Técnicas histológicas y coloraciones

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y COLORACIONES En este capítulo estudiaremos: D1. Generalidades D2. Técnicas histológicas D3. Técnicas especiales D4. Las coloraciones empleadas en histología

D1. GENERALIDADES

Técnicas histológicas es el conjunto de procedimientos utilizados para el estudio microscópico (histoló (histológico gico)) de las piezas piezas anatómi anatómicas. cas. Estos Estos procedim procedimient ientos os complejo complejos, s, que van desde la recepción de una pieza anatómica hasta el diagnóstico microscópico de la misma, si bien es cierto que no van a ser realizados ni por el estudiante ni por el médico que no se dediquen a la invest investiga igació ción n histol histológ ógica ica e histop histopat atoló ológic gica, a, pero pero es necesa necesario rio el que que ellos ellos conoz conozcan can sus fundamentos, fundamentos, su ejecución, la interpretación de los resultados para una mejor comprensión del estudio histológico, por lo que aquí se los trata de una manera resumida. Todas las técnicas tienen en común el que requieren de un corte muy delgado del tejido (llamado corte histológico), y el montarlo en una lámina muy fina de vidrio, la cual se la somete a diversas coloraciones antes de observarla al microscopio, ya que luego se la cubre por una laminilla.

D2. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

Hay dos técnicas principales para proceder a la preparación y tinción de los cortes histológicos de los tejidos: la de la parafina y la de la congelación. La importancia y la utilización de cada una de ellas, tiene su justificación precisa, como se verá a continuación. continuación. D2.1. LA TÉCNICA DE LA PARAFINA: se inicia siempre por la obtención de la muestra, la que pasa luego, por los siguientes procedimientos: fijación, deshidratación, aclaración, inclusión, sección y finaliza con el montaje y la tinción. a. LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: es el tomar un pequeño fragmento de órgano o tejido, lo cual se verifica ya en el cadáver (necropsia), o ya en el vivo (biopsia), en este caso, ya en un acto operatorio, o ya mediante métodos especiales, por los cuales cuales y sin que se haga una verdadera intervención quirúrgica, se obtienen fragmentos de tejido para su estudio microscópico. En los dos casos, este paso debe ser realizado mediante movimientos delicados y usando instrumental bien bien afilad afilado, o, para para no produc producir ir cambio cambioss artifi artificia ciales les en las estruc estructur turas as a observ observar, ar, ya por presio presiones nes indebidas o ya por secciones realizadas con instrumentos en mal estado.

Dr. Gustavo Mora Venner

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En una necropsia se tratará de obtener las muestras lo más rápidamente posible para que los órganos no sufran lesiones postmortem, ésto es, las que necesariamente ocurren una vez que se ha producido la muer muerte te;; como como la mues muestr tra a así así obte obteni nida da debe debe ser ser some someti tida da a los los sigu siguie ient ntes es paso pasos, s, para para que que los los procedimientos de éstos actúen bien, el fragmento debe ser de pocos milímetros de espesor.

b. FIJACIÓN: la muestra obtenida es de un tejido blando y a veces demasiado blando, por ello, este paso de la técnica tiene por finalidad endurecerlo, a la vez que detiene las degeneraciones postmortem. El fundamento de este paso es el coagular las proteínas del tejido para que se enduren; para conseguir ésto, se acude al aldehído fórmico en solución al 4%. Al endurecer las proteínas por coagulación, éstas aprisionan a algunos de los demás elementos de los tejidos y realmente causan la fijación del mismo. Los fijadores son antisépticos, por lo que matan a cualquier agente patológico que contenga el fragmento. c. DESHIDRATACIÓN : como para realizar los cortes de las muestras es necesario incluir a éstas en una sustancia que se endure completamente, se emplea para este fin, la parafina, pero ésta necesita tener en la muestra un espacio para ocupar; los técnicos entonces idearon al conocer que el tejido tenía mucha cantidad de agua (aproximadamente el 65%), el eliminar ésta y reemplazarla por la parafina líquida, con lo cual se cumple el paso de la deshidratación. Para ésto, se lava la muestra con alcoholes de grado cada vez superiores hasta llegar al alcohol absoluto, que elimina completamente el agua del tejido. d. ACLARACIÓN: luego de eliminada el agua, la muestra queda con alcohol en el que tampoco se disuelve la parafina, por lo que los investigadores debieron buscar un solvente común de cera de parafina y de alcohol, y para este efecto se emplea el xilol, a cuya acción se somete a la muestra, con lo que se elimina de ella a todo el alcohol. e. INCLUSIÓN : realizada la aclaración, la muestra se incluye en parafina líquida, la que penetra en el fragmento y sustituye al xilol. f. SECCIÓN: al enfriarse la parafina, ésta se endura y con ella se endura también el fragmento orgánico de la muestra, constituyendo un bloque compacto de parafina que fácilmente se presta para ser cortado. Para cumplir con este paso, debió investigarse mucho y mejorar los instrumentos que se empleaban, ya que se necesitaban hacer cortes de pocas micras de espesor (entre 5 y 10 micras); por ello, se ideó el aparato llamado MICROTOMO (Fig. D-1 y D-2), que por una parte dispone de una cuchilla muy fina y por otra de un sistema con movimiento, de modo que, cada vez que la cuchilla realiza una sección, hace avanzar a la muestra una cantidad fija de micras que se pueden graduar a voluntad. De este modo, se logra obtener una verdadera cinta de cortes sucesivos, en los cuales, el borde uno se adhiere al borde del siguiente.










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g. MONTAJE Y TINCIÓN : una vez que se ha obtenido la cinta de los cortes, se procede a montar uno de ellos sobre una laminilla portaobjetos para proceder y someterlo a la tinción. Como el corte del tejido tiene en su interior parafina y como la mayor parte de los colorantes más usuales no son solubles en la parafina y si en agua (ver sobre ésto más adelante en este mismo libro), hay que volver a hidratar al corte, de modo que permita colorearlo. Luego, y una vez montado el corte en a placa, se procede a realizar los pasos inversos que se han analizado hasta llegar a la inclusión; por ello, primero se lavará en xilol, con lo cual se disuelve la parafina, luego se lavará en alcoholes decrecientes de grado para eliminar el xilol y finalmente, se lo lavará con agua, para que ésta ocupe las partes anteriormente llenas de ella y así pueda ser teñido con colorantes solubles en agua. Realizada la coloración, se procederá nuevamente al lavado con alcoho alcoholes les crecie creciente ntess y luego luego con xilol, xilol, para para finalm finalment ente e proced proceder er a la observ observaci ación ón del corte corte microscópico (Fig. D-3).

Fig. D-2. Fotografía de un ultramicrotomo, que en primer plano muestra el cuchillo para los ultrad ultradel el ados ados cortes cortes de te ido. ido. D2.2. LA TÉCNICA DE LA CONGELACIÓN: es la otra técnica más usada para realizar estudios histológicos y sobre todo histopatológicos, pues de ella nos valemos cuando el cirujano necesita por ejemplo, un diagnóstico histopatológico de un supuesto tumor canceroso durante el curso de una intervención quirúrgica; con el diagnóstico del tejido obtenido durante la cirugía, él sabrá que conducta seguir durante la operación, ya que si se comprueba que es maligno, deberá hacer resecciones quirúrgicas mayores, caso contrario, solo extirpará el tumor o solo la parte extraída par la observación y no proseguirá su intervención; como en el ejemplo indicado, tenemos infinitos de los que se vale la cirugía para sus intervenciones, mediante el uso de la técnica de la congelación. congelación. La técnica en mención consiste en realizar la solidificación del fragmento de muestra mediante la congelación. Este procedimiento se realiza de varias maneras, siendo la más usada, la que se vale de una corriente de bióxido de carbono, que se conecta al portapiezas, mediante un dispositivo, cuya espita o válvula sobresale sobre la pieza para producir el llamado hielo seco, luego de lo cual se realiza enseguida el corte y la observación al microscopio. microscopio. Actu Actual alme ment nte, e, se usa usa much mucho o el apar aparat ato o llama llamado do CRIO CRIOST STAT ATO O (Fig (Fig.. D-4) D-4),, que que perm permit ite e la congelación de la muestra y su corte a igual temperatura, con lo cual se abrevia el tiempo de preparación.









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Es necesario que el estudiante conozca por lo menos los fundamentos y la importancia de los resultados de las más modernas técnicas, aunque no las vaya a ver o a realizar. De estas técnicas, las más trascedentales son la radioautografía, la microscopia electrónica, la microscopía de fase o de interferencia, los métodos inmunohistoquímicos, que incluye la inmunohistoquímica indirecta y otras técnicas.

Fig. D-3. Serie de fotografías fotografías que muestran algunas de las fases en la preparación de un frotis de material patológico para su observación con el microscopio. (1) Toma de la muestra; (2) Extensión sobre un portaobjetos; (3) Fijación mediante calor; (4) Coloración del material; (5) D3.1. LA RADIOAUTOGRAFÍA: su fundamento radica en la introducción de isótopos radiactivos en los elementos estructurales de los tejidos, a los isótopos se los observará posteriormente forma formand ndo o parte parte de los tejido tejidoss en estud estudio, io, gracia graciass a la propie propieda dad d de dicho dichoss isótop isótopos os de conver convertir tirse se en fuent fuentes es de energ energía ía capace capacess de impres impresion ionar ar las em emuls ulsion iones es fotog fotográf ráfica icas, s, pudiendo de este modo ser detectados en sus diversos trayectos. Es una técnica que a esta época del 2006, data de hace unos 45 años y que se aprovechó de la física nuclear para la producción de cierto tipo de isótopos radiactivos mediante el ciclotrón y la pila atómica. Estos isótopos, que al comienzo fueron muy pocos (inicialmente uno solo), posteriormente han aumentado considerablemente en su número y en la actualidad hay una gran variedad para el estudio de los más diversos componentes celulares. Estos componentes celu celula lare ress deno denomi mina nado doss «pie «piedr dras as de cons constr truc ucci ción ón» » reci recibe ben n un radi radioi oisó sóto topo po y pasa pasan n a denominarse denominarse «precursores» y «producto» «producto» al elemento resultante con el precursor.










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sucesiva sucesivament mente. e. Así, la radioaut radioautogra ografía fía se basa sobre dos principios principios fundam fundamenta entales: les: (1) la radiación ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsión fotográfica que la luz visible; y, (2) (2) un prec precur urso sorr biol biológ ógic ico o con con ma marc rca a radi radiact activ iva, a, por por ejem ejempl plo, o, un am amin inoá oáci cido do,, tien tiene e exactamente iguales propiedades biológicas y destino metabólico en el organismo que la molécula correspondiente sin marca. Por marca radiactiva se entiende que un átomo de una molécula determinada es reemplazada por su isótopo radiactivo correspondiente, por ejemplo el reemplazo de hidrógeno por tritio 3H.

Fig. D-4. Ilustración que muestra el corte de trozos de tejido re ara arado do en un crio criosta stato. to. Los resultados que se obtienen son extremadamente importantes, ya que solo mediante esta técnica se pueden hacer estudios histológicos en el tiempo y puesto que todas las demás técnicas nos presentan las imágenes de los tejidos hasta cierto punto estáticos y no se los puede estudiar en relación con el tiempo de desarrollo, como sucede con la vida de la célula, el ciclo de un epitelio, etc., o bien en los procesos activos, como son la síntesis de productos, el paso de ellos de una estructura a otra, el período de su producción, su eliminación, etc., todas estas situaciones se han hecho posibles gracias a la radioautografía. Insistiendo, con esta técnica es posible obtener información directa respecto al sitio dentro de la célula donde se sintetiza un producto y los componentes químicos que lo forman, además de sus eventuales desplazamientos dentro de la célula o hacia otras localizaciones del organismo, después de salir de la célula. Además, es posible seguir los desplazamientos de toda la célula y su posterior posterior destino en el organism organismo. o. Por lo tanto, tanto, la radioau radioautogra tografía fía provee provee de informac información ión referida a los aspectos dinámicos dinámicos de la morfología de las células y los tejidos. El proce procedim dimien iento to radioa radioaut utogr ográfi áfico co puede puede ser ser el siguie siguient nte, e, por por eje ejemp mplo: lo: en un anima animall de experimentación se inyecta una molécula de importancia biológica marcada con un isótopo radiactivo, por ejemplo 3H-leucina, que interviene en la formación de varias proteínas. Las moléculas con marca radiactiva son integradas integradas rápidamente a las macromoléculas, que se pueden conser conservar var en los cortes cortes de tejido tejido al hacerl hacerlas as insolu insoluble bless por por fijaci fijación ón.. Las mo moléc lécula ulass inyect inyectad adas as son solub solubles les y se elimin eliminan an por por lavad lavado o duran durante te la prepa preparac ración ión de los cortes cortes histológicos, a menos que hayan sido incorporadas al producto de síntesis macromolecular antes de ser sacrificado el animal. Después del montaje de los cortes, se les agrega en cámara oscura una capa muy delgada de emulsión fotográfica (cristales de bromuro de plata en emulsión de gelatina) (Fig. D-8). Durante el posterior período de exposición, que puede durar algunos días o semanas, de acuerdo al trabajo experimental, desde los sitios radiactivos del









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por por eje ejemp mplo lo teñido teñido de ma maner nera a adecu adecuad ada, a, con poste posterio riorr deshi deshidra dratac tación ión e inclus inclusión ión.. En la observación con el microscopio se distinguen los granos de plata metálica como pequeñas manchas o puntos negros en los sitios de localización de la sustancia radiactiva en el corte del tejido subyacente (Fig. D-6).

Fig. D-5. Esquema de un preparado radioautográfico para uso uso con con ME. ME. Part Parte e supe superi rior or:: el prep reparad arado o duran urante te la exposición; parte inferior: el preparado tras el revelado y la El poder de resolución, entendido entendido como la exactitud de la localización del isótopo radiactivo, es de alre alrede dedo dorr de una una micr micra a con con el micr micros osco copi pio o ópti óptico co,, pero pero si se util utiliz iza a el micr micros osco copi pio o electrónico (Fig. D-7), es posible obtener un poder de resolución de alrededor de 0,1 micras. En las imágenes obtenidas por microscopio electrónico a menudo los gránulos ocultan varias estructuras y el estudio más exhaustivo de las radioautografías puede requerir un análisis estadístico.

Fig. D-6. Microfotografía de un preparado radioautográfico de tejido renal para ME. Se inyectó timidina tritiada que se incorporó a todos los núcleos celulares que muestran puntos ne ros corres corres ondie ondient ntes es a los ránulo ránuloss de lata lata me metál tálica ica.. El método sólo demuestra sustancias que se incluyen en los componentes tisulares, mientras que el material marcado se encuentra dentro del organismo. Precisamente por ello es posible obten obtener er inform informaci ación ón sobre sobre las rel relaci acion ones es dinám dinámica icass de los proce procesos sos metab metabóli ólicos cos.. Una Una importante aplicación de la radiautografía es el marcado de los núcleos celulares (Fig. D-6), tras el cual se puede seguir el desplazamiento y el destino de las células marcadas dentro del organismo. Si, por ejemplo, se inyecta timidina marcada con tritio (que en el organismo se incluye como la base timina en el DNA) en un feto, será incluido en el núcleo de todas las












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Fig. Fig.. D-7. D-4. D-7. 4. Imag Imag Imagen agen en de de un un prepa prep prepar arad ado radi radioa oaut utog ográ ráfi fico co de de Fig. Fig DIm en pre parad rado oo radioa rad ioaut utogr ográfi áfico co eritro eri trocit citos os (E) yy reticu reticu reticuloiculolo-cit citos os (R) (R) capata capa capatad tada a con con ME. Las Las Las eritroc erit rocito itos s (E) ret lo-cit citos os cap atada da co n ME. células fueron fueron incubadas incubad incubadas as con in in Vitro Vitro con con leucina leucina tritiada. tritiada. Se Se células incubada s con observa una gran cantidad de gránulos de plata por sobre observa una gran cantidad de gránulos de plata por sobre un R, R, pero pero ninguno ninguno sobre sobre los los E, E, debido debido aa que que la la leucina leucina un

D3.2. LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA: como con el microscopio de luz (ML) no se podían alcanzar mayores aumentos que los conocidos, debido fundamentalmente a la longitud de onda de la luz, se buscó la forma de resolver este problema y se ideó la fabricación de lentes de cuarzo y ya no de cristal, toda vez que en estos se detenía la luz ultravioleta (UV) que siendo de mucha menor longitud de onda permitía mayor resolución de las imágenes y obviamente, mayor amplitud de las mismas; así se inventó el ULTRAMICROSCOPIO, que si bien no permitía la visu visual aliz izac ació ión n de imág imágen enes es por por ser ser la luz luz UV invi invisi sibl ble, e, si impr impres esio iona naba ba las las em emul ulsi sion ones es fotográficas y se podían obtener microfotografías con una ampliación hasta del doble de la que ofrecía la luz normal. La longitud de onda no había sido disminuída lo suficiente hasta que se inventó el microscopio electrónico (ME), en el cual ya no existe la longitud de onda, por estar éste fundamentado en el principio de los campos magnéticos o electrostáticos a manera de haces de electrones que reem reemp plaza lazarí ría an a los los len lentes de cris cristtal o de cuar cuarzzo, ele electro ctron nes que al acel celera erarse rse convenientemente convertían a la longitud de onda en factor despreciable de modo de poder obtener grandes ampliaciones de las imágenes. Desde entonces se han venido utilizando los









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D3.3. LA MICROSCOPÍA DE FASE O DE INTERFERENCIA : es así mismo un método moderno y útil, sobre todo para el estudio de los tejidos en fresco, lo que es difícil solamente con el ML, ya que son tan pocas las diferencias de las densidades entre los diferentes elementos de cada célula, por ejemplo entre el núcleo y el citoplasma, de tal manera que atravesándolas una igual onda luminosa, no se obtendría casi ningún contraste, por lo que sería necesario que algunos rayos luminosos de diferente longitud de onda atraviesen estas diferentes estructuras, de modo que las visualice a unas más claras y a otras más oscuras. Es justamente este fenómeno el que se cumple con el microscopio de fase o de interferencia, el que causa que los rayos sumisos se separen y penetren en el corte con diferencia de longitud de onda, lo que se obtiene en este tipo de microscopios con un separador de haz, insertado debajo del objeto y otro haz es desvia desviado do (que (que se conoce conoce como haz haz de refere referenc ncia) ia),, pasa pasando ndo un poco poco al lado lado del objet objeto; o; consecuentemente, consecuentemente, los dos haces no atraviesan los mismos materiales, lo que conde a obtener imágenes con diferentes tonalidades tonalidades debido al paso de de los dos haces D3.4. LOS MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS: el organismo está en condiciones de reaccionar ante sustancias extrañas o antígenos, y formar anticuerpos específicos, que se unen con los antígenos. Por lo general actúan como antígenos las macromoléculas proteicas o polisacáridas. Los anticuerpos son proteínas producidas producidas por las denominadas denominadas células plasmáticas y circulan por la linfa y la sangre. Las células productoras de anticuerpos pertenecen al sistema inmune del organismo, organismo, que protege al individuo contra las macromoléculas extrañas que intentan ingresar, por ejemplo, como componentes de bacterias o virus. Así, los anticuerpos son un eslabón importante en la defensa del organismo contra las enfermedades enfermedades infecciosas. La reacción entre un antígeno y su anticuerpo es en extremo específica. Los métodos inmunohistoquímicos se basan sobre la utilización de un anticuerpo específico, que se marca mediante un enlace químico en una sustancia que se puede transformar en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno. El principio se ilustra con la denominada técnica de anticuerpo fluorescente. Para localizar la proteína muscular miosina se inyecta en un conejo miosina purificada de músculo de pollo. Al cabo de cierto tiempo, el suero del conejo contendrá anticuerpos contra el antígeno miosina de pollo. A continuación se extrae el anticuerpo del suero del conejo y se adosa a fluoresceína. Cortes histológicos extraídos de pollo se bañan en una solución del anticuerpo fluorescente (antimiosina), que se une específicamente con la miosina del corte. El anticuerpo en exceso se elimina por lavado y se analiza el preparado con el microscopio de fluorescencia (Figs. D-8, D10 y D-11).










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Fig. D-9. Microfoto Microfotograf grafía ía de neurona neuronass teñidas teñidas mediant mediante e inmunoh inmunohistoq istoquími uímica ca con anticuerp anticuerpos os contra contra la molécula molécula trans transmi misor sora a seroto serotonin nina a (5-hi (5-hidro droxit xitrip rip-ta -tamin mina), a), unida unida a peroxidasa. La especificidad de los métodos inmunohistoquímicos depende totalmente de que el antígeno utilizado se aísle sin mezclas con otras sustancias, para que sea posible producir anticuerpos puros con la inmunización. En consecuencia, la investigación del grado de pureza del antígeno es un importante control del método. Se obtiene un antígeno totalmente puro cuando se lo sintetiza sintetiza,, por ejemplo ejemplo un polipéptid polipéptido o de secuencia secuencia de aminoáci aminoácidos dos conocida conocida.. Es esencial esencial señalar que no es necesario aislar el anticuerpo primario específico de la fracción mezclada de anticuerpos en el conejo inmunizado ni los anticuerpos específicos anticonejo en la cabra.









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conejo, el anticuerpo secundario podría ser un anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerpos de conejo en general, obtenido por inyección del anticuerpo de conejo en una cabra. Este método es más sensible porque cada molécula del anticuerpo primario reacciona con varias moléculas del anticuerpo secundario secundario marcado, y la reacción se refuerza. En los último últimoss años años ha sido sido posib posible le obtene obtenerr gran gran cantid cantidad ad de mo moléc lécula ulass de antic anticuer uerpo po totalmen totalmente te iguales, iguales, los denomin denominados ados anticuerp anticuerpos os monoclo monoclonales nales.. La técnica técnica para formarlos formarlos implica una fusión celular de células de mieloma (una línea celular tumoral transformada) murinos con los denominados linfocitos B, productores de anticuerpo, del timo de ratones previa previame mente nte inmun inmuniza izado doss por por la inyecc inyección ión del del antíg antígeno eno que que se desea desea demost demostrar rar con el anticuerpo monoclonal. Después de la fusión celular, las denominadas células de hibridoma (híbridas de mieloma) formadas han adquirido la capacidad de las células del mieloma de desarrollar un crecimiento prolongado prolongado en cultivos celulares y la capacidad de los linfocitos B de produc producir ir deter determin minad ado o antic anticuer uerpo po.. Despu Después és de la cloniz clonizaci ación ón de las célula célulass híbrid híbridas as indiindividuales, cada clon produce grandes cantidades de anticuerpo monoclonal monoclonal idéntico (Fig. D-11). Los Los mé méto todo doss inmu inmuno nohi hist stoq oquí uími mico coss son son uno uno de los los má máss impo import rtan ante tess util utiliz izad ados os en las las investigaciones histológica y biológica celular. En principio es posible demostrar la localización de cada una de las proteínas que se forman en el organismo. Por ejemplo, en muchos casos se ha podido establecer cuáles son las células que forman determinada determinada hormona. Los anticuerpos anticuerpos también se pueden formar contra otras moléculas, distintas de las proteínas, ya sea antígenos en sí mismos o, en los casos de moléculas pequeñas, compuestos que se acoplan a sustancias antigénicas como las proteínas, a veces debido a otro tratamiento. Por ejemplo, se ha podido demostrar la existencia de pequeñas moléculas transmisoras como la serotonina (5-hidroxitriptamina) (Fig. D-9).










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con lecitinas tiene amplia aplicación para demostrar la existencia de determinadas secuencias de hidratos de carbono en las moléculas de las membranas celulares. LA HIBRIDACIÓN IN SITU : se basa sobre la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la capacidad de unirse entre sí que presentan las monocadenas de ácidos nucleicos que tienen secuencias de bases complementarias. La hibridación puede ser de DNADNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la característica muy específica de la hibridación es posible demostrar con gran especificidad la presencia de determinadas secuencias de DNA o de RNA en su localización en la célula. Para la técnica de hibridación in situ se utiliza una sonda (del inglés sonde, probe), formada por un ácido nucleico monocatenario con una secuencia de bases conocida, complementaria complementaria de la secuencia de bases que se desea demostrar. Las sondas son producidas en laboratorios (por ejemplo, mediante técnicas de donación de genes), y se marcan con un isótopo radiactivo (para ser demostradas por radioautografía, como se indicó antes), o con una ramificación adosada, que permite identificar la sonda mediante otras téc nicas, por ejemplo la inmunohistoquímica. Estas sondas varían en longitud, desde 10-15 bases hasta varios miles de bases. Por ejemplo, si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de DNA en un cromosoma de las células de un corte histológico o en un preparado especial de cromosomas, primero se expone el preparado a un pH elevado (básico), que induce la separación de la doble cadena de la molécula de DNA por desnaturalización. Después se agrega la sonda, que puede poseer la secuencia complementaria de DNA o de RNA. Una vez hibridada la sonda con las zonas complementarias del DNA de los cromosomas se transforma en visible la localización en los núcleos celulares, por ejemplo, mediante mediante radioautografía radioautografía o inmunohistoquímica. inmunohistoquímica. Si se desea demostrar la presencia de moléculas específicas de RNA, no se efectúa ningún tratamiento previo de los cortes histológicos con pH elevado, dado que precisamente se desea que las cadenas dobles de las moléculas de DNA no se separen y, en consecuencia, no se unan a la sonda. En este caso, es suficiente incubar los cortes de tejido con la sonda (después de una fijación suave del tejido), que puede contener una secuencia complementaria de DNA o de RNA. RNA. Así, Así, median mediante te la hibrid hibridaci ación ón in situ situ es posib posible le demo demostr strar ar las secuen secuencia ciass de ácidos ácidos nucleicos correspondiente a determinados genes, además de la expresión de determinados genes por la demostración de la presencia de secuencias específicas de RNA mensajero (mRNA).

D4. LAS COLORACIONES EMPLEADAS EN HISTOLOGÍA

Si no colorearan o tincionaran los tejidos, éstos simplemente no se podrían ver al microscopio, ya que aparecerían todo blancos y algunos hasta trasparentes. Por ello, los investigadores han tenido que idearse muchas maneras de «pintar» los tejidos para poder apreciar sus características microscópicas. microscópicas. Las técnicas de coloración que son muchas también han atravesado por varias etapas para











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Cuando se examinan preparados frescos con el microscopio ordinario de luz, hay muy poco contraste entre los diversos componentes titulares. Por lo mismo, ha habido necesidad de recurrir a los llamados COLORANTES PARA TEÑIR LOS TEJIDOS, técnica que empezó aproximadamente a mediados del siglo XIX. Al principio, solía utilizarse un solo colorante para teñir el corte, y por ello, con este colorante todos los elementos adoptaban el mismo color, pero como los diferentes componentes los tomaban con diversas intensidades, podían distinguirse unos de otros, lo cual se basaba en la intensidad de su coloración. Esta técnica proporcionaba, aproximadamente, el mismo tipo de contraste que se puede obtener con una televisión de blanco y negro. Cuando se incrementó el desarrollo de la industria de los colorantes se dispuso de un número mayor de colorantes, tanto naturales como sintéticos, y algunos de los colorantes más nuevos resultaron ser mucho más selectivos en su acción que los empleados hasta entonces. Se comprobó, por ejemplo, que podía utilizarse la tinción de un color para teñir algunos componentes tisulares (por ejemplo, en azul), y luego la pieza podía someterse a una segunda coloración que impregnaría los materiales que no se habían teñido con la primera tinción, dándoles otro color (por (por eje ejemp mplo, lo, rojo). rojo). Las Las ventaj ventajas as lograd logradas as fuero fueron, n, aprox aproxim imada adamen mente, te, las que que brind brinda a la televisión de color en comparación con la de blanco y negro, permitiendo distinguir a los jugadores de fútbol que llevan uniformes azules, de los que llevan uniformes rojos, aunque ambos tengan más o menos la misma forma. Diversos perfeccionamientos de los métodos de noción, que no procede mencionar aquí, aumentaron la selectividad, ayudando a los histólogos no sólo a distinguir cada vez más entidades en los tejidos, sino también estimulando la investigación productiva. D4.1. PRINCIPIO BIOQUÍMICO DE LOS DISTINTOS TIPOS DE COLORANTES : la mayor parte de colorantes utilizados en histología son sales solubles que se ionizan en el agua. Aunque son sales, se dice que son colorantes ácidos o colorantes básicos. Para distinguirlos, recordemos que en una sal, por ejemplo, el NaCl, el Na contiene carga positiva y se denomina catión o radical básico, y Cl tiene carga negativa y se llama anión o radical ácido. En un colorante (que es una sal), si el radical que proporciona el color ocupa la posición, digamos, del Na en el NaCl, el colorante se denomina colorante básico porque el radical que proporciona el color es el radical básico (el catión). Si el radical que proporciona el color ocupa la posición que tiene el Cl en el NaCl se










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Por lo tanto, los materiales teñidos de color azul en un corte coloreado con hematoxilina se dice que son basófilos porque quieren o apetecen un colorante básico (Fig. D-12), como sucede con los núcleos, los ribosomas y el retículo endoplásmico rugoso, que tienen una gran afinidad por este colorante debido a su alto contenido de ADN y ARN, respectivamente. La eosina es un colorante sintético que da color rosa o rojo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina. Es un colorante ácido; en consecuencia, los constituyentes de los tejidos que se tiñen en color rosa o rojo con este producto se dice que son acidófilos o eosinófilos (Fig. D-12, arriba, izquierda), como ocurre con la mayoría de las proteínas citoplásmicas que son básicas y por ello el citoplasma generalmente se tiñe de rosa o de rojo rosado.









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preparar cortes donde se hallen estos componentes. Un hidrato de carbono abundante es el glucógeno (que es un polímero, no es muy soluble en agua y por lo cual, no se disuelve fácilmente al preparar un corte teñido), que no se tiñe ni por hematoxilina ni por eosina; por lo tanto, es transparente, y los lugares donde existían las células aparecen en los cortes HE como zonas claras (Fig. D-12, arriba, izquierda). Pero estas zonas claras de las células difieren de las zonas claras que quedan en ellas al disolverse la grasa cuando se prepara un corte, porque los espacios que antes estaban ocupados por la grasa son redondos, mientras que las zona zonass clar claras as del del cito citopl plas asma ma que que cont contie iene nen n o cont conten enía ían n gluc glucóg ógen eno o son son irreg irregul ular ares es y desgarradas. Para colorearlos colorearlos se emplea emplea una técnica alternativa, alternativa, denominada denominada REACCIÓN REACCIÓN DE SCHIFF SCHIFF DEL ÁCIDO PERYÓDICO, suele abreviarse con el nombre de PAS o, mejor, de técnica de PA-Schiff. La técnica PA-Schiff es un método en dos tiempos basado en la aplicación a la histología de dos reacciones bien conocidas de los químicos. Durante la primera etapa, el ácido peryódico reacciona con los grupos glicol I, II (—CHOH— CHOH—), que existen en cada uno de los residuos de la glucosa, constituyendo la cadena del glucógeno. Al tratar cortes que contienen glucógeno con ácido peryódico, ambos miembros de cada grupo glicol proporcionan un grupo aldehído (—CHO), de manera que la cadena polisacárida de glucógeno se transforma en una cadena polialdehídica. La segunda etapa estriba en tratar los cortes con un reactivo bien conocido de los aldehídos; se trata de un colorante denominado fucsina básica que puede palidecer intensamente con ácido sulfuroso y entonces recibe el nombre de reactivo de Schiff. Los aldehídos se combinan con el colorante descolorado para producir un complejo de color carmesí o púrpura (Fig. D-12, arriba, derecha), que se observa fácilmente con el microscopio. En el caso del glucógeno se observa una reacción de color púrpura brillante. En consecuencia, se dice que el glucógeno es una sustancia PA-Schiffpositiva. La reac reacci ción ón del del PAS PAS tiñe tiñe carb carboh ohid idra rato toss comp complej lejos os de un colo colorr rojo rojo oscu oscuro ro,, desc descri rito to tradicion tradicionalme almente nte como magenta. magenta. La mucina mucina producid producida a por las células células caliciform caliciformes es de los aparatos gastrointestinal y respiratorio se tiñe de magenta con esta técnica (y es además denominado PAS positivo). Las membranas basales y los bordes en cepillo de los túbulos renales y del intestino delgado y grueso son también PAS positivos, como el cartílago y hasta cierto punto el colágeno. El glucógeno, el almacén intracelular formado por carbohidratos que










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D4.5. DE AZUL DE TOLUIDINA: ésta es una técnica básica que tiñe componentes ácidos en varios grados de azul. Se emplea comúnmente en muestras muy finas incluidas en resina. Algunos componentes tisulares son capaces de virar el colorante azul a rojo, un fenómeno conocido como metacromasia. D4.6. LA METACROMASIA: cuando se tiñen ciertos componentes tisulares, como por ejemplo, la matriz cartilaginosa, con el colorante azul de toluidina, se modifica el color azul a púrpura o rojo violáceo por unión con el tejido. Esta variación cromática se denomina metacromasia (del griego, meta, variación y, kroma, color) y los colorantes capaces de sufrir esta transformación se denominan colorantes metacromáticos. metacromáticos. Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes básicos, de los cuales los más importantes son los derivados tiazínicos azul de toluidina y tionina.

Fig. D-14. Fotomicrografía de un corte de tráquea teñido con hematoxilina-eo toxilina-eosina, sina, que muestra muestra un ejemplo ejemplo de metacroma metacromasis. sis. La ancha zona, intensamente rojo vilácea de la mitad inferior, de la imagen es









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Fig. D-15. Fotomicrografía de un preparado del extremo de la raíz de la cebolla, teñida con el método de Feulgen, específico para DNA, ya que solo se tiñe de rojo, la cromatina del núcleo que con-tiene DNA.

D4.8. COLORANTES DE SUDÁN NEGRO Y OSMIO: estos colorantes tiñen las estructuras que contienen lípidos, como la mielina, de un color negro-pardo. Después de la fijación de los lípidos con formalina se cortan secciones congeladas, para evitar la extracción de los lípidos mediante solventes orgánicos. Para la demostración histoquímica se utilizan muy a menudo los denominados colorantes Sudán. Son casi insolubles en agua, por lo que se utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La “tinción” se produce cuando las moléculas del colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente, en relación correspondiente o la solubilidad en los dos medios. Pare evitar la extracción del colorante y de los lípidos, los cortes se incluyen, después de la tinción, en un medio acuoso. De este modo, los colorantes Sudán tiñen con intensidad los triacilgliceroles, como por ejemplo, en la tinción de los adipocitos con rojo Sudán (Fig. D-16). El negro Sudán tiene gran utilidad en la tin ción de las












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azul, el colágeno se tiñe de verde o azul, dependiendo de qué variante de la técnica se utiliza, y el citoplasma, el músculo, los eritrocitos y la queratina se tiñen de rojo brillante. D4.10. AZUL ALCIÁN: el azul alcián es una tinción de mucinas que puede ser usada en unión con otros métodos de tinción como la HE o el van Gieson (ver a continuación). Ciertos tipos de mucinas, pero no todos, se tiñen de azul con el método del azul alcián, como el cartílago. Cuando la técnica es combinada combinada con el van Gieson, el color del azul alcián se hace verde. D4.11. VAN GIESON: éste es otro método de tejido conectivo, en el cual el colágeno se tiñe de rojo, los núcleos son azules y los eritrocitos y los citoplasmas amarillos. Cuando se usa en combinación con una tinción elástica, la elastina se tiñe de negro / azul además de los result resultad ados os descri descritos tos arriba arriba.. Esta Esta técnic técnica a de tinció tinción n es parti particu cular larme mente nte útil útil para para vasos vasos sanguíneos sanguíneos y piel. D4.12. TINCIÓN DE RETICULINA : este método demuestra las fibras de reticulina del tejido de sostén, que se tiñen de negro I azul con esta técnica. Los núcleos pueden ser contrastados contrastados en azul con hematoxilina hematoxilina o en rojo con el colorante rojo neutro.

Técnicas histológicas y coloraciones

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