PRAKTIKUM KIMIA FARMASI ANALISIS II
VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR PARACETAMOL DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Rini Anggraeni P
P17335112036
Farmasi IIB
JURUSAN FARMASI POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG
2013-2014
PRAKTIKUM KIMIA FARMASI ANALISIS II
VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR PARACETAMOL DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
TUJUAN
Agar mahasiswa dapat memahami Uji Akurasi dalam proses validasi analisis penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
Agar mahasiswa dapat memahami Uji Presisi dalam proses validasi analisis penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
Agar mahasiswa dapat memahami Uji Linieritas dalam proses validasi analisis penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
Agar mahasiswa dapat memahami Uji LOD & LOQ dalam proses validasi analisis penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
PENDAHULUAN
Tujuan utama yang harus dicapai dari suatu kegiatan analisis kimia adalah dihasilkannya data uji yang valid. Secara sederhana hasil uji yang valid dapat digambarkan sebagai hasil uji yang mempunyai akurasi (accuracy) dan presisi (precission) yang baik.
Menurut ISO/IEC, Validasi diartikan sebagai kegiatan konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus harus terpenuhi.
Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi risiko penyimpangan yang mungkin timbul.
Terdapat 8 parameter validasi metode analisis yakni spesifisitas, ketelitian, ketepatan, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, ketangguhan, sedangkan parameter yang harus dipenuhi untuk validasi metode analisis produk obat-obatan meliputi spesifisitas, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit kuantisasi, ketelitian dan ketepatan.
Paracetamol merupakan zat aktif pada obat yang banyak digunakan dan dimanfaatkan sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol tergolong kedalam kelompok besar antiinflamasi nonsteroid (Non Steroid Antiinflamatory Drugs/NSAIDS)
Dalam Farmakope Indonesia Edisi IV (Hal:649-650), Parasetamol mempunyai beberapa sinonim yakni Parasetamolum, Asetaminofen, dan 4-hidroksiasetanilida. Dengan rumus kimia C8H9NO2 dan berat molekul 151,16, senyawa ini berwujud serbuk hablur berwarna putih, tidak berbau dengan rasa sedikit pahit. Paracetamol bersifat mudah larut dalam etanol, air mendidih dan dalam NaOH 1N.
HASIL PENGAMATAN dan PEMBAHASAN
Uji Akurasi
Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
Uji ini dilakukan kepada contoh yang diperkaya (spike) dengan sejumlah analit yang diketahui kuantitasnya. Spike adalah matriks contoh yang mengandung suatu kisaran analit. Diharapkan nilai recovery yang dihasilkan mendekati 100%. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui adanya kesalahan sisematik. Untuk syarat rentang recovery yang diterima tergantung dari jumlah analit yang akan diukur.
Analit pada matriks sampel (%)
Rata-rata yang diperoleh (%)
100
98-102
>10
98-102
>1
97-103
>0,1
95-105
0,01
90-107
0,001
90-107
0,0001 (1 ppm)
80-110
0,00001 (100 ppb)
80-110
0,000001 (10 ppb)
60-115
0,0000001 (1 ppb )
40-120
Sumber : Harmita, 2004
Prosedur Kerja:
Akurasi dievaluasi dengan metode penambahan baku (standard addition method), dengan membuat 3 konsentrasi dengan rentang spesifik 80, 100 dan 120%, dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% sampel dan 30% baku pembanding.
Sampel ditimbang dengan bobot setara 336, 420, dan 504 mg parasetamol kemudian diekstraksi sebanyak 3 kali dan volumenya dicukupkan dengan etanol secara berturut-turut hingga 100,0 mL; 100,0 mL dan 100,0 mL sehingga diperoleh total 9 hasil ekstraksi. Tiap hasil ekstraksi dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambah etanol hingga 10 mL, lalu dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan hingga 10 mL, dipipet lagi 1 mL dan diencerkan kembali hingga 10 mL. Larutan terakhir ini diukur serapannya pada panjang gelombang 245 nm.
Rentang spesifik (%)
Replikasi
Konsentrasi (ppm)
% recovery
Sampel (ppm)
Baku (ppm)
Sampel + baku
80
1
3,3463
1,44
4,693
93,52
2
3,2607
1,44
4,5866
92,08
3
3,2887
1,44
4,6084
91,65
100
1
4,0782
1,8
5,6774
88,84
2
4,0138
1,8
5,6208
89,28
3
3,9959
1,8
5,6177
90,10
120
1
4,9008
2,16
6,7678
86,44
2
4,9051
2,16
6,99
96,52
3
4,8987
2,16
6,6309
80,19
Rata-rata
89,85
SYARAT
80-110
KESIMPULAN
AKURASI BAIK
Pembahasan :
Dari hasil pengujian akurasi didapat nilai rentang recovery sebesar 80,19% – 96,52%. Nilai rentang recovery ini memenuhi persyaratan persen recovery, yakni sebesar 80 – 110%. Hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar Parasetamol dengan menggunakan Spektrofotometri UV-VIS memiliki akurasi yang baik.
Uji Presisi
Uji presisi adalah uji yang dilakukan untuk menentukan kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang-ulang pada sampel yang diambil dari campuran yang homogen.
Ada tiga jenis presisi yaitu repeatability (keterulangan), presisi antara, dan reprodusibitas (ketertiruan).
Repeatabiliy (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sama untuk beberapa sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada waktu terhadap beberapa sampel yang sama. Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan konsentrasi yang sama (100% dari konsentrasi actual) atau 3 jenis sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari konsentrasi actual yang ditetapkan masing-masing tiga kali (triplikasi).
Presisi antara
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-sampel diuji dan dibandingkan dilakukan oleh analis yang berbeda. Menggunakan peralatan berbeda dan pada hari yang berbeda. Presisi antara tidak perlu diuji jika kajian reprodusibilitas telah dilakukan.
Reprodusibilitas (ketertiruan)
Uji ketertiruan adalah pengujian presisi yang terakhir dan tuntas. Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkan sampel yang homogeny dan stabil, lalu diuji oleh beberapa laboratorium (studi kolaboratif). Hasil ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium, serta galat sistematik. Datanya diolah dengan uji ANOVA.
Penetapan Kadar Sampel
Dua puluh tablet merek dagang ditimbang satu persatu dan dihitung bobot rata-ratanya. Tablet diserbukkan lalu ditimbang seksama 472,0 mg, dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer yang berisi 25 mL etanol, dikocok, lalu disaring, diulangi sebanyak 3 kali, kemudian dicukupkan volumenya hingga 100 mL. Dari larutan tersebut dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambah etanol hingga 10 mL, kemudian dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan hingga 10 mL, dipipet lagi 1 mL dan diencerkan kembali hingga 10 mL, lalu diukur serapannya pada gelombang 245 nm.
Data Kadar Sampel dan Absorbansi Sampel
Bobot setara (mg)
Replikasi
Absorbansi Sampel
Konsentrasi Sampel (ppm)
Konsentrasi Standar (ppm)
Absorbansi Standar
Kadar Sampel (%)
80
1
0,30986
3,3463
6
0,55362
100,36
2
0,30167
3,2607
100,27
3
0,30435
3,2887
100,30
100
1
0,37991
4,0782
100,96
2
0,37375
4,0138
100,92
3
0,37204
3,9959
100,91
120
1
0,45865
4,9008
101,43
2
0,45906
4,9051
101,43
3
0,45844
4,8987
101,42
Hasil Pengujian Kadar Parasetamol Dengan Uji Presisi
Pengulangan ke-
Kadar Parasetamol (%)
xi-x
(xi-x)2
Ʃ(xi-x)2/(n-1)
1
100,36
-0,53
0,2797
0,235461111
2
100,27
-0,62
0,3830
3
100,30
-0,59
0,3468
4
100,96
0,07
0,0051
5
100,92
0,03
0,0010
6
100,91
0,02
0,0004
7
101,43
0,54
0,2928
8
101,43
0,54
0,2928
9
101,42
0,53
0,2821
(xi-x)2
1,8837
Rata-rata (x)
100,89
SD
0,4852
RSD
0,0048
CV (pengukuran)
0,4810
C (10^-6)
0,0001
log C
-3,9962
CV Horwitz
5,2730
Syarat
CV PENGUKURAN < CV HORWITZ
Kesimpulan
PRESISI BAIK
Rumus-rumus Yang Digunakan:
Pembahasan :
Parameter yang digunakan untuk menyatakan presisi adalah simpangan baku (SD), simpangan baku relative (RSD), dan koefisien variansi (CV). Dalam uji presisi ini, presisi dikatakan baik apabila CV pengukuran < CV Horwitz. Dari data pengukuran diatas diketahui CV pengukuran adalah 0,4810 dan CV Horwitz yang telah dihitung dengan rumus : 0,66 x 2(1-0,5 log C) didapat sebesar 5,2730. Sehingga nilai CV pengukuran lebih kecil dari nilai CV Horwitz. Maka, dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang dilakukan memiliki presisi yang baik karena sudah memenuhi persyaratan tersebut.
Uji Linieritas
Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya.
Parameter ini harus di uji untuk analisa uji yang menggunakan perbandingan (perbandingan dengan standar). Batas keberterimaan yang dikehendaki adalah r = 0.995. Kurva kalibrasi harus linier karena jika kurva kalibrasi sudah tidak linier lagi, maka kesalahan hasil dalam analisa uji perbandingan semakin besar.
Prosedur dari uji Linieritas adalah sebagai berikut:
Pembuatan Larutan Baku
Parasetamol (p.a.) ditimbang teliti sebanyak 60 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10,0 mL, ditambah etanol hingga 10 mL, lalu dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL, dan ditambah etanol hingga 10 mL.
Pembuatan Kurva Baku
Sebanyak 50 mg parasetamol (p.a.) yang ditimbang teliti dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, ditambah etanol hingga 50 mL, lalu dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambah dengan etanol hingga 10 mL, dipipet sebanyak 5 mL dan diencerkan hingga 50 mL, kemudian dipipet kembali sebanyak 1, 2, 3, 4, 5, 6 dan 7 mL, masing-masing dicukupkan volumenya dengan etanol hingga 10 mL. Serapan masing-masing diukur pada gelombang 245 nm.
Hasil Absorbansi Untuk Uji Linieritas :
No
Konsentrasi (ppm) (x)
Absorbansi (y)
xy
x2
y2
(x)2
1
1
0,0198
0,0198
1
0,000392
784
2
2
0,1876
0,3752
4
0,035194
3
3
0,2765
0,8295
9
0,076452
4
4
0,3869
1,5476
16
0,149692
5
5
0,4617
2,3085
25
0,213167
6
6
0,5771
3,4626
36
0,333044
7
7
0,6982
4,8874
49
0,487483
28
2,6078
13,4306
140
1,295424
Rata-rata
4
0,372542857
1,918657143
20
0,185061
Intersep (a)
-0,0559
Slope (b)
0,1071
r (square)
0,992
r
0,9960
SYARAT
r > 0,98
KESIMPULAN
LINIERITAS BAIK
Grafik Kurva Kalibrasi Dari Data Diatas
Rumus-rumus yang digunakan :
Pembahasan :
Dari data diatas, didapat nilai r sebesar 0,9960. Nilai r dikatakan baik apabila nilanya mendekati 1. Suatu metode bersifat linear jika nilai R2nya lebih besar dari 0,98. Dalam pengukuran didapat nilai R2 sebesar 0,992.Maka, dapat disimpulkan bahwa metode analisis memiliki nilai linieritas yang baik.
Uji Limit Deteksi dan Limit Kuantisasi
LOD (Limit Of Detection) atau batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tersebut. LOD dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada level yang mendekati LOD. Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi.
LOQ (Limit Of Quantification) atau batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi.
Prinsip Pengujian:
Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis segresi linier dari kurva kalibrasi yang di dapat dari uji linearitas. Untuk mendapat nilai batas deteksi dan kuantitasi gunakan nilai slope (b) dan simpangan baku residual (SDx).
Hasil Absorbansi Blanko:
Pengulangan ke-
Absrobansi blanko
xi-x
(xi-x)2
Ʃ(xi-x)2/(n-1)
1
0,0000
-0,00023
0,0000001
0,0000000223
2
0,0002
-0,00003
0,0000000
3
0,0001
-0,00013
0,0000000
4
0,0003
0,00007
0,0000000
5
0,0002
-0,00003
0,0000000
6
0,0004
0,00017
0,0000000
7
0,0001
-0,00013
0,0000000
8
0,0005
0,00027
0,0000001
9
0,0003
0,00007
0,0000000
10
0,0002
-0,00003
0,0000000
(xi-x)2
0,0000002
Rata-rata (x)
0,00023
SD
0,00015
b
0,10710
LOD
0,00419
LOQ
0,01395
Pembahasan :
Dari perhitungan tersebut didapat nilai LOD = 0,00419 dan LOQ = 0,01395. Dapat disimpulkan sebagai berikut :
Alat dapat mendeteksi sampel hingga konsentrasinya 0,1778 mg/L. Apabila konsentrasi sampel dibawah 0,1778 mg/L maka alat tidak dapat mendeteksi. Dan jika konsentrasinya diatas 0,1778 mg/L maka alat dapat mendeteksi tetapi presisi dan akurasinya kurang baik dan tidak dapat di pertanggung jawabkan.
Alat dapat mendeteksi sampel hingga konsentrasinya 0,5927 mg/L. Apabila konsentrasinya dibawah 0,5927 mg/L maka alat dapat mendeteksi tetapi dengan presisi dan akurasi yang kurang baik. Dan jika konsentrasinya diatas 0,5927 mg/L maka alat dapat mendeteksi dan hasilnya dapat dikuantifikasi.
