PRAKTIKUM VI PEWARNAAN MIKROBA
1. JUDUL PRAKTIKUM PEWARNAAN MIKROBA 2. TUJUAN PRAKTIKUM Mengetahui berbagai mekanisme pewarnaan serta untuk mengamati morfologi beberapa mikroba. 3. LANDASAN TEORI Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk
basil
pembagiannya
yaitu
basil
tunggal,
diplobasil,
dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Setiap mikroba memiliki sifat tertentu yang terdapat pada protoplasma. proses atau reaksi mikroba terhadap pewarnaan berdasarkan pada permeabilitas dinding sel mikroba. Cara pewarnaan untuk tiap bagian tubuh mikroba berbeda-beda. Pewarnaan mikroba dapat dibagi atas beberapa kelompok: 1. Pewarnaan sederhana, yaitu hanya memakai satu macam zat warna saja. Misalnya Methylen blue, air fuschin 2. Pewarnaan differensial : yaitu menggunakan lebih dari satu macam zat warna yang memiliki afinitas berbeda, mialnya pewarnaan Gram 3. Pewarnaan istimewa
Pewarnaan pada mikroba yang sulit diwarnai dengan pewarnaan Gram atau pewarnaan sederhana karena sel mikroba (bakteri tahan asam) diselubungi oleh suatu bahan seperti lilin (lipid). Pewarnaan yang demikian disebut “acid fast staining”, misalnya pewarnaan Ziehl Neelsen 4. Pewarnaan khusus, yaitu pewarnaan tertentu, misalnya spora, kapsul, diphteri, dll. Pewarnaan Spora Jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong dalam genus Bacillus dan Clostridium membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas yang disebut spora/endospora. Endospora dapat hidup dalam keadaan kurang nutrisi, tahan terhadap panas serta unsure-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta terhadap bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk spora. Spora merupakan bentuk pertahanan dari bakteri terhadap keadaan yang merugikan untuk hidupnya, tetapi apabila keadaan sekelilingnya membaik spora berubah lagi menjadi bentuk vegetative. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dank eras. Spora diliputi oleh membran yang mempunyai sifat tidak mudah ditembus oleh bahan cat. Sifat endospora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar. Dengan hal tersebut, zat warna fuchsin dapat masuk. Jika dilakukan pencucian, pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri berwarna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Ukuran dan letak spora di dalam sel merupakan karakteristik yang digunakan untuk membedakan spesies bakteri yang membentuknya. Bakteri pembentuk spora dapat terletak di sentral (tengah), terminal (ujung), dan subtermal (di antara sentral dan terminal). 4. PROSEDUR KERJA Pewarnaan Spora A. Pewarnaan Klein Bahan Pewarna 1: Carbol Fuchsine, peluntur: H2SO4 1%
Bahan Pewarna 2: Air methylen biru, air Cara Kerja: 1. Membuat suspensi bakteri sebagai berikut: 1cc air garamphysiologis (pZ) diambil, kemudian kultur bakteri yang akan diperiksa dilarutkan, lalu suspensi bakteri diambil sebanyak 1cc dicampur dengan 1cc bahan cat carbol fuchsine, kemudian dipanaskan selama 6 menit. 2. Beberapa tetes dari larutan tersebut diambil dan diletakkan pada gelas obyek yang sudah bersih, kemudian dikeringkan dan difixer dengan api. 3. Dikeringkan dengan larutan H2SO4 1 % selama 2-3 detik, lalu dibilas dengan air. 4. Dicat dengan air methylen biru selama 4 menit, lalu dikeringkan. Spora akan tampak berwana merah dan bentuk vegetative terlihat berwarna biru. Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru. B. Pewarnaan Schaeffer Fulton Bahan: cairan atau padatan (koloni) Alat: Ose, obyek glass, deg glass, lampu spiritus, mikroskop Reagent: 1. Malachiet green 5% - Malachiet green 5 gram - Aquades 100 ml 2. H2SO4 1% - H2SO4 pekat 1 ml - Aquades 100 ml 3. Safranin 0,5% - Safranin 0,5 gram - Alkohol 96% 10 ml
- Aquades 90 ml Cara Kerja : 1. Dibuat suspensi bakteri dengan NaCl fisiologis sebanyak 1 ml. 2. Ditambahkan malachiet green 1 ml. 3. Dipanaskan di atas lampu spiritus selama 6 menit. 4. Sediaan dari suspensi tersebut lalu difiksasi. 5. Sediaan ditetesi dengan H2SO4 1 % selama 2-3 detik. 6. Dicuci dengan air pelan-pelan. 7. Ditetesi dengan larutan safranin 0,5%, dibiarkan selama 4 menit. 8. Dicuci dengan air pelan-pelan dan dikeringkan. 9. Setelah kering ditetesi dengan oil emersi. 10. Diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Hasil pewarnaan: spora berwarna hijau, bakteri berwarna merah. Pewarnaan Becker & Kranz Bahan : bahan diambil langsung dari material alba atau plak gigi. Cara kerja : Bahan yang diambil digoreskan di atas gelas obyek, tuangkan di atasnya bahan fiksasi dari Ruge-Ross 2x1⁄2 menit. Sediaan dicuci dengan air, kemudian dituangkan tannine beite selama 1 menit sambil dipanasi, lalu dicuci kembali dengan air. Pemanasan dimaksudkan untuk memudahkan Spirochaeta menyerap bahan cat. Dilakukan pengecatan dengan Carbol Gentian Violet selama 2 menit, lalu dipanasi sampai menguap 1x. Dicuci dengan air dan dikeringkan, Spirochaeta akan tercat ungu tua. Terlihat : 1. Bentuk batang langsing runcing warna ungu.
2. Bentuk batang tebal panjang warna ungu. 3. Bentuk batang berlenggok warna ungu. 4. Bentuk batang koma warna ungu. Diagnosa sementara : 1. Fusiform fusiformis 2. Leptothrix buccalis 3. Spirochaeta 4. Vibrio air 5. PEMBAHASAN 1. Pewarnaan Klein Pewarnaan klein adalah pewarnaan khusus yang digunakan untuk mewarnai spora bakteri (endospora), karena endospora tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan. Untuk pewarnaan endospora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau
bisa masuk ke dalam spora. Pada praktikum yang telah kami lakukan
menggunakan bahan kultur murni, setelah dilihat menggunakan mikroskop tampak bentuk batang warna biru, bentuk oval warna merah dan bentuk batang warna biru dengan rongga di dalamnya warna merah. Diagnosa sementara kuman pembentuk spora dalam bentuk vegetatif, spora bebas, dalam pembentukan spora.
2. Pewarnaan Schaeffer fulton Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, pada kelompok kami endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Pada kelompok kami didapatkan hasil seperti ini :
spora berwarna hijau bakteri berwarna merah 3. Pewarnaan Becker and Kranz Pewarnaan metode becker and kranz ini merupakan salah satu dari pewarnaan khusus, yang di lakukan untuk mengetahui bagian – bagian kuman yang sukar bila menggunakan pewarnaan biasa. Terutama untuk mengetahui spirocaetha yang pada kelompok kami di ambil dari plak gigi. Pada praktikum kami plak gigi yang di ambil di goreskan di atas gelas obyek, kemudian kami tuangkan bahan fiksasi dari Ruge - Rose kurang lebih 2 menit 30 detik. Kemudian sediaan di cuci dengan air dan sediaan di tuangi Tannine Beite selama 1 menit sambil di panaskan, tujuan dari pemansan ini ialah untuk memudahkan spirochaeta menyerap bahan cat. Sedian di cuci kembali dan cat dengan Carbol Gentian Violet selama 2 menit, lalu di sedian di panaskan sampai menguap, dan di cuci lalu sediaan di keringkan. Dengan teknik ini spirochaeta akan tercat ungu tua.
Pada praktikum kelompok kami di dapatkan hasilseperti gambar di atas yang terdiri dari : 1. Bentukan batang langsing berwarna ungu 2. Bentukan batang tebal berwarna ungu 3. Bentukan batang berkelok / spiral berwarna ungu 4. Bentukan batang koma warna ungu
