid inilah yang akan disisipkan ke dalam #gr!bacterium tumeaciens •

•

•

E. c!li helper  Strain E. c!li yang memiliki plasmid helper didalamnya. Plasmid helper berperan dalam penyisipan plasmid yang diinginkan ke dalam #gr!bacterium tumeaciens. Plasmid helper memiliki kemampuan sel transmissible, sehingga bisa berpindah melalui k!njugasi secara mandiri. Plasmid helper mengk!dekan pr!tein yang dibutuhkan untuk menyusun mating bridge dan mentranser dirinya sendiri ataupun m!biliFable plasmid lain ke dalam sel tujuan, dalam hal ini #gr!bacterium tumeaciens. 8ekt!r helper  yang digunakan pada E. coli %$ ialah pS!up. &ecipient Sel tujuan dimana plasmid term!diikasi akan disisipkan. %alam rekayasa tanaman, biasanya digunakan #gr!bacterium tumeaciens. %alam kasus ini, yang digunakan adalah  Agrobacterium tumefaciens strain 41#55*5.

).$ Ta"apan Trans8ormasi P!asmid E. :o!i Ke Da!am Agrobacterium  Mengkultur E. coli %$ yang telah disisipi plasmid p'reen00-*++>. E. coli %$ yang mengandung plasmid p'reen00-*++>, dan resipien yaitu  Agrobacterium tumefaciens 41#55*. Masing-masing dalam media yang sesuai . 3ntuk E. c!li d!n!r, dan E. c!li helper yaitu E. coli %$, ditambahkan antibi!tik anamycin. Sementara, pada media kultur #gr!bacterium tumeaciens, ditambahkan riampicin dan tetracycline.

+

Memanen dan mencuci masing-masing bakteri untuk menghilangkan antibi!tik. 1ila kultur menggunakan media cair, diambil lalu dimasukan ke dalam micr!tube untuk selanjutnya disentriugasi. $asil pelet kemudian dicampur kembali dengan media cair  yang sesuai.

)

Menyiapkan plate berisi media 41 agar tanpa tambahan antibi!tik

5

Satu k!l!ni dari masing-masing bakteri ; E. coli %$ yang mengandung plasmid p'reen00-*++>, dan  Agrobacterium tumefaciens 41#55*<, dig!reskan secara terpisah ke dalam 41 agar dengan p!sisi sangat dekat satu sama lain



%engan kawat !se steril, ketiga strain bakteri dicampur secara merata

9

Plate tersebut lalu diinkubasi selama +-= jam pada suhu )*U7

/

In8eksi Genetik Ke Tembaka Den9an Men99nakan Agrobacterium Tembakau merupakan tanaman dik!til dan inang alami untuk #. tumeaciens ;May! et al., +**9<. Nic!tina tabacum ;May! et al., +**9K 1hatti dan $e, +**>< dan Nic!tina benthamiana ;#nggrait!, +*+< merupakan jenis tembakau yang sering digunakan dalam trans!rmasi genetik. Pada jenis N. tabaccum seperti Samsun ;Stanic et al., >>><, S&0 ;1hatti dan $e, +**><, 1right yell!w ;#n, >=<, anthi ;Su, +*+<, dan asturi ;Miswar,

[23]

+**<, telah berhasil dilakukan trans!rmasi melalui perantara #. tumeaciens. %aun muda ;6!nes, >>9K Su et al., +*+< dan suspensi sel ;#n, >=K May! et al., +**9< merupakan eksplan yang telah berhasil diintr!duksi gen asing. eberhasilan trans!rmasi genetic tembakau telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem bi!l!gi tanaman ;4angbecker et al., +**5<, bi!remediasi untuk merkuri ;$e et al., +**<, tanaman m!del untuk pengujian cekaman bi!tik ;aigman et al., +***<, dan abi!tic ;&iFhsky et al., +**+<. Tabe! %. Sejumlah eterlibatan Tembakau dalam Perkembangan Tanaman Transgenik Ta"n Peristia %,*$ Tanaman transgenik yang pertama dihasilkan berupa tembakau resisten antibi!tik %,*( Tanaman transgenik pertama kali diuji c!ba langsung di Prancis dan #S, berupa tembakau tahan herbisida %,*+ Tanaman tahan serangga berupa tembakau yang tersisipi gen 1t pertama kali dihasilkan !leh !lant Genetic S$stem %,,$ Tanaman transgenik pertama kali diperkenalkan di 7ina dalam bentuk tembakau tahan "irus %,,) Tanaman transgenik pertama kail dik!mersialkan di Er!pa dalam bentuk tembakau tahan herbisida bromo/$nil 

1eberapa tahap H tahap ini umumnya dilakukan dalam pr!ses trans!rmasi genetic pada Tembakau dengan #gr!bacterium. 3mumnya pada pr!ses ini menggunakan  #gr!bacterium tumeaciens dan dilakukan dengan met!de leaf disk 

Gambar $%. Pembuatan Planlet %aun $asil 0neksi  Agrobacterium ;Sumber2 Primr!se, et al , +**<

/.% Persiapan Agrobacterium dan Tembaka Sebelum #. tumeaciens yang telah disipi gene ! interest mengineksi tembakau, dilakukan preparasi k!l!ni #. tumeaciens dalam medium Saint et al ;>>5< maupun medium Susant! et al ;+*< dan aluy! et al ;+*)<. Saint et al ;>>5< Wsebagaimana diuraikan !leh Sant!s! et al ;+***
[24]

menumbuhkan #. tumeaciens dalam dalam media YEP ;yeast etract pept!n * gGl pept!n, * gGl kamir dan  gGl Na7l< yang ditambahkan antibi!tik sebagai kanamisin. eduanya ditumbuhan selama +5 H 5= jam pada suhu +=J7 dengan peng!c!kan *-+** rpm. ultur  dilakukan hingga (%9**  *,. Pada medium Saint et al ;>>5<, kultur #. tumeaciens dilakukan dalam keadaan gelap dan dikulturkan kembali selama sekitar tiga jam pada k!ndisi yang sama setelah diencerkan ** H *** kali dengan medium yang sama. Tembakau yang umumnya disiapkan untuk trans!rmasi genetic biasanya diambil dari daun tembakau muda ;umumnya dari hasil perkecambahan in "itr!< yang telah disterilkan. %aun tembakau yang diambil dip!t!ng dengan ukuran  mm  * mm kemudian diprekultur  selama 9* menit untuk dijadikan sebagai eksplan. /.$ Inok!asi dan Kok!ti-asi 0n!kulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau dalam suspensi #. tumeaciens selama )* menit. Setelah in!kulasi, eksplan diletakkan di atas kertas saring hingga kering, kemudian eksplan ditanam di media k!kulti"asi berupa MS ;MurashigeSk!!g<, aset!siring!n, serta nutrisi tambahan dan diinkubasi pada k!ndisi gelap pada suhu +=J7 selama +-) hari. #set!siring!n ditambahkan untuk merangsang transkripsi gen "ir agar  pr!ses transer T-%N# ke tumbuhan berlangsung lebih cepat. /.& Se!eksi dan Re9enerasi Eksplan dipindahkan ke media seleksi yang berupa medium MS, antibi!tic atau herbisida untuk menentukan sel tembakau yang telah tersisipi gene ! interest ;umumnya antibi!tic kanamisin< dan antibi!tic pembunuh #. tumeaciens ;seperti se!taksim dan karbenisilin untuk membunuh bakteri 'ram-negati<. !mp!sisi media dasar MS seperti pada pustaka. ultur pada media seleksi diinkubasi pada ruang kultur dengan suhu +:J7 dengan !t!peri!disitas cahaya 9 jam terang. Eksplan disubkultur setiap 5-9 minggu. Tabe! $. !mp!sisi Medium MS ;Murashige-Sk!!g< ;Sumber2 Maeda et al, >=<

Penanda bahwa telah terjadi perpindahan T-%N# ke dalam kr!m!s!m tanaman adalah gen resisten antibi!tik. %alam T-%N# disisipi gen resisten Fat kimia tertentu, sehingga, apabila penanda ini telah masuk ke dalam kr!m!s!m tanaman, tanaman tersebut akan tahan Fat kimia itu. 1erikut beberapa penanda ;selected marker< yang laFim digunakan Tabe! &. Selectable 'ene ;Sumber2 Primr!se et al, +**<

[25]

EksplanGkalus yang bertunas dipindahkan ke media pemanjangan tunas dengan medium dan penambahan yang sama seperti media seleksi. Tunas yang terbentuk pada media pemanjangan tunas dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran beruma medium MS disertai penambahan antibi!tic seleksi dan nutrisi tambahan pada b!t!l selai. Planlet yang terbentuk siap untuk dipindahkan ke medium tanah.

#A# III KESIMP3LAN 1erdasarkan pembahasan dalam makalah, dapat ditarik beberapa kesimpulan yaituK . /ungsi ap!ptin ialah menginduksi pr!gram kematian sel. P!tensi tersebut dimanaatkan untuk terapi gen pada penderita penyakit tum!r maupun kanker di mana ap!ptin n!n-esensial dalam tubuhnya terperangkap dalam nukleus tanpa mampu berekspresi. Sedangkan pr!tein '/P digunakan sebagai bi!marker yang memudahkan peneliti dalam mendeteksi l!kasi serta ekspresi gen. +. 7ara is!lasi ap!ptin dari gen 7#8 dengan menggunakan teknik en!l-kl!r!!rm. ). 7ara is!lasi '/P dari ubur-ubur jenis Ae'uorea #ictoria adalah teknik separasi $07. 5. Prinsip trans!rmasi gen ap!ptin ke tumbuhan menggunakan Tri-parental Mating. . Terdapat dua "ekt!r yang digunakan dalam trans!rmasi '(0 ke tumbuhan yakni p'reen00-*++> dan pS!up sebagai "ekt!r helper . $!st k!mpeten yang terpilih untuk mentrans!rmasi '(0 ialah E. 7!li %$. 9. 0nsersi gen ap!ptin ke tembakau menggunakan  Agrobacterium dilakukan dengan met!de leaf disk , yang langkah-langkahnya berupa persiapan daun tembakau dan kultur Agrobacterium, in!kulasi, k!kulti"asi, seleksi, dan regenerasi.

[26]

DAFTAR P3STAKA  #n!nim. N.d. 7!ncept )52 Genes Can Be Mo#ed Between Species.   W(nlineX %iakses dari http2GGwww.dnatb.!rgG)5Gpr!blem.html pada +) N!"ember +*  #rbiant!, Pur!. >>5. 1i!kimia !nsep !nsep %asar. 1andung 2 0T1 1i!l!gyEams53. &ir genes or #irulence region of Ti http2GGwww.bi!l!gyeams5u.c!mG+*+G+G"ir-regi!n-!r-"irulence-regi!n-!ti.htmlZ.8'ijjS3e7! ;diakses +5 N!"ember +* Pukul +.*<

!lasmid . 

7ampbel dan &eece-Mitchell. 1i!l!gi Edisi elima 6ilid . 6akarta 2 Erlangga 7haidamsari, T., et al . +**9. Ekspresi en!tipe gen #PET#4# kaka! ;Tc#P< pada eksplan tembakau. Menara !erkebunan , :5;<, ->. 'el"in, Stant!n 1. ;+**)<.  Agrobacterium Mediated !lant Transformation) The Biolog$  Behind The 5Gene,6ocke$ing7 Tool.  #merican S!ciety !r Micr!bi!l!gy '!!dsell, %a"idK &S71 Pr!tein %ata 1ank. +*. Green luorescent !rotein. http)00www.rcsb.org0pdb08980motm.do:mom*D;<=  diakses pada +: N!"ember +*. $a!, ang., Y!ngyan, 1ai. ;>>*<. The E/pression of oreign Gene "nder The Control of  Cauliflower Mosaic &irus >?s 2-A !romoter.   Shanghai 0nstitute ! Plant Physi!l!gy, 7hina $enyhili, 8ict!ria dan Suratsih. +**). 7!mm!n Tetb!!k 'enetika, Y!gyakarta2 3NY etut Sarna, dkk. +**. 1uku #jar 'enetika Singaraja2 00P N Singaraja Maeda, T., et al , 7hl!rella 0ndustry 7!., 4td, >=. Cell culture method . #ustria. EP **5>9)+ 1. Bacterial Strain 6M89@. Pr!mega. N.d. W(nlineX %iakses dari https2GGw!rldwide.pr!mega.c!mGpr!ductsGcl!ning-and-dna-markersGcl!ning-t!!ls-andc!mpetent-cellsGbacterial-strains-and-c!mpetent-cellsGbacterial-strain-jm*>G diakses pada +) N!"ember +*

Primr!se, S.1., +**). !rinciple of Gene Manipulation  th edition. "SA) Blackwell Science Sugiyart!, M. n.d. Transformasi T,D-A Agrobacterium sebagai Model *ntegrasi Gen pada Tumbuhan. WP%/X Tersedia di2 http2GGsta.uny.ac.idGsitesGdeaultGilesGpenelitianGlilisugiyart!-ssi-msiGagr!bacterium.pd.W%iakses pada +5 N!"ember +* Pukul *).)*X. Sant!r!, T. 6., et al , +*. !nstruksi andidat 'en #8 1eg!m!"irus pada p10+ dan 0ntr!duksinya ke dalam Tembakau Menggunakan 8ekt!r #gr!bacterium tumeaciens 1icinch!ninic #cid ;17#< Pr!tein #ssay ;Smith<. 6urnal AgroBiogen , :;<, >- 8adawale, #shut!sh, dkk. ;+*<. Transformation of Agrobacterium Tumifascience %BA <<9< with a Cholin 4/idase,Co/ Gene Conferring Salinit$ Tolerance. %epartment !  1i!chemistry, /aculty ! Science, The Maharaja Sayajira! 3ni"ersity ! 1ar!da. aluy!, S., et al , +*). Trans!rmasi 'enetik Tembakau dengan 'en 7!ld Sh!ck Pr!tein melalui Perantara #gr!bacterium tumeaciens. 6urnal AgroBiogen,>;+<, =-9. @ambryski, P. et al . >=). Ti plasmid #ector for the introduction of D-A into plant cells without  alteration of their normal regeneration capacit$.  W6urnalX The EM1( 6!urnal 8!l. + N!. + pp.+5) H +*.

[27]