Giovanna Colletes Sestito Giovanna Queiroz Marchetto Jéssica Silva Kalylla Souza Silva Lara Souza Crepaldi
Relatório de Biologia Molecular Grupo 3: - Preparação de Células Competentes; - Transformação bacteriana com DNA plasmidial.
Centro Universitário de Araraquara - UNIARA Medicina Maio/2010
Introdução A introdução de um DNA plasmidial na célula bacteriana a torna competente. Este DNA exógeno passa a fazer parte do material genético bacteriano, que será herdado pelas novas células à medida que a bactéria se multiplica. As bactérias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma ou mais características novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibiótico. Uma bactéria competente é uma bactéria que está apta a receber DNA exógeno. A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida através de diferentes técnicas. Estas técnicas envolvem tratamento com soluções, como cloreto de cálcio, e mudanças bruscas de temperatura. Os íons de metal e as mudanças bruscas de temperatura alteram a permeabilidade da parede celular, fazendo com que estas células permitam a entrada de DNA exógeno através da membrana plasmática. As bactérias competentes são bastante frágeis e devem ser manuseadas com cuidado. A quantidade de células transformadas por 1 micrograma de DNA é chamada eficiência da transformação. A transformação é a introdução de moléculas de DNA em uma célula hospedeira (bactérias e células eucarióticas, incluindo células vegetais e animais). É realizada por exposição breve da célula à cátions divalentes, os quais a torna transitoriamente permeável a pequenas moléculas de DNA. Assim, moléculas de plasmídeos recombinantes contendo DNA estrangeiro podem ser introduzidas na bactéria, onde se replicam normalmente. O método em questão baseia-se na experiência de Griffith, cuja importância deve-se à relação com o mecanismo de crescimento populacional por determinado período tempo, no qual se observa a existência de quatro fases distintas: latência, exponencial ou logarítmica, estacionária e declínio ou morte: Bactérias E.coli possuem membrana plasmática carregada negativamente devido à presença de esfingomielina - fosfolipídeo que apresenta o grupo PO4- em sua constituição. É importante ressaltar que o experimento referido deve ser realizado no momento em que o grupo de estudo bacteriano encontra-se na fase logarítmica, pois nesta o mesmo está em numero dobrado, uma vez que a velocidade de multiplicação é proporcional ao número de células presentes, fato que proporciona
maior êxito na incorporação do plasmídeo. Na fase em questão, a utilização do cloreto de cálcio sob banho de gelo, faz com que a fluidez da membrana celular seja cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2 se ligam a estes grupamentos, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atração entre as moléculas do DNA no local específico da ligação. O choque térmico complementa este processo, provavelmente criando uma diferença de temperatura entre o interior e o exterior da célula bacteriana, o que promove a abertura dos poros da membrana bacteriana, auxiliando na entrada do DNA através desses canais.
Esse processo é de grande importância para a Biologia Molecular no que se refere à manipulação genética, pois após a entrada do DNA plasmídial, que possui o gene de resistência a determinado antibiótico, tal como a ampicilina, as bactérias desenvolvem sua capacidade de defesa em relação ao mesmo. Dessa forma, as que não possuem o plasmídeo irão morrer na presença do antibiótico e, portanto, não formarão colônias na placa de ágar. Várias técnicas têm sido descritas para a introdução de DNA em células bacterianas, como choque térmico e eletroporação.
a) Choque térmico: as células hospedeiras (preparadas com cloreto de cálcio) são misturadas com moléculas de DNA e submetidas a um choque térmico que resulta num aumento da eficiência da transformação. b) Eletroporação: é um processo físico que transitoriamente permeabiliza membranas de células procarióticas e eucarióticas a partir de um pulso elétrico. 9
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Eficiência: 10 - 10 colônias transformadas/μg de DNA plasmidi al. A eletroporação é feita a baixa temperatura (0-4°C), pois a eficiência é reduzida em cerca de 100 vezes à temperatura ambiente. O método utilizado para transformação bacteriana foi o descrito pelo fabricante (Gibco-BRL- Invitrogen), Invitrogen), 1 μL da mistura da ligação foi adicionada a 40 μL ou 100 μL da suspensão de células eletrocompetentes. Em seguida essas células
foram transferidas para um cubeta de eletroporação (BRL) sendo submetidas a um campo elétrico (4 KΩ, 330 μF) para permitir a entrada do plasmídeo na célula. Após a eletroporação as células foram ressuspendidas em 1 mL de SOC e incubadas a 37°C, sob agitação por 1 hora. Após a incubação, alíquotas da suspensão foram plaqueadas em meio LA contendo os antibióticos adequados a fim de selecionar os transformantes. Outro método, muito utilizado na transformação de células vegetais é a transformação por biobalística, na qual projéteis de ouro (ou tungstênio) são cobertos com moléculas de DNA e utilizados para bombardear células hospedeiras. Este método foi desenvolvido por Sanford e colaboradores na Universidade de Cornell, e foi designado biolística (biológico + balística = biolística) em razão da alta velocidade imprimida aos microscópicos projéteis revestidos com DNA (Sanford, 1992) Citado por (Borém, 1998). Essa técnica consiste no uso de partículas diminutas (1,0 a 1,5 mm) de tungstênio ou ouro, que são revestidas com DNA a ser transferido. As partículas podem ser acelerados por ar comprimido (Hélio), onda de choque elétrico e pólvora entre outros; com força suficiente para penetrarem na camada exterior da parede das células de um tecido alvo, com isto, uma quantidade de DNA das partículas localiza-se no núcleo das células do tecido utilizado, o qual passa incorporar o novo DNA (Moreira et al., 1999). O aparelho responsável por gerar a onda de choque é denominado de acelerador de micropartículas. Todo o processo ocorre no interior de
uma câmara sob vácuo, para evitar a desaceleração das partículas causadas pelo ar. É uma técnica bastante versátil, pois permite além da transformação de um genótipo, pode também ser utilizado para uma organela como a mitocôndria ou o cloroplasto. É relativamente simples, rápida e não envolve muito investimento de infra-estrutura e equipamentos.
Material e Método Atividade 1: protocolo Clássico para a Preparação de Células Competentes Objetivo: indução de bactérias competentes.
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Material: Equipamentos Tubos de microcentrífuga; Micropipetadores automáticos; Bico de Bussen;
Método: 1. Separar a bactéria do meio de cultura e centrifugar a 500 rpm, por 5 minutos; Obs¹: é importante que a temperatura não ultrapasse 4ºC, pois a mesma contribui para a diminuição da atividade metabólica bacteriana, estacionando seu crescimento e impedindo o choque térmico. Obs²: para garantir que só haja DH5α, trabalhar atrás da chama do Bico de Bussen. 2. Flambar o tubo; Obs³: o ato de flambar é fundamental para a esterilização, sendo utilizada para tanto a chama oxidante. 3. Descartar sobrenadante e secar o tubo; 4. Flambar o tubo novamente; 5. Introduzir CaCl2 no tubo e flambar; 6. Guardar em um ambiente refrigerado, inferior a 4ºC, por 10 minutos; 7. Centrifugar por 3 minutos; 8. Refrigerar novamente; 9. Retirar o tubo, flambar e descartar CaCl2, flambando-o navamento para colocálo no refrigerador; 10. Suspender em 500 uL de CaCl2 gelado.
Atividade 2: transformação bacteriana com DNA plasmidial. Objetivo: introdução de DNA plasmidial em células de E. coli a partir da transformação e análise de colônias bacterianas transformadas e não transformadas.
4. 5. 6. 7.
1. 2. 3.
Material: Equipamentos Tubos de microcentrífuga; Micropipetadores automáticos; Banho-maria 65ºC; Estufa microbiológica 37ºC. Reagentes Meio de cultura LB líquido e sólido; Ampicilina 50 mg/mL (esterilizada por ultrafiltração); Gelo. Obs: todo o material e soluções devem ser esterilizados e manipulados em ambiente estéril. Para tanto, é fundamental o trabalho próximo ao bico de Bunsen. Método:
1.
Misturar 100 uL de células de E. coli DH5α competentes com 20 uL de DNA
plasmidial, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; 2. Preparar as placas de Petri com meio LB sólido; 3. Incubar o tubo no gelo por 20 minutos; 4. Transferir o tubo de microcentrífuga para banho-maria a 42ºC, por 2 minutos; 5. Recolocar, imediatamente, o tubo no gelo por 10 minutos; 6. Adicionar 1 mL de meio de cultura LB líquido e incubar a 37ºC por 30 minutos; 7. Utilizar a alça de Drigalski para espalhar a suspensão de bactérias sobre a placa de Petri contendo meio LB sólido e 50 ug/m de ampicilina; 8. Incubar as placas a 37ºC, invertidas, durante 16-18 horas; 9. Contar o numero de colônias transformadas e recombinantes; 10. Repetir o procedimento com DH5α não transformadas a fim de obter um controle negativo.
Discussão dos Resultados e Conclusão O processo de transformação bacteriana no caso do nosso experimento não obteve êxito, porém vale ressaltar que em outros grupos o mesmo foi eficaz, o que garante a comprovação do método. As possíveis causas que podem ter invalidado o sucesso do procedimento correspondem à contaminação do material por agentes externos, a elevação da temperatura que pode ter ocasionado a desnaturação da membrana bacteriana e sua consequente lise celular, o manuseio de forma errônea na preparação das bactérias competentes, entre outras. Considerando a fragilidade das bactérias, é de fundamental importância ressaltar a necessidade do estabelecimento de condições fisiológicas especiais para que se obtenha completa eficiência na transformação em questão.
Referencias Bibliográficas 1. 2.
3.
4.
DELVIN, T.M. Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas . 6ºed. Blücher, 2007. Ciências Físicas e Biomoleculares - IFSC/USP. Transformação em bactérias competentes. Disponível em: http://biologia.ifsc.usp.br/biomol/praticas/Aula%2005.pdf. Acesso em: 17.05.2010. Universidade Estadual Paulista. Genética de Bactérias . Disponível em: http://www.fcav.unesp.br/download/deptos/biologia/Manoel_Victor/genetica_de _bacterias.pdf. Acesso em: 17.05.2010. Universidade de São Paulo. Obtenção de células competentes de E. coli . Disponível em: http://web.cena.usp.br/apostilas/Figueira/2008/Apostila%2002%20Miniprep%20e%20Celulas%20Competentes.doc. prep%20e%20Celulas%20 Competentes.doc. Acesso em: 17.05.2010.
