MIKROBIOLOGI Alat laboratorium A. Mikroskop
B. Autoklaf
Lensa objektif : berfungsi membentuk bayangan pertama dan menentukan struktur mikroba yang terlihat pada bayangan serta dapat memperbesar nilai ―aperture‖ yaitu daya pisah suatu lensa yang menentukan daya pisah specimen. Memiliki pembesaran 4, 10, 40 dan 100x Lensa okuler : merupakan lensa yg berdekatan dgn mata pengamat dpt memperbsar hingga 4 hingga 25x Lensa Kondensor : Lensa untuk mengumpulkan cahaya, bila pengaturannya tepat daya pisah menjadi maksimal Meja preparat : tempat meletakkan objek Kondensor : merupakan kumpulan lensa kondensor untuk mengumpulkan cahaya Diafragma : mengatur banyak cahaya yang masuk dengan mengatur bukaan iris Cermin : memiliki 2 sisi, datar dan cekung. Berfungsi untuk memantulkan sinar Pengatur Kasar dan Halus : komponen terletak pada lengan untuk mengatur kedudukan meja objek terhadap lensa objek.
Alat untuk mensterilkan alat dan bahan untuk mikrobiologi, menggunakan uap bersuhu 121°C dan tekanan sebesar 15Psi. tekanan dan suhu yang besar membunuh mikroba
C. Laminar Flow
Merupakan tempat pembuatan media atau bahan makanan. Media atau bahan makanan haruslah dibuat dengan steril, maka itu digunakanlah laminar flow
D. Inkubator Merupakan
tempat
untuk
mengembangbiakkan
bakteri, dengan kemampuan menjaga suhu stabil dan konstan, serta sesuai untuk pertumbuhan bakteri
E. Mikropipet Digunakan untuk memindahkan cairan kurang dari 100 µl. terdapat 2 jenis yaitu yang adjustable, yang dapat di atur jumlah cairan yang dipindah atau fixed yang tidak bisa diatur, hanya satu volume saja.
F. Centifuge
Alat
untuk
memisahkan
senyawa
dengan
berat
molekul yang berbeda dengan memanfaatkan gaya centrifuge
G. Hot Plate Stirrer dan Stirrer Bar Alat untuk menghomogenkan suatu larutan, pelat dapat
dipanaskan
sehingga
dapat
mempercepat
homogenisasi
H. Vortex Mixer Merupakan alat pengaduk untuk menghomogenkan cairan dalam suatu tabung reaksi
I.
Hot Plate Alat digunakan untuk melarutkan media dalam air aquadest, homogen
kemudian
dipanaskan
supaya
larutan
J. pH meter
Alat digunakan untuk mengukur pH (keasaman) suatu bahan
atau
larutan.
pH
sangat
penting
dalam
pembuatan media karena berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba
K. Cawan petri Fungsi sebagai wadah menimbang, menyimpan bahan kimia, membantu menumbuhkan mikroba pada analisa mikrobiologi
L. Tabung Durham Tabung durham (ketiga dari atas) berfungsi sebagai penampung hasil metabolism bakteri, ditempatkan
terbalik pada tabung reaksi. Berbentuk seperti tabung reaksi tetapi lebih kecil
M. Labu Erlenmeyer
Berfungsi sebagai penampung larutan, bahan atau cairan.
Bisa
digunakan
menghomogenkan
bahan
untuk
meracik
komposisi
dan media
menampung akuades, kultivasi mikroba, kultur cair dll.
N. Beaker Glass Beaker
glass
digunakan
untuk
berbagai
macam
keperluan. Fungsinya untuk memanaskan media dalam bentuk cairan
O. L rod (batang L) Berfungsi untuk meratakan mikroba pada permukaan medium agar dengan cara didorong atau diputar pada permukaan medium, agar bakteri tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata.
P. Ose OSe bulat Berfungsi untuk menginokulasi kultur mikrobia dengan metode streak. Untuk ose lurus berfungsi
untuk
memindahkan
mikroorganisme
dengan menusuk medium pada tabung reaksi
Q. Colony Counter Mempermudah penghitungan koloni bakteri, sangat berguna untuk jumlah koloni bakteri yang sangat besar
R. Bunsen burner Untuk menciptakan kondisi steril, dan sterilisasi ose
S. Pinset Untuk mengambil benda dengan cara dijepit, missal untuk mengambil cakram antibiotik
MEDIA A. Bahan media 1. Bahan dasar : - Air sebagai pealrut - Agar untuk pemadat (lebih sulit didegradasi) - Gelatin untuk pemadat (lebih mudah diuraikan) - Silica gel sebagai pemadat media (khusus mikro. Autotroph obligat) 2. Nutrisi (Makro serperti C, H, O, N, P; Mikro seperti K, Mg, Fe, Ca) 3. Bahan tambahan seperti indicator perubahan pH (phenol red) 4. Bahan yang sering digunakan pada pembuatan media : - Agar - Peptone, merupakan produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti kedelai , susu etc. - Meat extract, mengandung basa organik, terbuat dari daging - Yeast extract, terbuat dari ragi roti - Karbohidrat, untuk pengaya media B. Klasifikasi media 1. Berdasarkan Komposisi media dibagi 3 yaitu Sintesis (Komposisi diketahui secara pasti), Semi Sintesis ( Sebagian komposisi diketahui), Non Sintesis ( Komposisi tidak diketahui secara pasti) 2. Berdasarkan Tujuan dibagi menjadi 7, yaitu media isolasi, selektif, diperkaya, peremajaan kultur, menentukan kebutuhan nutrisi spesifik, karakterisasi bakteri, differensial 3. Secara fisik dibagi menjadi 3 (padat, cair, setengah padat Media Cair : - Meat extract : daging sapi diiris kecil, lalu direbus mendidih 30 menit, saring lalu sterilkan dalam 120 C selama 20 menit - Air Pepton: Pepton, NaCl, aquades. - Bouillion : extract daging , pepton, nacl, aquades Keti ga media diatas merupakan media un iversal
-
-
Brain Heart Infussion Broth (BHIB) : Untuk menumbuhkan bakteri, untuk media transport(media transport lain yang dapat digunakan yaitu PIKE dan STUART), bisa digunakan untuk cek sensitivitas obat (metode dilusi) Sabourauds’s Glucose : Media untuk jamur Media gula-gula : air pepton, gula-gula. Digunakan untuk uji biokimia Cooked meat : Untuk menumbuhkan bakteri anaerob (selain itu untuk bakteri anaerob dapat digunakan media TIOGLIKOLAT )
BHIB Steril
Cooked Meat Laventhal
Loeffler
Nutrient Agar
Loewenstain
Miring
THIOGLIKOLAT
Media Padat : -
Nutrient Agar (NA) : Merupakan media sederhana Loewenstain : Media spesifik untuk M. tuberculose Loeffler : Media Spesifik untuk bakteri Corynebacterium diphteriae Leventhal : Media untuk mengetahui adanya sifat hemolitik atau tidak pada bakteri
-
-
BAP (blood agar plate) : untuk mengetahui adanya sifat hemolotik pada bakteri, diklasifikasikan ada 3 bakteri yaitu α (hemolisa sebagian, media msh berwarna merah), β (hemolisa total, media berwarna kekuningan karena telah dihemolisa oleh bakteri), γ (tidak tjd hemolisa, warna media tetap) Sabouraud Dextrose Agar (SDA) : Media untuk menanam jamur Mc Conkey (MC): Untuk menumbuhkan kuman enteric, bakteri pencernaan (misal : E.coli) EMB (Eosin Methylen Blue) : untuk menumbuhkan kuman enteric. EM B dan M c Conkey mengandun g laktosa dan in dicator un tuk mengetahui apakah bakteri mengadakan f erm entasi terhadap lakt osa atau ti dak
-
Triptone Yeast Cystine (TYC) : untuk menumbuhkan S. mutans ( Untuk mendapatkan ciri lebih terlihat).
STERILISASI
Terdapat 3 cara utama sterilisasi yang sering dipakai, filtrasi, penyaringan, fisik 1. Sterilisasi secara filtrasi : dengan mengunakan saringan berukuran sangat kecil sehingga bakteri akan tertahan pada saringan 2. Sterilisasi secara fisik : Ada 4 yaitu dengan api langsung (cocok untuk alat seperti pinset, ose dll) Panas kering (menggunakan oven, cocok untuk alat berbahan kaca
seperti tabung reaksi dll) Uap air panas ( sama dengan mengukus, tepat untuk bahan yang mengandung air) Uap air panas bertekanan ( menggunakan autoklaf) dengan penyinaran UV. 3. Secara Kimiawi, menggunakan senyawa desinfektan antara lain - Klorin (spectrum luas, menyebabkan korosi pada pH rendah, Mudah digunakan) - Iodin ( Stabil, mematikan bakteri, tidak aktif mematikan spora,non korosif mudah digunakan, mahal dan lambat) -Alkohol (umum digunakan, merusak bahan karet/plastic, cepat menguap) -Formaldehida (Bersifat karsinogenik, non korosif pada metal, invasi pada mata, kulit, pernapasan, spectrum luas) -Kalium Permanganat (tidak cocok untuk sterilisasi air, merubah rasa,warna ,bau) -Fenol(cukup kuat, stabil, tahan lama, toksik, men yebabkan iritasi) - Hidrogen Peroksida(antiseptic kuat, tidak mengiritasi,diaplikasikan sbg antiseptic mukosa mulut) -Garam Merkuri (antiseptic paling kuat, spectrum luas, aktifitas cepat, irritant) -Triclosan ( Spektrum luas, Toksisitas minim) ISOLASI BAKTERI Metode yang digunakan adalah sebagai berikut: Untuk bahan padat, seperti sputum plak, dilakukan swab lalu disuspensikan ke media cair. Contoh plak di swab dari mahasiswa cob a, disuspensikan ke media cair BHIB Sedangkan untuk bahan cair, seperti saliva/darah. Maka cairan ditampung terlebih dahulu, lalu ditanam pada media padat menggunakan ose. Contoh, saliva dikumpulkan, diambil dengan ose, ditanam pada media TYC Teknik penanaman pada media padat ada 3 yaitu Streak plate(streak plate dibagi 3 yaitu goresan sinambung (hanya satu bagian) Goresan T (dibagi 3 bagian) Goresan kuadran (dibagi 4 bagian) semuanya dilakukan zig-zag dengan arah yang berbeda) Pour Plate (kuman yang tersuspensi dalam media cair dituang ke media padat) Spread plate (kuman pada media cair, di tanam pada ose dengan di spreading) Selanjutnya bakteri yang telah ditanam diinkubasi 37 C selama 2x24jam. Setelah itu baru dapat diamati UJI BIOKIMIA 1. Uji indol ( menentukan kemampuan bakteri memecah as. Amino) 2. Uji Methyl Red ( menentukan mikro. Yg mampu mengoksidasi glukosa dengan menghasilkan asam, untuk membedakan E.coli dan Enterobacter aerogenes) 3. Uji Voges Proskauer ( membedakan bakteri usus)
4. 5. 6. 7. 8. 9.
Uji Sitrat ( Membedakan bakteri berdasar kemampuan fermentasi sitrat Uji TSIA (membedakan anggota enterobacteriae dari kelompok lain dari basil usus) Uji Oksidase ( menentukan bakteri dengan kemampuan sitrokrom oksidase Uji Katalase ( menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan H2O2 ) Uji Urease ( menentukan mikroo. Yang mampu menguraikan urea) Uji Reduksi Nitrat ( menentukan mikro. Yang dapat mereduksi nitrat)
PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI Untuk melakukan penghitungan, terdapat 3 syarat : 1. Jumlah koloni tiap cawan antara 30-300 bila tidak ada yang memenuhi , dipilih yang mendekati 2. Tidak ada koloni pada setengah luas cawan, dikenal sebagai spreader 3. Ketika jumlah bakteri setelah pengenceran lebih kecil dari nomer 2(spreader) maka hasilnya dirata2. Bila lebih besar, maka menggunakan hasil pengenceran sebelumnya. UJI SENSITIVITAS BAKTERI Terdapat 2 metode yaitu Metode Dilusi (pengence ran) atau difusi. A. Metode dilusi Disediakan beberapa tabung reaksi,tabung pertama berisi media cair dengan konsenstrasi obat yang akan diujikan. Tabung kedua diencerkan ½ dari tabung 1. Tabung 3 diencerkan ½ dari tabung,tiap tabung dimasukkan inoculum (kuman) sebanyak 1ml/0,1 ml. seterusnya hingga jumlah yang diperlukan. 2 tabung terakhir digunakan sebagai control positif ( adanya pertumbuhan bakteri) dan control negative( tanpa pertumbuhan). Setelah pengeceran selesai lalu diinkubasi 18-24 jam. Bila tampak keruh, bisa dicek dengan menanamnya di media padat, ada koloni ada pertumbuhan bakteri. Konsentrasi M.I.C dan M.B.C yang merupakan konsentrasi minimum obat yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. B. Metode difusi. Bakteri ditanam pada media padat (Mueller-Hinton). Setelah bakteri ditanam, disk yang berisi bahan obat dengan konsentrasi tertentu diletakkan pada media. Lalu diinkubasi. Hasilnya diklasifikasikan menjadi 2 zona yaitu radikal dan irradikal. Zona Radikal, adalah zona dimana disekitar disk tidak terdapat bakteri, potensi antibiotic diukur dengan mengukur zona ini. Zona Irradikal, zona dimana terdapat pertumbuhan bakteri yang terhambat, ditunjukkan dengan pertumbuhan yang kurang sehat dibanding dengan bakteri diluar zona pengaruh. C. Faktor Yang mempengaruhi
1. Kekeruhan : (+keruh diameter zone sempit)( – keruh diameter zone lebar) 2. Temperatur inkubasi : Temperatur tidak stabil, pertumbuhan bakteri tidak sesuai atau obat tidak bekerja dengan baik 3. Waktu inkubasi : min 18 jam agar bakteri tumbuh optimal 4. Ketebalan agar: Terlalu tebal, difusi lambat, terlalu tipis, difusi cepat 5. Jarak antar disk obat 6. Potensi disk obat 7. Komposisi media PEWARNAAN BAKTERI 1. Pewarnaan Sederhana Zat warna : Ungu Kristal, Biru Metilen, Safranin, Fukhsin Karbol, Hijau malachite Hasil : sesuai warna
Pengecatan dengan Air fuchsin, terlihat bentukan sel ragi dan sel batang
Pengecatan Sederhana, dengan bahan cat methylene blue, terlihat bentukan sel ragi (lebih besar dari coccus)
2. Pewarnaan Gram Reagen : - warna I : Karbol ungu Kristal - Mordan : lugol (fungsi : sebagai permerkuat ikatan kuman dgn cat -Peluntur : alcohol asetil 96 % Hasil : - Biru/biru ungu--- Bakteri gram + : streptokokus, bacillus, clostridium
-
Merah---- Gram (-) : Neisseria, salmonella, shigella
Pengecatan gram terlihat bentukan berwarna ungu, Gram +
Pengecatan gram terlihat bentukan coccus bergerombol, berwarna ungu Staphylococcus sp, Gram +
Pengecatan gram terlihat bentukan berwarna merah, Gram -
3. Pewarnaan Neisser Merupakan pewarnaan granula metakhromatik (selain itu ada LOEFFLER dan ALBERT), untuk melihat kuman diphtheria (corenia bacterium difteri) Zat warna : Neisser A, B,C Hasil : Kuman KUNING, Granula UNGU/COKLAT TUA Pewarnaan Neisser, Ungu merupakan granula, sedangkan kuning adalah kuman
4. Pewarnaan Loeffler Zat warna : biru metilen dari loeffler Hasil : Kuman biru muda, granula biru gelap 5. Pewarnaan Albert Zat warna : biru toluidine & Hijau malachite larutan yodium Hasil: kuma Hijau, granula hitam kebiruan
6. Pewarnaan Becker-Kranz Pengecatan khusus spirochaeta, dengan pengecatan sederhana maupun gram spirochaeta tidak terlihat. Sampel diambil dari plak, jadi tercampur dengan kuman lain. Prosedurnya, difiksasi dengan tuge ross, lalu dibilas air, k emudian dituangi tannine beite, dibilas, lalu di cat carbol gentian violet, sphirocaeta tercat ungu tua
Pengecatan becker-kranz. Spirochaeta tercat ungu tua
7. Pewarnaan Ziehl & Neelsen Pewarnaan khusus untuk mycobacterium & Nocardia Reagen : Warna I : Karbol Fuchsin Peluntur : Alkohol ; Warna II : Biru metilen Hasil : MERAH — bakteri tahan asam BIRU--- Bakteri Lain
8. Pewarnaan Schaeffer Fulton Reagen : Warna I : Malachit Green ; Warna II : Safranin Hasil : Spora HIJAU; bakteri MERAH
9. Pewarnaan Klein
Modifikasi pewarnaan tahan asam spora berwarna MERAH sedangkan bakteri BIRU PENGGOLONGAN DARAH 1. Sistem ABO MEnurut Landsteriner (1990) terdapat dua macam antigen d eterminan yaitu antigen A & B Antigen ini disebut aglutinogen. pada tubuh terdapat 2 antibodi alamiah yaitu anti A dan anti B yang mana keduanya disebut dengan aglutinin Penyebutan gol darah berdasarkan Penyebutan antigen. Gol darah A punya antigen A, gol b punya antigen B, gol ab punya antigen A&B, gol o tak pun ya antigen Penyebutan gol darah berdasarkan antibody, Gol darah A punya anti b, gol B punya anti a, gol AB tidak punya anti a maupun b, gol O, punya keduanya. 2. Sistem M,N M, MN,M merupakan penggolongan dari system, M,N. pada system ini gol darah tidak memiliki anti bodi sehingga antar gol bisa ditransfusikan tanpa menggump al. 3. Sistem Rhesus Rhesus + bila mengandung antigen rhesus Rhesus – Bila tidak mengandung antigen rhesus
