LA PRUEBA DE KASTLE MEYER. Por Carlos Zagala.
Para observaciones, sugerencias y críticas contáctenos en www.tiendaforense.com.ve I. Historia y Notas. Se atribuye a Louis-Jacques Thenard (1777-1857) y Christian Freidrich Schonbein (1799-1868) los primeros pasos científicos hacia un ensayo confiable que permitiera detectar la presencia de sangre1 . Thenard descubrió el peróxido de hidrógeno en 1818, y Schonbein describió la primera primer a prueba de orientación en 1863. Esta prueba se basaba en el hecho de que la peroxidasa 2 , al contacto con la hemoglobina, generaba la oxidación del peróxido de hidrógeno. La mezcla del peróxido de hidrógeno y la hemoglobina resultaba en un burbujeo o reacción de efervescencia debido al desprendimiento de burbujas de oxígeno. Empíricamente, es posible apreciar dicha reacción cuando se limpia una herida sanguinolenta con peróxido de hidrógeno. Shonbein describió que si la sustancia desconocida tratada con peroxido de hidrógeno despedía burbujas, era probable que contuviese hemoglobina, ergo era factible que se tratase de sangre. A principios del siglo XX, el Dr. Joseph H. Kastle (1864-1916) desarrolló una prueba cualitativa para hemoglobina mediante el uso de la fenolftaleína como indicador de color. Un poco después, el Dr. Julius Lothar Meyer (1830-1895) mejoró dicha prueba después de muchos estudios, es por eso que dicha pericia tomó el nombre de prueba de Kastle-Meyer. Hoy en día, se la conoce también como prueba del guayacol.
II. Ventajas y Limitaciones. Para hablar de las ventajas y limitaciones de la prueba de fenolftaleína, es importante tener en cuenta dos nociones cruciales para la química forense: sensibilidad y especificidad . La Sensibilidad se refiere al factor de dilución de una sustancia (en este caso sangre) que puede ser detectada por el reactivo. La sensibilidad de la prueba de Kastle Meyer es de aproximadamente una parte en diez mil; 1:10.000. Esto significa que si se agrega a una gota de sangre diez mil gotas de agua todavía podría ser detectada por el peritaje. La especificidad, en cambio, se refiere a cuantas sustancias, distintas a la sangre podrían arrojar también un resultado positivo al someterse a la prueba. Esta descrito que sólo la hemoglobina genera un resultado positivo al aplicar esta pericia. Empero, la literatura sugiere que los falsos positivos podrían ocurrir en presencia de elementos químicos oxidantes y que las peroxidasas de origen vegetal reaccionen también en forma idéntica; conviene destacar que estos falsos positivos suceden sólo DESPUES de aplicar la fenolftaleína y ANTES de agregar el peróxido de hidrógeno. Una prueba POSITIVA es perceptible por el desarrollo de un color rojo oscuro a los pocos segundos de aplicarse el peróxido de hidrógeno. Puede decirse entonces que la prueba de Kastle Meyer es altamente específica para la sangre. 1
Hoy por hoy, la detección de la sangre tiene ti ene más importancia que nunca, con el desarrollo de las pruebas de ADN es posible determinar la vinculación de la misma a una persona en particular con precisión de uno en billones. 2 Se llama peroxidasas a las enzimas halladas especialmente en células vegetales que catalizan la oxidación de una sustancia.
En general, los reactivos vienen en botellas color ámbar, estas tienen la ventaja de proteger los químicos de la luz solar, la cual podría acortar su vida útil.
III. Químicos Necesarios para el Peritaje. En general, los químicos contenidos en un kit para la prueba de Kastle Meyer son:
1.) Muestra de Control: se trata de un pequeño trozo de papel de filtro o tela impregnada con sangre seca de origen animal. Se usa sangre animal para evitar la posibilidad de transmisión de enfermedades. El kit contiene pues, una muestra que sabemos es sangre con 100% de seguridad. Esto nos permitirá probar los reactivos en la propia escena del suceso o en el laboratorio antes de aplicar la pericia a las sustancias sospechosas que encontremos. Este debe ser un primer paso obligado ya los químicos podrían estar vencidos o contaminados. La fenolftaleína, por ejemplo, es un reactivo muy sensible y puede oxidarse con facilidad si dejamos la tapa de los frascos mal cerradas. También, es posible que los reactivos se contaminen luego de varias pruebas si dejamos que las puntas de los goteros toquen las muestras, hisopos, superficies, papel de filtro, etc. debemos preferir el agua destilada en viales o frasco con gotero, esto permite que este libre de contaminación hasta la última gota. 2.) Materiales para Técnica de Contacto: esta técnica consiste consiste en tocar la mancha sospechosa con un hisopo o aplicador con punta de algodón 3 , cotonete, papel de filtro etc., para luego aplicar sobre ellos los químicos del kit. Cuando se necesita tomar muestras de espacios realmente pequeños puede usarse también hilo de algodón. De esta forma se transfiere la sustancia sospechosa al material estéril (hisopo, papel de filtro, etc.) y es sobre este, no sobre la mancha, en donde se aplican los reactivos. Por esta razón se dice que la prueba de la fenolftaleína es una prueba indirecta. En la foto de abajo se aprecian los aplicadores con punta de algodón, utensilios indispensables en el kit de un investigador. Se pueden usar también para recolectar sustancias sospechosas, no sólo sangre, semen, saliva, también sustancias químicas. Deben usarse los que tienen mango de madera y no los usados para la higiene de los oídos.
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Nos hemos referido a esta técnica en el trabajo de nuestra autoría “Comentarios sobre la Detección de Manchas Seminales”. En principio, es menester determinar si la mancha sospechosa esta seca o aún húmeda. Es más fácil recolectarla mientras esté húmeda pues el hisopo o papel de filtro se impregna con facilidad. En el caso de estar seca, será necesario humedecer el material de transferencia con una o dos gotas de agua destilada.
Arriba, hisopos o también llamados aplicadores con punta de algodón, artículos indispensables a la hora de recolectar fluidos bioló gicos.
3.) Reactivos: Hay tres reactivos incluidos en el kit, estos son: a. Alcohol: Metil o Etil alcohol, o lo que es lo mismo, etanol. Este se usa para incrementar la sensibilidad de la prueba. Esto se logra al limpiar el área alrededor de la mancha y exponer mejor la hemoglobina 4 . b. Fenolftaleína: se trata de un químico en polvo que se prepara en una solución de etanol que actúa como indicadora de color. Al prepararse, la solución se hierve por varias horas para eliminar el oxígeno disuelto en ella. Este químico es muy sensible y se ve como un líquido incoloro. Al exponerse al oxígeno, cambia de color a un rosado profundo. Es por eso que debemos mantenerlo con una tapa bien segura, sin exponerlo al aire ambiental. c. Peróxido de Hidrógeno: Es, esencialmente, agua con un átomo extra de oxígeno. Normalmente se lo usa como antiséptico y sirve como un oxidante en esta prueba.
4.) Agua Destilada o Desinonizada: No es un reactivo. Es, básicamente, agua libre de impurezas, sales, contaminantes, etc. Es de gran utilidad para transferir las sustancias que vayan a peritarse al papel de filtro, hisopo, cotonete, etc. La mejor forma de recolectar una mancha seca de sangre, la que ha formado una costra, o si ha sido limpiada o esta muy diluida, es usando unas gotas de agua destilada sobre el hisopo. El agua destilada tiene además la ventaja de no interferir en la pericia pues es pura, así que no se corre el riesgo de que alguna
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La hemoglobina encerrada exclusivamente en los glóbulos rojos es una proteína que contiene el grupo “hemo” (formado por moléculas de hierro que enlazan el oxígeno en los pulmones o en los bronquios y la liberan por el resto del cuerpo). También transporta productos residuales como el dióxido de carbono, la mayoría del cual se encuentra disuelto en el plasma sanguíneo. Los niveles normales de hemoglobina están entre los 12,5 y 17 gramos por litro y es proporcional al número de hematíes. Constituye el 90% de los eritrocitos y es la que les proporciona su color característico, rojo, aunque esto sólo se da cuando el glóbulo rojo está cargado de oxígeno. Cuando un eritrocito esté cargado de dióxido de carbono, será azul.
sustancia extraña genere un falso positivo. También, esta claro que permite mantener la muestra sin degradarse por acción bacteriana por más tiempo.
Arriba, kit para prueba de Kastle M eyer o fenolftaleína. Abajo, a la izquierda, se observa la muestra de control.
La mejor forma de recolectar una sustancia sospechosa es agregando agregando do s o tres gotas de agua destilada al aplicador.
IV. Procedimiento. La prueba de Kastle Meyer debería intentarse luego de un examen exhaustivo del escenario de los hechos, una vez preservadas e historificadas todas las evidencias de interés que encontremos. Podría ocurrir que detectemos manchas sospechosas o tengamos razones para creer que hay restos hemáticos en el sitio que hayan sido limpiados o diluidos por acción dolosa o natural. Tenga siempre presente que debemos evitar la contaminación a toda cosa. USE SIEMPRE GUANTES DE LÁTEX Y PROTECCIÓN EN BOCA Y NARIZ. Procure no dejar que las puntas de los goteros y los hisopos se toquen. Evite también intercambiar las tapas de los reactivos y use siempre un hisopo nuevo para cada prueba. Jamás aplique los reactivos directamente sobre la evidencia. La prueba debe comenzar verificando los reactivos. Para esto se usa la muestra de control incluida en el kit. Se toma un hisopo y se le aplican dos o tres gotas de agua destilada. Se pone el hisopo en contacto con la muestra de control girando el hisopo sobre si mismo. Acto seguido se aplica una o dos gotas de cada reactivo en el orden siguiente:
1.) Alcohol: Aplique una o dos gotas sobre el hisopo. 2.) Fenolftaleína 5 : Aplique una o dos gotas sobre el hisopo. En este punto, Usted debería hacer una pausa de unos segundos y verificar si la punta del hisopo comienza a cambiar a color rosado. Esto no debería ocurrir cuando se hace una prueba usando la muestra de control pero, de ocurrir, estaremos en presencia de un FALSO POSITIVO Y NO DEBERIAMOS CONTINUAR CON LA PERICIA. Esto significa, prima facie, que algún contaminante esta interfiriendo con la prueba. Si no hay ningún cambio de color continúe con el último paso, esto es:
3.) Peróxido de Hidrógeno: Aplique una o dos gotas sobre el hisopo. Si la prueba es positiva veremos un cambio de color casi inmediato a color ROSADO. La prueba de control preliminar debe hacerse sólo una vez antes de comenzar una serie de pruebas. Una vez hecha, practique la prueba tantas veces como sea necesario en la forma descrita.
Arriba, frascos de plástico con gotero, la mejor forma de llevar los químicos. Asegúrese de que tengan etiquetas apropiadas e indique los reactivos, además, con tapas de distintos colores.
V. Interpretación de los Resultados. Las pruebas de orientación (cualitativas) pueden arrojar resultados bastante confiables sobre la detección de sangre pero no puede asegurarse con 100% de seguridad que esta este presente. Sólo las pruebas confirmatorias serán definitivas. El cuadro sinóptico de este artículo describe una variedad de reacciones posibles al aplicar esta pericia y las interpretaciones apropiadas que deberíamos hacer.
VI. Nota Importante. Aplicados que sean los reactivos, no debemos esperar más de 30 segundos para apreciar los resultados. Esto se debe a que después de ese tiempo la fenolftaleína 5
La fenolftaleína es un ácido débil que pierde cationes H+ en solución. La molécula de fenolftaleína es incolora, en cambio el anión derivado de la fenolftaleína es de color rosa. Cuando se agrega una base la fenolftaleína (siendo esta inicialmente incolora) pierde H+ formándose el anión y haciendo que tome coloración rosa. Se puede decir que qu e la solución de fenolftaleína esta “hambrienta” de oxígeno.
podría comenzar a reaccionar con el oxígeno del ambiente y tornarse rosada a pesar de no estar presente la sangre.
VIRA A ROSADO. Luego de aplicar la Fenolftaleína.
RESULTADO Falso Positivo
Luego de aplicar el Peróxido Positivo de Hidrógeno. Nunca Negativo
Falso negativo
INTERPRETACIÓN La reacción no ocurrió como resultado de la presencia de sangre. Indica presencia de sangre. No indica presencia de sangre (podría no estar presente)
La sangre podría estar presente pero esta demasiado diluida para reaccionar.
Desafortunadamente, en Venezuela el agua destilada sólo esta disponible en ampollas o bid ones, pero no en frasco con go tero. El dosificador en la punta permite tener un a cantidad mayor a la disposición y asegurar que este libre de contaminación h asta la última gota. Además, es más fácil aplicarla sobre el hisopo o medio d e transferencia apretando el frasco. Es mejor que este sea transparente pues perm ite apreciar si tiene impurezas.
VII. La Identificación de Fluidos Biológicos en el Proceso Venezolano. Debemos decir, sin temor a equivocarnos, que la detección de campo de rastros hemáticos y otros fluidos biológicos ha sido dejada a un lado por los cuerpos policiales venezolanos, salvo en casos de trascendencia nacional 6 . Esto se debe, según claman 6
En estos, incluso se llegan a practicar pruebas de reacción en cadena de polimerasa para determinar el perfil genético del sospechoso.
algunos, al limitado presupuesto que manejan los cuerpos de seguridad del estado. En nuestra humilde opinión, semejante realidad se debe más a la profunda ignorancia que hemos padecido de un tiempo a esta parte todos los que en algo contribuimos con la administración de justicia. Luego de analizar cientos de expedientes sustanciados con ocasión de la comisión de diversos delitos, hemos comprobado que son comunes las afirmaciones como “encontramos una mancha marrón rojiza consistente con sangre”. Pensamos que menciones como esta en un acta polici policial, luego de la inspección técnica, no le hacen favor alguno a la verdad y la justicia 7 . Con un poco de información y dedicación es posible, sin quebrar el presupuesto del que se dispone, practicar una prueba cualitativa colorimétrica (también en el caso de sustancias de abuso) que si bien no es 100% concluyente podría arrojar luz sobre importantes aspectos materiales vinculados al delito. Recientemente, como respuesta a este problema, la Tienda Forense de Venezuela junto con la empresa Sumelab C.A., han puesto al alcance del investigador el kit Hemastrip, el cual contiene todos los utensilios necesarios para la práctica de una prueba de orientación en el caso de la sangre. Cada peritaje cuesta apenas medio dólar americano (pueden hacerse hasta cien con un solo kit), luego es falso que se trate de una tecnología inasequible en términos de precio. Se trata del primer kit de su tipo en nuestro país, diseñado pensando especialmente en las necesidades de un patrullero, pesquisa, perito judicial, criminalista, detective privado, etc.
El hemastrip dispone, además, de una muestra de control que consiste en un cotonete redondo impregnado en sangre de vacuno. Esto permite probar el papel reactivo antes de proceder a la pericia propiamente dicha. Igualmente, trae una provisión suficiente de agua deionizada para empapar cien o más aplicadores, pastilleros, escalpelo desechable, pinzas, mascarilla, lentes protectores, etc. Esta pericia es tan sensible que puede detectar trazas de sangre invisibles al ojo desnudo . También, creemos que dejar el monopolio de las pruebas, aunque de orientación, únicamente al CICPC, órgano encargado de la investigación criminalística en nuestro país ya ha hecho bastante daño a la justicia. Esta 7
Al revisar un expediente penal promedio, saltará a la vista que el 90% o más de las pruebas que el Ministerio Público pretende llevar al juicio y que menciona en la acusación consisten, sustancialmente, en pruebas testimoniales.
realidad debería ir cambiando de suerte que policías, militares y civiles, en conjunto, trabajen en mejor sinergia. No vemos nada en las leyes venezolanas que obste a que sea un detective privado, un policía municipal, un experto civil designado por el juez, etc., quien practique peritajes como los descritos en este artículo. Aún más, existen otras pruebas disponibles hoy en día para la identificación preliminar de fluidos biológicos además de la sangre, nos referimos al semen y a la orina. Estas pruebas, al igual que el hemastrip, no requieren de conocimientos profundos, pueden ser practicadas por personas con un entrenamiento básico y son bastante fiables. Finalmente, somos de la opinión de que la peor prueba es la que no se realiza, la que nunca llega al conocimiento del Tribunal y la peor sentencia la que termina por condenar o absolver valiéndose sólo de una parte de las pruebas asequibles.
Arriba, prueba presuntiva para la detección de campo de orina (urea). La caja trae diez pruebas. El mecanismo de aplicación de esta pericia es similar a otras para la detección de sangre. Simplemente, se toma la muestra de la sustancia sospechosa con un aplicador y se coloca dentro de la bolsa rompiendo el mango de madera. Hecho esto, se rompen las ampollas que están adentro, estas traen los químicos necesarios premezclados. La presencia de urea se indica con un color azulado.
EL AUTOR AUTORIZA EL USO DE ESTE MATERIAL ÚNICAMENTE CON FINES PEDAGÓGICOS O ACADÉMICOS.
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