Biologia UNJBG-2016
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I. INTRODUCCIÓN En general, las células son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exámenes se realizan en preparados en fresco. Por eso para distinguirlos del medio es necesario hacer una coloración (tinciones simples) o utilizando microscopios especiales como el de contraste de fases, la mezcla de tinciones simples también sirve para contrastar o realzar distintas características morfológicas o estructurales de las células (tinciones diferenciales). Los preparados en fresco o en seco, son métodos de análisis que nos van a permitir, gracias al microscopio y otras herramientas de laboratorio, la visualización de una complejidad de elementos que a simple vista no son captados por el ojo humano. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más usados en microbiología son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles Las Sales colorantes más comúnmente usados son sales de tipo ácido o básico, términos que no indican necesariamente su pH en solución, sino que una parte significativa de la molécula sea aniónica o catiónica. Los colorantes básicos consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Ejm: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). Los colorantes ácidos tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. Ej: eosinato (-) de sodio (+). Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha muerto, el proceso de tinción la mata. Los colorantes ácidos no tiñen la célula y por lo tanto, pueden usarse para impartir al fondo un color de contraste (coloración negativa). Desde el punto de vista práctico entonces, los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células eucariotas y procariotas; los colorantes ácidos reaccionan con sustancias básicas, como las estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas. Las Colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán. En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con el propósito de hacerlas visibles al microscopio óptico. Los tipos de coloraciones son: SIMPLES, cuando se usa un solo colorante, DIFERENCIAL cuando se usa más de un colorante y ESPECIALES como la tinción negativa que colorea el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir. Los tipos de colorantes más usados son los BÁSICOS que consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Tiñen estructuras ácidas de la célula (ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos), Ej: azul de metileno. la fucsina básica, el cristal violeta, hematoxilina, etc. ÁCIDOS tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas (Rx básicas), No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloración negativa). Ej; eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo Para la realización de una coloración se debe realizar tres pasos: frotis o extensión, fijación y coloración. La primera consiste en colocar la muestra en la lámina portaobjetos, si es frotis es haciendo uso de dos laminas portaobjetos limpias y desengrasados, una hace que toda la muestra se disperse en forma paralela desde un extremo al otro; la extensión consiste en que la muestra colocada en el centro de la lámina se disperse en forma elíptica desde el centro hacia afuera dela lámina portaobjetos. La segunda se refiere a la forma de como adherir las células a la lámina portaobjetos, que puede ser por fijación física (calor) y fijación química (metanol, formalina 5%, licor de Hoffman, etc. Y el tercer paso consiste en cubrir la muestra ya fijada con un colorante que puede ser simple, diferencial o especial OBJETIVOS − Interpretar el fundamento de las coloraciones en la práctica de biología. − Practicar la preparación de muestras en fresco y n seco − Ejercitar las técnicas de coloración simple y compuesta.
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II. MATERIALES M. biológico: células procariotas y eucariotas M. de laboratorio: láminas portaobjetos y cubreobjetos, goteros, pipetas, baguetas, microscopios, mechero, bisturí, etc. Reactivos: alcohol abs, agua destilada, soluciones colorantes (hematoxilina, eosina, Wright, azul de metileno set de Gram, etc), soluciones buffer. III. PROCEDIMIENTO: 3.1 TIPOS DE PREPARACIONES A) preparado en fresco - Tomar y recortar una muestra de hoja de geranio y extraerle la epidermis. - Colocar la muestra en la lámina portaobjetos y agregarle una gota de agua - Luego cubrirla una laminilla cubreobjetos, evitando que se forme burbujas. - Llevar el preparado a la platina del microscopio y observarla con objetivo de menor a mayor aumento (4X y de 10X). B) preparado en seco - Con la ayuda de un hisopo, hacer un raspado de la cara interna de la boca. - Luego el hisopado extenderlo en una lámina portaobjetos. - Esta extensión dejarlo secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un mechero, - Una vez secado, se realiza la coloración respectiva, que en este caso será azul de metileno. 3.2 TIPOS DE COLORACIONES A) Coloración. SIMPLE: Positiva o negativa - hacer un preparado de la muestra, que puede ser en fresco o en seco y luego fijarlo. - Cubrir la muestra fijada con un colorante con un solo colorante ejm azul de metileno, eosina hematoxilina, etc. Y dejarlo por tres minutos. - descartar el exceso de colorante y luego secar al ambiente o con la ayuda del mechero. - Llevar a observar al microscopio con objetivos en seco los diferentes tipos de colorantes agregados.
B) Coloración DIFERENCIAL Coloración de Wright - Hacer un raspado de la cara interna de la boca con un hidopo. - Luego extenderlo en una lámina portaobjetos. - Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un mechero, - Agregarle la solución de colorante de Wright por 3 minutos - En seguida agregarle una solución de buffer o agua destilada por 3 minutos - Observar al microscopio con 4X, 10X y 40X - Dibujar lo observado IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VII. CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. 5. 6.
¿Que diferencias encontró en la coloración simple y coloración diferencial? Esquematice una célula animal, vegetal y procariota con sus partes ¿Cuáles son las diferencias entre una célula eucariota y una célula procariota? Dibuje los protozoos de agua dulce que podemos encontrar en el agua de charco Cuáles son las diferentes células eucariotas de los vertebrados? Explique sus funciones y que tejidos y sistemas forman.
Biologia UNJBG-2016 VIII. BIBLIOGRAFÍA
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