PROTOCOLO DE VALIDACION DE PRUEBA DE APTITUD PARA ENSAYOS DE ESTERILIDAD. 1. OBJETIVO 2. ALCANCE 3. RESPONSABILIDADES 4. EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR 5. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN 6. CONCLUSIONES 7. RECOMENDACIONES
1.
OBJETIVO:
Demostrar mediante evidencia documentada que la metodología para evaluar la esterilidad de los geles y ungüentos, está totalmente bajo control y proporciona de forma consistente y reproducible resultados que cumplen las especificaciones establecidas.
2.
ALCANCE: Este protocolo se utilizará para la validación de pruebas de aptitud para ensayos de esterilidad en geles oftálmicos, así también en ungüentos oftálmicos
3.
RESPONSABILIDAD: 3.1. Analista de Microbiología, es responsable de Diseñar, planificar, desarrollar, registrar datos y de preparar el reporte de validación, adjuntando toda la documentación pertinente. 3.2. Jefe de Control de Calidad, es responsable de vigilar la correcta ejecución de la validación 3.3. Jefe de Validaciones, es el responsable de mantener vigente la calificación de los equipos y calibración de los instrumentos de medición utilizados en la validación. 3.4. Jefe de Aseguramiento de la Calidad es el encargado de la coordinación de las actividades que genere la validación, así como de colaborar en la revisión de la documentación propia del proceso de validación. 3.5. El Director Técnico es responsable de la aprobación del Reporte Final de la Validación y de darlo a conocer a los involucrados.
4.
EQUIPOS Y MATERIALES A UTILIZAR 4.1. Equipos NOMBRE
MARCA
CÓDIGO
FECHA CALIBRACIÓN
MARCA
CÓDIGO
FECHA CALIBRACIÓN
Cabina de bioseguridad Balanza de precisión Estufa de Incubación 30-35°C Autoclave Refrigeradora de 2-8°C Espectrofotómetro
4.2. Materiales de vidrio y accesorios NOMBRE Frascos x 100 mL con tapa Frasco x 250 Ml con tapa Pipeteador variable (1-10mL) Placa Petri descartable 90x15mm
4.3. Material de referencia, producto y activos NOMBRE
MARCA
LOTE
FECHA VENCIMIENTO
Clostridium sporogenes ATCC 19404 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacillus subtilis ATCC 6633 Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 Candida albicans ATCC 10231
4.4. Medios de Cultivo, reactivos y excipientes NOMBRE Agar CASO Agar Sabouraud Polisorbato 80
MARCA
LOTE
FECHA VENCIMIENTO
5.
METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN: 5.1. Consideraciones Generales Los medios a usar deben haber pasado por un proceso de esterilización y luego debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios. Analizar cada lote de medio a usar, según procedimiento PROMOCION DE CRECIMIENTO Y CONTROL NEGATIVO DE MEDIOS DE CULTIVO 5.2. Referencias:
USP 39. Pruebas Microbiologicas / <11> Pruebas de Esterilidad. Pag. 146-153.
5.3. Preparación de la suspensión microbiana 5.3.1.Usar microorganismo subcultivados de cepas de referencia. Los microorganismos de prueba deben corresponder a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original, y formar parte de un cultivo de crecimiento reciente. Cultivar por separado cada cepa bacteriana y fúngica de prueba (ver la Tabla N°1). Tabla N°1: Cepas de Microorganismos de prueba adecuados para usar en la Prueba de Aptitud del Método
5.3.2.Cultivar las bacterias aerobias en Agar CASO, e incubar de 30°-35°C x 18-24 horas. 5.3.3.Cultivar Clostridium sporogenes, en condiciones anaeróbicas en Agar CASO a una temperatura de 30°-35º C durante un período de 24 a 48 horas. 5.3.4.Cultivar C. albicans y A. brasiliensis en Agar Sabouraud Dextroxa a una temperatura de 20°-25°C durante un periodo de 2-3 días para C. albicans, y 5-7 días para A. niger. 5.3.5.Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solución salina SR estéril que contenga 0,05% de polisorbato 80. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura entre 2ºC y 8ºC. 5.3.6.Para obtener un inóculo de aproximadamente 100 ufc, diluya la suspensión microbiana con solución salina hasta obtener una transmitancia de aproximadamente 30% a una longitud de onda de 580nm. Obtenida esta transmitancia realice diluciones seriadas agragando 1 mL de inoculo en 9 mL de solución salina, repetir hasta obtener 10 -5 de la solución original. A cada medio inoculará 100 uL de la solución 10 -5, así obtendrá aproximadamente 100 ufc. 5.3.7.Verificar la carga microbiana inoculando 100 uL de la dilución 10 -5 del microorganismo evaluado en 2 placas estériles, luego agregar de 15-20 mL de medio licuados previamente y mantenidos a 45 °C. Para bacterias usa Agar CASO, y para hongos y levaduras usar Agar Sabouraud. Incubar por el tiempo y temperatura según lo indicado en los puntos 5.3.2 al 5.3.4 5.4. Prueba de Aptitud del Método:
5.4.1.En Geles por Inoculación directa 5.4.1.1. Transferir directamente 10 g aproximadamente del producto a examinar en 90 mL de Caldo CASO y 90 mL de Caldo Tioglicolato ambos al 1% de Polisorbato 80. 5.4.2.En Ungüentos por Inoculación directa: 5.4.2.1. Agregar aproximadamente 5 g de producto en 100 mL de Agua al 0,1% de peptona y 1% de Polisorbato 80, mantenida a 40°C aproximadamente. Agitar para lograr la emulsión del producto. 5.4.2.2. Transferir aproximadamente 50 mL de producto diluido a 50 mL de Caldo CASO y los restantes 500 mL de producto diluido a 50 mL de Caldo Tioglicolato, ambos medios preparados a doble concentración. 5.4.3.En Ungüentos por Filtración por Membrana: 5.4.3.1. Agregar 4 g de ungüento en 400 mL de Miristato de Isopropilo calentado a no más de 44°C. Agitar hasta lograr la emulsión. 5.4.3.2. Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 μm, y de aproximadamente 47 mm de di ámetro. Filtrar 100 mL de Solución de peptona al 1% atemperada a 40 °C, 5.4.3.3. inmediatamente filtrar la emulsión de producto en miristato. Luego de filtrado el producto, lavar la membrana filtrando 2 veces 100 mL de solución de peptona al 1% con 1% de polisorbato 80. 5.4.3.4. Cortar asépticamente la membrana en dos partes iguales y transferir cada mitad a tubos conteniendo 30 mL de caldo CASO y 30 mL de Caldo Tioglicolato. 5.4.4. Agregar al medio un inóculo de un número pequeño de microorganismos viables (no más de 100 ufc). Al caldo Tioglicolato inocular: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus . Al caldo CASO inocular: Aspergillus brasilíensis, Bacillus subtílis y Candida albicans . Considerar la inoculación por separado de cada uno de los microorganismos indicados. 5.4.5.Realizar controles positivos del medio inoculando microorganismo de prueba pero sin agregar producto. 5.4.6.Realizar controles negativos de cada medio (medio sin inóculo ni producto agregado). 5.4.7.Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no más de 5 días. Incubar Caldo Tioglicolato 30°-35°C y el caldo CASO a 22,5 ± 2,5ºC. 5.4.8.Interpretación de resultados: Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones. Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba de Aptitud del Método. Esta prueba de aptitud del método se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del método podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.
5.4.9.Criterio de aceptación: Recuperación de los microorganismos inoculados en presencia de producto, 5.4.9.1. manifestada por la turbidez 5.4.9.2. Ausencia de crecimiento en los controles negativos Presencia de crecimiento en los controles positivos 5.4.9.3.
