INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Químico Farmacéutico Industrial
Laboratorio de Fisiología Celular
Grupo: 4FV1 Profesores: De la Cruz López Fidel Garcés Ramírez Linda Rojas Franco Placido “Practica 6.
Potencial de acción compuesto”
INTRODUCCIÓN. La función principal de las fibras nerviosas es la conducción del impulso nervioso (potencial de acción). En el caso de las fibras fibr as sensoriales (aferentes) el potencial de acción es generado en la terminal nerviosa periférica y es conducido hacia la terminal nerviosa central. El potencial de acción en las fibras motoras (eferentes) es generado en el cono axónico y es conducido hacia la periferia hasta su efector. Conducción ortodrómica significa la conducción del impulso nervioso en la dirección
adecuada. La conducción antidrómica significa lo opuesto. Los nervios periféricos están constituidos por un grupo heterogéneo de fibras nerviosas. La heterogeneidad de las fibras nerviosas se debe tanto a sus características geométricas (diámetro), histológicas (presencia o ausencia de mielina), pertenencia (somáticas o autónomas), funcionales (sensoriales o motoras). También son heterogéneas en cuanto a propiedades de excitabilidad como sería la magnitud del estímulo umbral y la duración de su período refractario, tanto absoluto como relativo. Considerando todas estas características las fibras nerviosas pueden ser clasificadas de diversas maneras. La clasificación más general las clasifica como A (alfa, beta, gamma y delta), B y C. Otra clasificación, la cual es utilizada principalmente para fibras sensoriales musculares, las clasifica en fibras tipo Ia y Ib, II, III y IV. Independientemente del tipo de fibra nerviosa, la generación y la conducción del potencial de acción tiene los mismos principios. La generación del potencial de acción es debida a un potencial electrotónico producido ya sea por actividad sináptica o por el estímulo aplicado directamente sob re la terminal nerviosa, libre en muchos casos, o asociada a una estructura con características específicas. Este potencial electrotónico activa canales iónicos operados por voltaje generando corrientes catiónicas entrantes y salientes que se propagan a través y a lo largo de la membrana (axolema) y de los líquidos intersticial e intracelular (axoplasma). Los responsables de las corrientes iónicas son canales de sodio y de potasio operados por voltaje que se activan de manera secuencial, produciendo corrientes iónicas que dan lugar al cambio transitorio del potencial de membrana conocido como potencial de acción, el cual una vez producido, con características todo o nada, se propaga a lo largo de la fibra nerviosa activando automáticamente a los canales iónicos, influidos por el campo eléctrico del mismo potencial de ac ción. El potencial de acción es conducido tanto activamente como pasivamente, la conducción pasiva se realiza en segmentos de membrana que carecen de canales iónicos operados por voltaje, en la conducción pasiva intervienen los canales iónicos. Cuando un nervio es dispuesto sobre electrodos de registro y se aplica un estímulo de magnitud suficiente, es posible registrar la suma (por sumación espacial) de los potenciales de acción de todas las fibras que lo constituyen (potencial de acción compuesto). El registro obtenido de esta manera (electroneurograma) muestra diversos componentes que corresponden a los diferentes tipos de fibras que constituyen al nervio y que son separados en base al estímulo umbral y en base a la latencia relativa (debido a su diferente velocidad de conducción) co n que aparecen. Además de investigar el tipo de fibras que constituyen al nervio, este modelo es útil para ilustrar conceptos fisiológicos relacionados con las propiedades de excitabilidad de las fibras nerviosas y de otros tejidos excitables, investigar el efecto de fármacos y xenobióticos sobre la conducción nerviosa, estudios sobre regeneración y enfermedades degenerativas (desmielinizantes), etc.
OBJETIVOS.
Medir la respuesta eléctrica de un nervio completo. Determinar las propiedades de conducción de las fibras que componen a un nervio. Determinar el valor de estímulo umbral y estímulo máximo del nervio ciático de rana toro, utilizando el equipo Biopac. Determinar la velocidad de propagación del estímulo eléctrico a través del nervio a diferentes temperaturas, utilizando el programa Biopac. Determinar el tiempo interestímulo necesario para producir una suma temporal entre dos estímulos subumbrales. Determinar el periodo refractario para una población de fibras nerviosas.
FUNDAMENTO Usando por primera vez el osciloscopio de rayos catódicos como un aparato indicador, Gasser y Erlanger (1922) pudieron registrar varios picos en el potencial de acción registrado del nervio ciático de rana. Ellos correlacionaron esos componentes con las fibras de diámetros diferentes que forman el nervio y correctamente supusieron que los potenciales de acción generados por las fibras individuales se suman para dar el potencial de acción compuesto, cuya forma es regular si la distancia entre los electrodos de estimulación y de r egistro es corta. En cambio, si la distancia es grande, el potencial de acción se separa en los diferentes componentes que corresponden a las fibras con diferentes velocidades de conducción. Podríamos comparar este potencial de acción con los corredores en una carrera, que forman un grupo compacto inmediatamente después del inicio y, debido a sus diferentes velocidades, se separan en grupos conforme aumenta la distancia. Es posible registrar el potencial de acción con un microelectrodo sin penetrar en el axón, colocando dos electrodos separados sobre su superficie y comparando la carga eléctrica en cada punto. Un electrodo localizado en un punto en el que existe un potencial de acción será negativo en comparación con el electrodo en el que no exista un potencial de acción. Conforme se conduce el potencial de acción hacia el segundo electrodo, la polaridad del registro se invierte. Esta técnica se utiliza en clínica para valorar la función nerviosa. Los nervios perifericos y muchas vías centrales contienen una población de axones de diversos diámetros, algunos mielinizados y otros amielínicos. En consecuencia, los potenciales de acción circulan a distinta velocidad por los axones individuales, y por esto el registro de este nervio con un electrodo externo no muestra único sincronico, sino que presenta una serie de picos que varian en cuanto a su duración (según la velocidad de conducción de los grupos de axones ) y tamaño (según el numero de axones dentro de cada grupo de velocidad). Esto se denomina potencial de acción compuesto, y su forma concreta es característica de la población de axones de cada nervio. La utilidad clínica de estos registros radica en que permiten mostrar la disfunción de un
grupo concreto de axones asociados con una función específica en determinados estados patológicos y, además, se trata de una técnica no invasiva que se puede realizar con electrodos sobre la superficie de la piel.
Período refractario En 1899 Francis Gotch (1853-1913) y Burchen demostraron que cuando dos estímulos separados por un intervalo menor de aproximadamente 8 mseg (dependiendo de la temperatura) eran aplicados al nervio, el segundo estímulo no producía una perturbación propagada. Esto significaba que inmediatamente después del estado excitado el nervio se encontraba inexcitable y Adrian y Lucas (1912) estudiaron con cuidado éste fenómeno usando el músculo como indicador. Ellos demostraron que durante los primeros 25 mseg después de un estímulo el nervio no puede ser excitado por otro estímulo de cualquier intensidad (período refractario absoluto), pero que desde ese momento hasta aproximadamente 12 mseg la excitabilidad del nervio era menor que la normal, pero aumentaba gradualmente (período refractario relativo) y después, hasta aproximadamente 28 mseg, había un periodo de excitabilidad aumentada (período supernormal). Posteriormente el nervio regresaba a su estado de excitabilidad antes del primer estímulo. Características todo-o-nada Los experimentos de Keith Lucas en 1909 habían demostrado que al variar la intensidad del estímulo excitatorio aplicado al nervio ciático se obtenían diferentes grados de contracción en el músculo y que estos no eran tan numerosos como los grados de intensidad del estímulo; además, las contracciones ocurrían en escalones menos numerosos que el número de fibras motoras. Estos resultados fueron considerados como una indicación de que los diferentes grados de contracción e ran debidos solamente al número de fibras musculares contrayéndose; en otras palabras, cada fibra nerviosa o muscular podía ser excitada a su máxima capacidad o no serlo. Ese hecho ya había sido observado en 1871 por H.P. Bowditch (1840-1911) estimulando directamente el corazón y la posibilidad de que el fenómeno también pudiera ser aplicado al nervio había sido discutida en 1902 por Francis Gotch (18531913). Sin embargo, la demostración del caracter todo-o-nada de la excitación propagada fue obtenida por Adrian (1914), quien pudo demostrar que después de pasar una regíon anestesiada del nervio ciático, el potencial de acción recuperaba su máxima amplitud cuando entraba a un área normal.
METODOLOGÍA.
I. Montaje del equipo de estimulación y de registro El electrodo de estimulación sirve para aplicar estímulos eléctricos al nervio y debe colocarse en un extremo de la cámara de nervio aislado, el electrodo de estimulación mide los cambios de voltaje que se dan en el nervio en respuesta a la aplicación de estímulos, éste debe colocarse en el otro extremo de la cámara de nervio aislado.
1. Coloque el módulo MP36 (Biopac) en la parte superior de su mesa de laboratorio, conéctelo a la corriente y a la computadora con el cable USB. 2. Realice una inspección rápida al módulo MP36, ubique el canal 2 (CH2) en la parte delantera y “Analog out” en la parte trasera del
equipo. Es muy importante anticipar que no debe haber conexión alguna en el canal 1 (CH1). 3. Encienda la computadora pero no encienda el Biopac. 4. Guíese con la Figura 10 para hacer las siguientes conexiones:
a) Electrodos bipolares de registro. 5. Conecte el cable SS2L al canal 2 (CH2) del Biopac (MP36). 6. Conecte el terminal rojo Vin(+) del SS2L a la última banda metálica de la cámara de nervio aislado y conecte el terminal blanco Vin(-) del SS2L a la penúltima banda metálica de la cámara. Esto puede moverse después, de acuerdo a la longitud del nervio disecado.
b) Electrodos bipolares de estimulación. 7. Identifique el cable DB9H y conéctelo a “Analog out” del Biopac. 8. Conecte el terminal rojo St(+) del DB9H a la banda metálica más externa de la cámara de nervio aislado (al extremo opuesto de donde conectó los terminales del SS2L).
c) Prueba de montaje correcto. 11. Humedezca un trozo de hilo grueso en solución Ringer.
13. Coloque el hilo húmedo en la cámara de nervio aislado y aplique un estímulo de 0.050 V (50 mV) dando clic en la pestaña inicio (en la esquina inferior derecha). Debe observar el estímulo en el canal 1 y el artefacto del estímulo en el canal 2. 14. Si no observa el artefacto, aumente la intensidad del estímulo en intervalos de 0.050 V, hasta que pueda observarlo.
12. Abra el archivo PAC-Ciatico-01.gtl, el cual tiene los parámetros de calibración para el Biopac. Observe que en la parte superior de la pantalla aparece un rectángulo rojo con varios parámetros de estimulación: encendido y apagado, frecuencia, voltaje, duración y número de pulsos o estímulos y canal de referencia. La señal del estimulador se verá en el canal 1 (CH1) y la señal de registro en el canal 2 (CH2). II. Montaje de la preparación de nervio ciático aislado de rana toro. 3. Corte la piel de una de las patas posteriores y remuévala hasta descubrir completamente la extremidad. Separe cuidadosamente los músculos en la cara posterior del muslo y localice el nervio ciático 4. Sin tocar el nervio con objetos metálicos, descúbralo en ambos sentidos hasta la médula espinal por un lado y hasta el extremo distal del fémur por el otro. Corte los músculos que sea necesario. III. Determinaciones prácticas a) Estímulos umbral y máximo El potencial de acción compuesto requiere una cantidad mínima de carga para ser generado pero, a diferencia del potencial de acción simple, su amplitud aumenta al incrementar la magnitud de la estimulación. Esta tendencia tiene un límite, y se conoce como estímulo máximo al valor de estimulación que induce la máxima amplitud de respuesta de un nervio.
9. Conecte el terminal negro St(-) del DB9H al cable negro (GND) del SS2L y conecte éste último a la banda metálica siguiente de la cámara de nervio aislado. 10. Encienda el Biopac.
15. Retire el hilo de la cámara y proceda a hacer la disección del nervio ciático.
5. Amarre un trozo de hilo alrededor del nervio tan cerca de la médula espinal como sea posible. Con unas tijeras finas separe el nervio de la médula, de manera que quede sujeto con el hilo. 6. Con ayuda de los disectores de vidrio, separe cuidadosamente el nervio, hasta liberar una porción de 8 a 10 cm. 7. Coloque el nervio extendido sobre las bandas metálicas de la cámara de nervio aislado y mueva los electrodos de acuerdo a la longitud del nervio.
1. Abra el archivo PAC-Ciatico-01.gtl, note que la duración del estímulo está fija (0.2 mseg) y considere que para grabar sus registros debe cambiar el nombre del archivo cada vez que haga un cambio. 2. Aplique un estímulo inicial de 0.050 V (50 mV) y observe. Si no hay PAC, aumente gradualmente la magnitud del estímulo (a intervalos de 0.050 V) hasta que se aprecie la más leve respuesta del nervio. Este es el estímulo umbral.
3. Siga aumentando el voltaje del estímulo, observe cómo aumenta gradualmente la amplitud del PAC. 4. Encuentre las características del estímulo (voltaje y duración) en las que el PAC deja de aumentar su amplitud, aunque se siga incrementando el voltaje del estímulo. Éste es el estímulo máximo.
b) Velocidad de conducción 1. Aplique un estímulo de intensidad intermedia entre el umbral y el máximo. Mida el intervalo que separa el inicio del estímulo del inicio del PAC (latencia).
2. Mida la separación entre el electrodo de estimulación y el electrodo de registro que estén más próximos entre sí en la cámara de nervio aislado. Con estos valores calcule la velocidad de conducción del nervio (m/s). 3. Repita la operación después de poner unas gotas de Ringer frío sobre el nervio ciático.
c) Suma temporal 1. Abra el archivo PAC-Ciatico-02.gtl. En este caso se aplican dos estímulos subumbrales con un tiempo de retardo determinado entre uno y otro. 2. Aplique estímulos con voltaje ligeramente menor al del estímulo umbral y con un tiempo de retardo de 25 ms. Observe.
3. Repita la experiencia reduciendo el tiempo interestímulo paulatinamente hasta que observe un PAC. Este tiempo es el necesario para que se sumen los potenciales locales producidos por los estímulos subumbrales. Tiempo interestímulo para producir un PAC perceptible: _________________ ms. 4. Ahora reduzca el tiempo interestímulo un poco más y observe lo que sucede.
4. Siga reduciendo el tiempo interestímulo, hasta que la respuesta al segundo estímulo desaparezca por completo.
d) Período refractario 1. Abra nuevamente PAC-Ciatico-02.gtl y aplique estímulos con un voltaje ligeramente superior al umbral y un tiempo interestímulo de 30 ms. Deben observarse 2 PACs similares en amplitud y duración. 2. Reduzca gradualmente el tiempo de retardo del segundo estímulo, observando atentamente la respuesta al segundo estímulo, hasta que se aprecie una leve reducción
e) Curva intensidad-duración 1. Abra la plantilla PAC-Ciatico-03.gtl y ajuste el voltaje del estímulo ligeramente por arriba del valor umbral, de modo que el PAC tenga una forma bien definida. Registre las características del estímulo y mida la amplitud y duración del PAC. 2. Reduzca el voltaje del estímulo en una
3. Reduzca nuevamente el voltaje del estímulo y ajuste la duración para tener la misma forma (amplitud y duración) del PAC. Registre el nuevo par de valores. 4. Repita el proceso hasta que el estímulo se haya reducido a un punto en el que no logre generar un PAC aun aumentando la duración (o hasta valor máximo permitido por el equipo). 8. Repita el proceso, pero ahora aumente el voltaje y reduzca la duración del estímulo
RESULTADO.
Grafica 1. Respuesta umbral del nervio ciático de rana aplicando un estímulo de 0.230 mV y una duración de 0.2 ms. El potencial de acción compuesto requiere una cantidad mínima de carga para ser generado.
Grafica 2. Respuesta máxima del nervio ciático de rana aplicando un estímulo de 0.500 mV y 0.2 ms. Se diferencia del potencial de acción simple, su amplitud aumenta al incrementar la magnitud de la estimulación. Esta tendencia tiene un límite, y se conoce como estímulo máximo al valor de estimulación que induce la máxima amplitud de respuesta de un nervio.
Gráfica 3. Velocidad de conducción del nervio ciático de rana aplicando un estímulo medio de 0.300 mV a una temperatura ambiente de 22°C. La velocidad de conducción es de 0.7000 ms. Puesto que los electrodos de registro están situados a cierta distancia de los de estimulación, la señal eléctrica toma cierto tiempo en llegar desde su punto de origen hasta donde es registrada, y la duración de este periodo (llamado latencia) depende de la velocidad con la que el nervio conduce los impulsos.
Gráfica 4. Velocidad de conducción del nervio ciático de rana aplicando un estímulo medio de 0.300 mV a una temperatura ambiente de 9°C. La velocidad de conducción es de 1.900 ms.
Gráfica 5. Suma temporal de dos estímulos subumbrales (amplitud 0.1000 mV) con un tiempo interestímulo de 25 ms. No se observa la generación de un PAC.
Gráfica 6. Suma temporal de dos estímulos subumbrales (amplitud 0.1000 mV) con un tiempo interestímulo de 0.70 ms. Se observa la generación de un PAC. Este tiempo es el necesario para que se sumen los potenciales locales producidos por los estímulos subumbrales.
Gráfica 7.. Periodo refractario. Dos estímulos aplicados al nervio ciático de rana con un valor ligeramente superior al valor umbral, este valor fue de 0.300 v con un retardo entre los dos estímulos de 0.35 ms. Donde se observa que ambas respuestas son similares en amplitud y forma.
Disminución del retardo en el segundo estimulo, en un retardo entre los dos estímulos de 0.20 ms, se observa una disminución de la respuesta del segundo estimulo. DISCUSIÓN. Las fibras que forman un nervio son de diámetro diferentes y generan potenciales de acción individuales que se suman para dar un potencial de acción compuesto. Se utilizó un nervio ciático de rana ya que está formado por varios axones de distinto diámetro, tanto motoras como sensitivas y tienen diferente velocidad de conducción. El programa Biopac permitió visualizar y cuantificar tanto los parámetros de la estimulación nerviosa como los parámetros en tiempo y voltaje de la respuesta. Se llevaron a cabo diferentes pruebas para observar las características y propiedades de un potencial de acción del nervio ciático de rana. Se determinó el estimulo umbral con una intensidad de 0.230mV, en este caso la única que genera un PAC es la fibra más excitable. Además, un estímulo máximo de intensidad 0.500 mV, a diferencia del umbral en este caso todas las fibras presentes en el nervio responden al estímulo. Además, como se observa en los periodos refractarios, se encontró que después de 0.20 mS desaparece el segundo estimulo. Se utilizó solución de ringer a temperatura ambiente y a temperatura baja para determinar la velocidad del potencial de acción compuesto, midiendo la latencia en donde se observa Que la solución ringer fría disminuye la velocidad de conducción del potencial pues disminuye la cinética de los canales iónicos. Suma y facilitación Adrian y Lucas (1912) mostraron que hay una forma de aumento de la excitabilidad que ocurre solamente en el punto donde se aplica un estímulo, lo que puede demostrarse aplicando dos estímulos inadecuados (debemos entender
subumbrales) y si el segundo sigue al primero por aproximadamente 0.8 ms, se produce una perturbación propagada. De esto es claro que el primer estímulo no fue efectivo para producir la perturbación propagada, pero dejó atrás una alteración de cierto tipo que persistió por un tiempo medible y que se añadió a la producida por el segundo estímulo. Estas observaciones fueron premonitorias de las respuestas graduadas, subumbrales, no propagadas, que Katz demostraría en los 1930's siguiendo una técnica semejante y que Hodgkin registraría directamente poco tiempo después.
CONCLUSIÓN
El potencial de acción compuesto es la suma de varios potenciales de acción individuales. El potencial de acción compuesto no implica la ley del todo o nada. En el registro de un PAC pueden aparecer picos por las diferentes velocidades de conducción de las fibras. La velocidad de conducción del potencial de acción compuesto a temperatura ambiente del nervio ciático de rana es de 0.7 mS. El potencial de acción del nervio ciático de rana depende del número y grosor de los axones de lo conforman. A mayor intensidad de estímulo menor duración de la propagación. El potencial de acción depende de la intensidad del estímulo. Existe una suma de potenciales de acción para generar un potencial de acción compuesto.
BIBLIOGRAFÍA. •
Berne y Levy.” Fisiología “. 6ta edición. Editorial Elsevier Págs. 67-76
•
Boron y Boulpaep. “Fisiología medica”. Editorial Elsevier. Págs. 204 -215.
