VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
PRÁCTICA 1: NEFELOMETRÍA
INTRODUCCIÓN
Se trata de un método turbidimétrico, este tipo de métodos son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo. La nefelometría en sí es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores: 1. La concentración: entre mayor sea el número de partículas, mayor es la dispersión. 2. Tamaño de la partícula: es afectada por factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza iónica. 3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están coloreadas, se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la absorción del medio se reduzca al mínimo.
OBJETIVOS
Conocimiento de métodos turbidimétricos así como la preparación del nefelómetro de McFarland.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
ESCALA MCFARLAND
En el caso de la microbiología, se utiliza el nefelómetro de McFarland como punto de referencia para estimar la población de M.O. presentes en una muestra. La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido sulfúrico, y se trata de una serie de tubos que contienen en su interior cantidades distintas de cloruro de bario y ácido sulfúrico, y que se ordenan de menor a mayor concentración, por lo que al final de cuentas se obtiene una escala de referencia relativa a la turbidez. La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón, es decir, una vez preparado el nefelómetro, se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina, en el momento en que nuestra suspensión sea visualmente igual a nuestro tubo de referencia, tendremos la concentración buscada. La finalidad de las comparaciones entre las suspensiones microbianas y el nefelómetro, es establecer una relación entre una precipitación química y la suspensión propiamente dicha. Las comparaciones son aproximadas, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados, etc.
MATERIALES Y REACTIVOS
H2SO4 al 1% 250 ml. BaCl2 al 1% 250 ml. 10 tubos de ensaye con tapones de rosca.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. METODOLOGÍA
CONCLUSIÓN Esta práctica es de suma importancia para nosotros, pues el nefelómetro preparado lo utilizaremos de aquí en lo sucesivo, como referencia para la preparación de suspensiones microbianas en prácticas posteriores, por lo que fue de vital importancia poner mucha atención en la preparación de los tubos.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. ANEXOS 1. ¿Cuáles son los métodos directos más utilizados en el recuento de microorganismos?
Camara de recuento Petroff- Hauser. Consiste en un portaobjetos especial con una graduación y medidas concretas. Se cuenta al microscopio el número de células en las celdillas del portaobjetos. Contadores electrónicos de partículas. Se pasa una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que pasa por un orificio una partícula, se interrumpe la corriente, lo que es recogido en un sistema de registro electrónico, que detecta número y tamaño.
2. ¿Qué es lo que representa UFC y cuál es su importancia? UFC: unidad formadora de oclonias, se entiende como una célula capaz de dar origen a una colonia en un lapso de tiempo en condiciones favorables. Su importancia es al hacer recuento de M.O. en placa, los resultados se dan en UFC y no como número de M.O. Es sin embargo una medida estimada, pues no es posible asegurar que cada colonia procede de una célula individual, es por eso que se deben desagregar las agrupaciones de células antes del recuento. 3. ¿A qué se refiere la técnica del número más probable? Se utiliza para estimar densidades de poblaciones de M.O. se basa en determinar la presencia o ausencia de algún atributo particular de los M.O. en diluciones consecutivas. El estimado de densidad se obtiene según el patrón de ocurrencia utilizando una tabla probabilística. 4. Citar ejemplos de métodos para recuento microscópico. Cámaras de recuento de Newbaver. Contador electrónico de partículas. Cámara de recuento Petroff-Hausser.
BIBLIOGRAFÍA
Atlas, R. M. Microbiología, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introducción a la microbiología I y II. Editorial Reverte S. A.
Prescott- Harley- Klein. Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill. Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biología de los microorganismos. 8ª
edición Prentice Hall Iberia España. Pelczar y Col. Microbiología general. Editorial Mc. Graw Hill.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
PRÁCTICA 2: INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTE DE LOS MICROORGANISMOS (AGENTES FÍSICOS)
INTRODUCCIÓN Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, los microorganismos sufren los cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que los organismos eucariontas. A lo largo de miles de millones de años, las bacterias han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Es importante para las personas que trabajan con microorganismos, al cual está indisolublemente ligado el trabajo experimental en laboratorio, conocer y tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que pueden: 1. modificar la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2. condicionar la distribuición de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats naturales; 3. permiteir a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para: a. la mutagénesis, b. la esterilización y desinfección, c. la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Agentes físicos Temperatura Desecación Radiaciones Ondas sonoras Presión hidrostática Presión osmótica
Agentes químicos Desinfectantes y antisépticos Quimioterápicos de síntesis Antibióticos
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
Efecto de la temperatura.
La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales: Temp. mínima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temp. máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento Temp. óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo). Diferentes especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de 30 a 37·C, la mayor parte de la termófilas entre 50·C y 60·C. La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la temperatura óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del huésped es óptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente. El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie. Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando son expuestos a una elevación súbdita en la temperatura por arriba de la óptima para el crecimiento. Al parecer estas proteínas son resistentes al calor y estabilizan a las proteínas de la célula sensible al calor. Las bacterias también exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la muerte de las células por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90% de las células Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:
periodo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura; tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D); punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).
2.1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS
MATERIAL
Mechero Asa Marcador Termómetro Gradilla 2 pipetas de 1.0ml 10 tubos de 16×150, con 5.0ml de sol. Salina 0.85% estériles 1 tubo de 16×150 2 cajas de petri con agar nutritivo Baños maría a las sig. Temperaturas: 50, 60, 70, 80, y ebullición. Cultivos de 24 hrs. De escherichia coli y stapylococcus aureus.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Identificar cada baño maría con su temperatura 2. En una gradilla, colocar los tubos con soluciones salinas, etiquetar cada tubo, anotando lo temperatura y el nombre del microorganismo 3. Dividir la parte extrema de las dos cajas de petri en seis partes iguales con un marcador. Marcar los segmentos con: T (testigo), 50, 60, 70,80, y ebullición.
4. Inocular 5 tubos con E. Coli y 5 con Staphylococcus, para ello, con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml del cultivo a cada uno de los tubos que tienen SOLUCION SALINA AL 0.85% y homogenizar. Repetir el procedimiento con el segundo cultivo. 5. Tomar una asada de E. Coli y en una de las cajas de siembra por estría recta en el segmento marcado con una T, empezando por el borde extremo. Repetir el procedimiento en la segunda caja con B Staphylococcus. 6. Colocar en baño maría un tubo de cada cultivo, introducir un tercer tubo que contenga agua de la llave y colocar en este el termómetro.
7. Dejar calentar y esperar a que el agua del tubo alcance la temperatura de 50°C, mantener esta temperatura durante 10 minutos 8. Sacar los tubos y sombrar cada microorganismo en la caja y segmento correspondiente. 9. Repetir los incisos 6 y 7 con los otros tubos, a 60, 70, 80 y ebullición y sembrar los segmentos correspondientes. 10. Incubar las cajas en posición invertida a 37°C durante 48 horas. 11. Efectuar las observaciones y registrar las observaciones en una tabla.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. CALCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS 1. Observar sus cajas e indicar a partir de que temperatura no se registro desarrollo. 2. Indicar cuál es la temperatura que corresponde al punto térmico mortal
E. Coli:
S. Aureus:
3. Comparar sus resultados obtenidos con los de sus compañeros e indicar si el punto térmico mortal es igual para los microorganismos estudiados. Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:
E. Coli
S. Aureus
CONCLUSIONES En esta práctica determinamos la temperatura mínima que puede matar a todas nuestras bacterias, pero no sólo eso, al trabajar con diferentes temperaturas, en los resultados pudimos observar de cierta forma la cinética del crecimiento microbiano, pues se observa primeramente un crecimiento gradual hasta la que tentativamente es la temperatura óptima (que fue aquella dónde se obtuvo mayor crecimiento), y cómo después de ese punto, el crecimiento decrece o ya no se obseva. Fue importante pues esto nos permite tener una idea de bajo qué condiciones de temperatura podemos manipular esas bacterias, trabajar con ellas, o al contrario, que temperatura debemos utilizar para estar seguros que estamos libres de ellas.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
ANEXOS. 1. ¿Cómo se dividen los M.O. de acuerdo a la temperatura a la que se desarrolla? TIPO PSIC.OBLIGADA PSIC.FACULTATIVA MESOFILA TERMOFILA HIPERTERMOFILA
MINIMA -5-5 0 15-20 45-55 60-70
OPTIMA 10-15 20-30 20-45 55-65 80-90
MAXIMA 20-22 35 45-47 80 100-113
2. ¿Explicar a que se refieren las temperaturas cardinales? La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales: Temp. mínima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temp. máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento Temp. óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo).
3. ¿Cuál es la importancia de determinar la temperatura máxima de desarrollo? 4. ¿Qué indica el término punto térmico mortal? es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).
2.2. DETERMINACIÓN DEL PERIODO TÉRMICO MORTAL
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS Material Mechero Asa Marcador
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
Termómetro Gradilla 2 pipetas de 1 ml. estériles 4 tubos de 16 x 150, con 5 ml. de solución salina 0.85% estériles 1 tubo de 16 x 150 4 cajas de Petri con agar nutritivo 2 baños María, uno a 60 °C y otro a ebullición Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA MÉTODO 1. Identificar cada baño María con una temperatura y poner a calentar. 2. Colocar los tubos con solución salina estéril en una gradilla y etiquetar cada tubo, anotar el tiempo de exposición y el nombre del microorganismo. 3. Dividir la parte inferior externa de la caja de Petri en seis partes iguales, con un lápiz graso. Marcar los segmentos con C (control), T (testigo), 5, 10, 20 y 30 minutos. 4. Con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml. de cultivo. Inocular dos tubos con cada microorganismo. 5. De uno de los tubos con E. coli, tomar una asada y sembrar por estría recta en la caja correspondiente y el segmento marcado con la T, empezando por el borde externo. El segmento marcado con una C servirá como control de esterilidad del medio. 6. En la segunda caja repetir con Staphylococus. 7. Introducir en el baño de agua a 60 °C los dos tubos con cultivos de E. coli y Staphylococus y con un tubo con agua de la llave, colocando en éste un termómetro, esperar a que en el interior del tubo se alcance la temperatura indicada y mantener los tubos sumergidos durante 5 minutos. 8. Al término de este tiempo tomar una muestra de cada cultivo y en la caja y segmento correspondiente sembrarla por estría recta. 9. Introducir rápidamente los tubos en el baño de agua y continuar calentando y repetir el paso 8 después de 10, 20 y 30 minutos de calentamiento. 10. Hacer lo mismo con los otros dos tubos que se calentaran a ebullición durante 5, 10, 20 y 30 minutos. 11. Incubar las cajas en posición invertida a 37 °C 12. Efectuar sus observaciones y registrar sus resultados en la tabla correspondiente. CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS. 1. Ejemplificar una curva típica de desarrollo.
VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O. 2. Indicar el tiempo y temperatura a las cuales no se registró desarrollo microbiano. 3. Cuáles son las T° y tiempos establecidos para destruir cada uno de los M.O. estudiados. 4. Con base a los resultados de grupo indicar que M.O. son más resistentes al calor. Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:
E. Coli
S. Aureus
CONCLUSIÓN Esta práctica pudimos determinar el periodo térmico mortal, a diferencia de la práctica anterior, aquí no varió la temperatura, sino el tiempo al que la muestra se sometió a una sola temperatura determinada. De esta manera pudimos observar que al pasar este tiempo de exposición, la población de bacterias disminuye gradualmente, hasta cesar su desarrollo.
BIBLIOGRAFÍA
Atlas, R. M. Microbiología, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introducción a la microbiología I y II. Editorial Reverte S. A.
Prescott- Harley- Klein. Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill. Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biología de los microorganismos. 8ª
edición Prentice Hall Iberia España. Pelczar y Col. Microbiología general. Editorial Mc. Graw Hill.
