Prinsip kerja spektrofotometer UV-VIS didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Cahaya dari sumber cahaya diuraikan oleh monokromator, kemudian cahaya monokromator dilewatkan pada sampel. Cahaya ini sebagian diserap oleh sampel dan sebagian lagi dilewatkan yang kemudian ditangkap oleh detektor yang diubah menjadi sinyal-sinyal listrik yang kemudian diterjemahkan oleh alat pengukur dan kemudian ditampilkan dengan kuantitasnya.
Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh gugus fungsi kromofor dan ausokrom terhadap panjang gelombang maksimum dan membandingkan puncak serapan maksimum benzene dengan senyawa aromatic lainnya. Senyawa aromatic yang digunakan dalam praktikum ini yaitu aniline, nitrobenzene, dan fenol. Gugus kromofor adalah gugus yang menyebabkan molekul menjadi berwarna dan gugus memberi daya ikat terhadap serat yang diwarnainya. Molekul zat warna merupakan gabungan dari zat organic yang tidak jenih, kromofor sebagai pembawa warna dan ausokrom sebagai pengikat antara warna dan serat. Ausokrom merupakan gugus yang dapat meningkatkan daya kerja kromofor, sebagai optimal dalam pengikatan. Ausokrom terdiri dari golongan yang salah satunya –NH2, sedangkan golongan anionnya yaitu salah satunya –OH. Ausokrom juga merupakan radikal yang memudahkan terjadinya pelarutan –COOH atau SO3H, dapat juga berupa kelompok – NH2 atau –OH (www.che-ist-ry.org). Anilin, nitrobenzene, dan fenol ditambahkan dengan etanol, sehingga terbentuk gugus ausokrom dankromofornya. Fenol dan aniline setelah ditambahkan etanol, menghasilkan larutan berwarna merah, dan nitrobenzene setelah ditambahkan etanol, menjadi larutan berwarna hijau. Konsebtrasi larutan berwarna diukur dengan melihat absorbansi planar. Pada daerah tampak konsentrasi dapat ditentukan dengan 3 teknik, yaitu kolonmeter atau kalorimetri visual, fotometri, dan spektrofotometer. Pada praktikum, digunakan teknik ketiga. Teknik spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur absorbansi dalam daerah tampak dan ultraviolet. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang ditransmisikan atau yang diabsorppsi (Khopkar. 2008:214-225). Panjang gelombang cahaya UV dan tampak jauh lebih pendek daripada panjang gelombang radiasi inframerah. Pada UV-VIS, sample simasukkan ke kuvet dan pada hasilnya didapatkan transmitan, absorben, dan panjang gelombangnya. Ontuk aniline, fenol, nitrobenzene, dan benzene masing-masing didapatkna untuk absorbannya 28,5%, 32%, 125% dan 125%. Sedangkan untuk panjang gelombangnya dipakai yang sama yaitu 563nm. Baik radiasi UV maupun radiasi cahaya tampak berenergi lebih tinggi daripada radiasi inframerah. Absorpsi cahaya UV atau cahaya tampak mengakibatkan transisi-elektronik, yaitu promosi electron-elekron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaaan tereksitasi berenergi lebih tinggi.Panjang gelombang cahaya UV atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi electron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi electron akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya pada dalam daerah tampak (yakni senyawa berwarna) mempunyai electron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap panjang gelombang UV yang lebih pendek. Pada hasil didapatkan absorban yang berbeda-beda. Absorban suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan banyaknya molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergnatung pada struktur elektronik senyawa dan juga kepekatan sample dan sel sample. Benzena dan senyawa aromatic lain memperagakan spectrum yang lebih kompleks daripada yang diterangkan oleh transisi τ -τ*. Komponen itu disebabkan oleh adanya beberapa keadaan eksitasi rendah. Benzena menyerapdengan kuat pada 184nm dan pada 27nm dan mempunyai sederet pita absorpsi antara 230-270 nm. Absorpsi radiasi UV oleh senyawa aromatic yang terdiri cincin benzene terpadu bergeser ke oanjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambahnya cincin (Fessenden. 1986 :442).
