PRÁCTICA PROFESIONAL Final

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Escuela de Ingeniería en Biotecnología

INFORME DE PRÁCTICA PROFESIONAL

Identificación: Nombre estudiante: Sebastián Andrés Silva Pino Carrera:: Ingeniera en Biotecnología. Carrera Biotecnología. Institución donde realizó la práctica: Centro Regional de Investigación (CRI) La Platina (INIA) División/Departamento/Unidad o Área: División/Departamento/Unidad Biotecnología y Mejoramiento Genético. Supervisor Directo: Nombre: Dr. Patricio Hinrichsen Ramírez Cargo: Investigador. Bioquímico, Bioquímico, Dr. Genética de plantas y animales Duración de la práctica 1 Semestre Fecha de inicio: 14 de marzo 2011 Fecha de término: 8 de Julio 2011 1


Índice Antecedentes de la institución: ................................................................................................................ 3 Descripción del tipo de institución, misión, objetivos, estructura organizacional, infraestructura y principales actividades o temas a los que se dedica ............................................................................ 3 Estructura Organizacional. .................................................................................................................. 4 Descripción de la División/Departamento o unidad especifica en la cual se desempeñó como estudiante en práctica (si corresponde). .............................................................................................. 5 Antecedentes del tema o proyecto. .......................................................................................................... 5 Título del proyecto, tema o actividad asignada. .................................................................................. 5 Objetivos............................................................................................................................................. 6 Descripción detallada de las actividades realizadas ............................................................................ 6 Resultados/conclusiones: autoevaluación del cumplimiento de los objetivos .................................. 10 Descripción de la organización interna del equipo de trabajo ............................................................... 15 Conocimientos aplicados....................................................................................................................... 16 Nuevos conocimientos adqueridos. ....................................................................................................... 16 Principales fortalezas y debilidades respecto de conocimientos de su formación profesional. ............. 17 Perspectivas profesionales..................................................................................................................... 17 Referencias. ........................................................................................................................................... 18

Tablas y Figuras Tabla 1 Listado de Muestras y cuanntificacion RNA ............................................................................ 10 Fig 1 Gel Integridad RNA ..................................................................................................................... 14 Fig 2 Gel Integridad RNA ..................................................................................................................... 14

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Antecedentes de la institución:

Descripción del tipo de institución, misión, objetivos, estructura organizacional, infraestructura y principales actividades o temas a los que se dedica

El Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) de Chile es el organismo estatal de investigación y desarrollo agropecuario siendo una corporación de derecho privado y dependiente del Ministerio de Agricultura. Cuenta con 10 Centros Regionales de Investigación uno de ellos La Platina. El Centro Regional de Investigación (CRI) La Platina, misión a partir del año 2001 realizar investigación principalmente en las áreas hortofrutícolas y del medio ambiente para la Región Metropolitana y zona central del país, debido a que en la RM se concentra cerca del 50% de la hortalizas y frutales, alrededor del 40% de la población urbana del país y en donde se genera cerca del 20% del PIB nacional y un 22,5% de las exportaciones primarias del país. Las principales actividades de investigación se dirigen al manejo agronómico de las especies, utilizando nuevas variedades para mejorar la competitividad, racionalizar el uso de agua para el riego, manejo de plagas análisis de madurez y calidad, en las cuales la biotecnología se utiliza como una importante herramienta al quehacer de la investigación. Así, a través del desarrollo de proyectos con fondos concursables del estado y convenios con el sector privado, publicaciones científicas, seminarios, cursos de capacitación, soluciona problemas tecnológicos que abarcan el área geográfica central y aporta tecnologías específicas a ciertos rubros o empresas. (1)

Para desarrollar las actividades, La Platina, cuenta las siguientes instalaciones, las cuales se ubican en Santa Rosa 11610 - La Pintana – Santiago. 3


-

Laboratorio de cultivo de tejidos y micropropagación. Laboratorio de biología molecular. Laboratorio de poscosecha. Invernaderos de alta seguridad para el trabajo con especies transgénicas.

-

Cámaras de cultivo climatizadas.

-

Colecciones vivas de germoplasma y de material segregante.

-

Banco de germoplasma para la conservación de semillas.

Estructura Organizacional.

La estructura organizacional del Centro Regional de Investigación (CRI) La Platina (2): Ricardo Vial Ortiz Secretario Regional Ministerial de Agricultura de la Región Metropolitana. Guido Herrera Director Regional. Arturo Campos Subdirector Regional de Investigación y Desarrollo. Jaime Del Canto Subdirector Regional de Administración y Finanzas. Patricio Hinrichsen Investigador.

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Descripción de la División/Departamento o unidad específica en la cual se desempeñó como estudiante en práctica (si corresponde).

El departamento de Mejoramiento Genético y Biotecnología se creó con el propósito de ofrecer soluciones tecnológicas de clase mundial en el ámbito de la producción hortofrutícola, con la idea de desarrollar tecnologías que permitan mantener y aumentar la competitividad de la hortofruticultura chilena, agregándole valor a la producción primaria, generando nuevas variedades de mayor productividad y que satisfagan las demandas por calidad de parte de los consumidores. Ello implica generar variedades y tecnologías que estén orientados a dar sustentabilidad a la producción, a bajar los costos, a minimizar el uso de agroquímicos y, en general, a mejorar la calidad de los productos que llegan al consumidor (3). El mejoramiento genético incluye diversas disciplinas como el cultivo de tejido para micropropagacion, la genómica, uso de marcadores genéticos moleculares, desarrollo de variedades transgénicas, caracterización de plagas, en especies de importancia para la zona como la vid, cerezos, tomates zapallo y porotos.

Antecedentes del tema o proyecto.

Título del proyecto, tema o actividad asignada.

Se me asigno trabajar junto a un tesista de doctorado dentro del proyecto: Estudios de expresión de genes relacionados al metabolismo de giberelinas en segregantes de uva de mesa con fenotipos contrastantes para tamaño de baya, para el cual se necesita la extracción de 420 muestras de RNA.

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Objetivos

El objetivo asignado fue la extracción de RNA toral de segregantes contrastantes, para poder identificas posteriormente genes involucrados en el desarrollo de la baya que se expresan diferencialmente en respuesta a la disponibilidad de Gas en la baya e identificar genes candidatos de interés y medir sus niveles de expresión mediante qPCR.

Descripción detallada de las actividades realizadas

Se trabajo con muestras obtenidas de segregantes apirenos y semillados de una población obtenida del cruzamiento ‘Ruby Seedless’ x ‘Sultanina’, seleccionando

fenotipos contrastantes para tamaño de baya, a las cuales se extrajo RNA total mediante el siguiente método. Protocolo Hot Borate para extracción UVA. Día 1 1) Encender baño termorregulador a 80°C. 2) Hacer buffer de extracción (XT + PVP + DTT + NP-40 a. Para 3 gramos de Muestra:

15mL Buffer XT 150uL DTT 1M DECP (autoclavar) 150 uL NP-40 Directo 1% 0.3g PVP en directo en molienda.

Agregar a tubos Oak Ridge de 50mL e incubar a 80°C por 10 minutos. 3) Agregar el tejido molido en nitrógeno líquido junto al PVP al tubo con el buffer caliente. 4) Vórtex por 30s.

6


5) Incubar con agitación a 42°C por 90min (optativo agregar 100uL Proteína K 20mg/mL) cada 15min agitar por inmersión suave. 6) Agregar 0.08 volúmenes (1.2mL) de KCl 2M revolviendo en hielo durante 30min. 7) Centrifugar a 12K (12.000g) por 20min a 4°C. Recuperar el sobrenadante en otro tubo. 8) Agregar 1 volumen de LiCl 4M, mezclar suavemente y dejar a 4°C O.N. o 2Hrs a temperatura ambiente. Día 2 1) Centrifugar a 20.000g por 40min a 4°C. Descartar sobrenadante. 2) Resuspender el pellet en 500uL de Agua estéril DEPC mas 50uL de acetato de sodio 3M. Transferir a eppendorf de 2mL 3) Agregar 500uL de cloroformo/alcohol isoámilico y hacer Vórtex por 30seg. 4) Centrifugar 5min a 14000 rpm a 4°C. recuperar sobrenadante en otro tubo. 5) Añadir 400uL de agua DEPC al extracto de cloroformo. Vórtex por 30seg. Centrifugar a 14000rpm por 5min a 4°C. 6) Recuperar sobrenadante y juntarlo con el 1° sobrenadante. Agregar 30uL de acetato de sodio 3M 7) Añadir un volumen de isopropanol (880mL), mezclar suavemente por inmersión e incubar en hielo por 1 hora. 8) Centrifugar 14000 rpm por 30-40min a 4°C. Debe verse pellet. 9) Lavar cuidadosamente el pellet con 400uL de EtOH 80% DEPC. Centrifugar 10min. Eliminar el exceso de etanol con una jeringa de 1mL, secar en estufa el tubo abierto por 5min. Resuspender el pellet en 30uL de agua DEPC. 10) Analizar integridad en gel de agarosa al 1%, y cuantificar en espectrofotómetro (260nm).

7


Reactivos. 0.2 Na Borato decahidratado (Borax. FW 381.4) 30mM EGTA (FW 380.4)

Buffer XT

1% (w/V) SDS 1% deoxycholate, sodium salt 1% Nonidet P-40 (igepal) 2% (w/v) PVP 0.1 (V/v) antifoam A  Optativo

Buffer XT Para disolver, agregue los componentes en agua DEPC precalentada. Ajustar pH 9.0 con NaOH 5M. Autoclavar. El DTT, NP-40, PVP y antifoam se agregan solo inmediatamente antes de usar el buffer. -

KCL 2M

-

LiCl 4M No se autoclava.

-

Acetato de Sodio 3M (CH3COONa)

-

Cloroformo/Alcohol isoamílico (1:1)

-

Isopropanol

-

EtOH 80% DEPC.

8


DTT = Ditiotreitol. Agente reductor. Rompe puentes disulforo. Permiten desplegar completamente una proteína y separar las subunidades de una multimérica PVP = Polyvinylpyrrolidone (PVP), También llamado Polyvidone, absorbe polifenoles durante la extracción de los ácidos nucleicos. También es antioxidante y agente quelante. LiCl = precipitación del RNA (mejor a bajas T°) SDS = inhibe la actividad ribonucleasa. Rompe puentes disulfuro, agente reductor. Na Borato = Remueve carbohidratos y polisacáridos, e inhibe la producción de polifenoles. Isopropanol = Precipita del RNA desde la solución con acetato de sodio. NP-40 = Nonilfenoxypolietoxyletanol = Detergente no iónico. Lisa la membrana plasmática de las células y paredes celulares. Acetato de Na = Hace mas básico el pH para mejorar la calidad del RNA e inactivar los RNAsas y DNAsas. Solubiliza el RNA, precipita proteínas separando selectivamente de otras moléculas. KCl = Sal de potasio, facilita la remoción de polisacáridos cargados positivamente. Cloroformo/alcohol isoamílico = Separa proteínas que están unidad a RNA/DNA. ETOH = Lava el RNA precipitando, ya que en el isopropanol aun quedan sales en el precipitado, pero al pasar todo al etanol, en la parte acuosa se disolverán las sales y el RNA precipitado. DECP = Dietilpirocarbonato. Inhibidor no especifico de RNAsa. Reacciona con grupos amino, hidroxi y tiol de las proteínas. No se puede utilizar con buffer TRIS o HEPES, si con PBS y MOPS.

9


Resultados/conclusiones: autoevaluación del cumplimiento de los objetivos Tabla 1 .Estado Muestra

Nombre Muestra

(C) o (S) GA3

Día Extracción

Envero

27 (clon 1)

S

Envero

27 (clon 2)

S

Envero

19 (clon 1)

S

Envero

19 (clon 2)

S

Envero

91 (clon 1)

S

Envero

91 (clon 2)

S

Envero

27 (clon 1)

C

Envero

27 (clon 3)

S

Envero

91 (clon 3)

S

Envero

19 (clon 3)

S

Envero

19 (clon 1)

C

Envero

19 (clon 2)

C

Envero

19 (clon 3)

C

Envero

91 (clon 1)

C

20-4-11 y 21-4-11 20-4-11 y 21-4-11 20-4-11 y 21-4-11 20-4-11 y 21-4-11 20-4-11 y 21-4-11 20-4-11 y 21-4-11 27-4-11 y 28-4-11 27-4-11 y 28-4-11 27-4-11 y 28-4-11 27-4-11 y 28-4-11 2-5-11 y 35-11 2-5-11 y 35-11 2-5-11 y 35-11 2-5-11 y 3-

A1 260nm

A2 280nm

A1/A2

Observaciones

OD*VC*FD

ninguna ninguna ninguna ninguna ninguna ninguna no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

10


Envero

91 (clon 2)

C

Envero

91 (clon 3)

C

Envero

27 (clon 1)

C

Envero

27 (clon 2)

C

Envero

27 (clon 3)

C

Envero

184 (clon 1)

C

Envero

184 (clon 2)

C

Envero

27 (clon 3)

S

Envero

324 (clon 1)

C

Envero

324 (clon 2)

C

Envero

324 (clon 3)

C

Envero

324 (clon 1)

S

Envero

324 (clon 2)

S

Envero

324 (clon 3)

S

Envero

359 (clon 1)

C

5-11 2-5-11 y 35-11 2-5-11 y 35-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 11-5-11 y 12-5-11

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

0,045

0,024

0,14

0,082

0,078

0,057

0,065

0,048

0,074

0,064

0,174

0,117

0,149

0,091

0,07

0,04

0,162

0,096

0,076

0,046

0,179

0,114

0,073

0,038

0,04

0,027

1,8775 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,7126 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,3648 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,3562 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,1483 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,4854 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6402 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,7809 Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6848 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6595 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,5806 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,8984 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,4509 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC

4,5

0,18

14

0,56

7,8

0,312

6,5

0,26

7,4

0,296

17,4

0,696

14,9

0,596

7

0,28

16,2

0,648

7,6

0,304

17,9

0,716

7,3

0,292

4

0,16

[RNA]ug/uL


Envero

91 (clon 2)

C

Envero

91 (clon 3)

C

Envero

27 (clon 1)

C

Envero

27 (clon 2)

C

Envero

27 (clon 3)

C

Envero

184 (clon 1)

C

Envero

184 (clon 2)

C

Envero

27 (clon 3)

S

Envero

324 (clon 1)

C

Envero

324 (clon 2)

C

Envero

324 (clon 3)

C

Envero

324 (clon 1)

S

Envero

324 (clon 2)

S

Envero

324 (clon 3)

S

Envero

359 (clon 1)

C

Envero

359 (clon 2)

C

Envero

359 (clon 3)

C

5-11 2-5-11 y 35-11 2-5-11 y 35-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 4-5-11 y 55-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 9-5-11 y 10-5-11 11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11

no

no

no

Extracciones malas

no

no

no

Extracciones malas

0,045

0,024

0,14

0,082

0,078

0,057

0,065

0,048

0,074

0,064

0,174

0,117

0,149

0,091

0,07

0,04

0,162

0,096

0,076

0,046

0,179

0,114

0,073

0,038

0,04

0,027

0,027

0,017

0,213

0,13

1,8775 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,7126 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,3648 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,3562 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,1483 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,4854 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6402 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,7809 Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6848 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6595 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,5806 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,8984 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,4509 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6397 Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC 1,6397 Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC

4,5

0,18

14

0,56

7,8

0,312

6,5

0,26

7,4

0,296

17,4

0,696

14,9

0,596

7

0,28

16,2

0,648

7,6

0,304

17,9

0,716

7,3

0,292

4

0,16

2,7

0,108

21,3

0,852

11


Envero

359 (clon 1)

S

Envero

359 (clon 2)

S

Envero

359 (clon 3)

S

Envero

184 (clon 1)

S

Envero

184 (clon 2)

S

Envero

184 (clon 3)

S

Envero

184 (clon 1)

C

Envero

189 (clon 2)

C

Envero

189 (clon 3)

C

Envero

117 (clon 1)

S

Envero

117 (clon 2)

S

Envero

117 (clon 3)

S

Envero

117 (clon 1)

C

Envero

117 (clon 2)

C

11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y

0,006

0,004

1,75

0,011

0,007

1,614

0,264

0,161

1,6414

0,018

0,014

1,2982

0,025

0,015

1,6748

0,019

0,011

1,6383

0

0,001

0,076

0,052

1,4787

0,018

0,013

1,3962

0,14

0,082

1,7134

0,085

0,07

1,2062

0,098

0,069

1,4263

0,085

0,062

1,3708

0,129

0,084

1,54

Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499

0,6

0,024

1,1

0,044

26,4

1,056

4,5

0,18

6,25

0,25

4,75

0,19

0

0

19

0,76

4,5

0,18

35

1,4

21,25

0,85

24,5

0,98

21,25

0,85

32,25

1,29


Envero

359 (clon 1)

S

Envero

359 (clon 2)

S

Envero

359 (clon 3)

S

Envero

184 (clon 1)

S

Envero

184 (clon 2)

S

Envero

184 (clon 3)

S

Envero

184 (clon 1)

C

Envero

189 (clon 2)

C

Envero

189 (clon 3)

C

Envero

117 (clon 1)

S

Envero

117 (clon 2)

S

Envero

117 (clon 3)

S

Envero

117 (clon 1)

C

Envero

117 (clon 2)

C

Envero

117 (clon 3)

C

Envero

151 (clon 1)

S

Envero

151 (clon 2)

S

Envero

151 (clon 3)

S

11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11 11-5-11 y 12-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 16-5-11 y 17-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 18-5-11 y 19-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y

0,006

0,004

1,75

0,011

0,007

1,614

0,264

0,161

1,6414

0,018

0,014

1,2982

0,025

0,015

1,6748

0,019

0,011

1,6383

0

0,001

0,076

0,052

1,4787

0,018

0,013

1,3962

0,14

0,082

1,7134

0,085

0,07

1,2062

0,098

0,069

1,4263

0,085

0,062

1,3708

0,129

0,084

1,54

0,045

0,019

2,359

0,017

0,004

4,0588

0,032

0,013

2,3853

0,102

0,059

1,7226

Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC Diluciones 2,5 + 498,5 H20 DEPC Dilucio nes 2,5 + 498,5 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499

0,6

0,024

1,1

0,044

26,4

1,056

4,5

0,18

6,25

0,25

4,75

0,19

0

0

19

0,76

4,5

0,18

35

1,4

21,25

0,85

24,5

0,98

21,25

0,85

32,25

1,29

11,25

0,45

4,25

0,17

8

0,32

25,5

1,02

21,25

0,85

1,75

0,07

3,5

0,14

8,5

0,34

6,5

0,26

28,5

1,14

14,25

0,57

32,75

1,31

6,25

0,25

12


Envero

151 (clon 1)

C

Envero

151 (clon 2)

C

Envero

151 (clon 3)

C

Envero

176 (clon 1)

S

Envero

176 (clon 2)

S

Envero

176 (clon 3)

S

Envero

176 (clon 1)

C

Envero

176 (clon 2)

C

Envero

176 (clon 3)

C

20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11

0,085

0,047

1,8104

0,007

0,003

2,4

0,014

0,001

11,2

0,034

0,015

2,3333

0,026

0,009

3,0563

0,114

0,074

1,5411

0,057

0,035

1,6307

0,131

0,077

1,6994

0,025

0,008

3,0588

H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC

Tabla 1: Resultados e identificación de las extracciones. Estadio de desarrollo, Numero de muestra y clon, Tratamiento con o sin GA3, Fecha de extracción, cuantificación espectrofotométrica (260nm) estado de pureza (razón 260/280) y concentración total medida en


Envero

151 (clon 1)

C

Envero

151 (clon 2)

C

Envero

151 (clon 3)

C

Envero

176 (clon 1)

S

Envero

176 (clon 2)

S

Envero

176 (clon 3)

S

Envero

176 (clon 1)

C

Envero

176 (clon 2)

C

Envero

176 (clon 3)

C

20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 19-5-11 y 20-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11 23-5-11 Y 24-5-11

0,085

0,047

1,8104

0,007

0,003

2,4

0,014

0,001

11,2

0,034

0,015

2,3333

0,026

0,009

3,0563

0,114

0,074

1,5411

0,057

0,035

1,6307

0,131

0,077

1,6994

0,025

0,008

3,0588

H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC Diluciones 1 + 499 H20 DEPC

21,25

0,85

1,75

0,07

3,5

0,14

8,5

0,34

6,5

0,26

28,5

1,14

14,25

0,57

32,75

1,31

6,25

0,25

Tabla 1: Resultados e identificación de las extracciones. Estadio de desarrollo, Numero de muestra y clon, Tratamiento con o sin GA3, Fecha de extracción, cuantificación espectrofotométrica (260nm) estado de pureza (razón 260/280) y concentración total medida en ug/uL.

13


Fig 1


Fig 1

Fig. 1. Gel de agarosa Mostrando Integridad RNA extraído Correspondiente a Muestras 184 Envero con sus respectivos clones y tratamiento. (S) sin tratamiento GA3 (C) Con tratamiento GA3. Fig 2

Fig. 2. Gel de agarosa mostrando integridad RNA extraído Correspondientes a muestras 112 y 117 6 -8 milímetros y sus respectivos clones y tratamiento. (S) sin tratamiento GA3 (C) Con tratamiento GA3.

14


Se extrajo eficientemente RNA total en distintas muestras de Vid, tanto en estadios de Envero como 6-8 milímetros, obteniéndose grandes cantidades de RNA en algunas muestras y teniendo problemas de integridad y concentración total en algunas muestras, esto debido a posibles altas concentraciones de fenoles, contaminación es las soluciones o mala manipulación de la muestra. En el tiempo transcurrido de mi práctica profesional, completamos un total de 80 muestras de bayas, estas completan todas las muestras del estadio Envero y una porción 6-8 milímetros. Las muestras se tendrán que analizar y corroborar si sirven para los procesos de RT-PCR, y secuenciación. Las muestras con poca concentración o que resultaron defectuosas tendrán que ser extraídas nuevamente, como es el caso e la muestra 184 C1 C (Fig. 1) en la cual no se puede observar ninguna de las subunidades del RNA ribosomal, con el cual se analiza la integridad del RNA.

Descripción de la organización interna del equipo de trabajo en el cual se desempeñó, incluyendo su propio rol dentro del grupo.

El Departamento de Mejoramiento Genético consta de un selecto grupo de científicos capacitados y que tienen un profundo conocimiento de cómo funcionan las plantas y los sistemas productivos, liderado por el Dr. Patricio Hinrichsen Ramírez. En particular, mi trabajo se centro en apoyar el desarrollo de la tesis de Doctorado de Gonzalo Ravest, con el desempeñaba mi trabajo diario, el cual consistió en preparar y efectuar el protocolo de extracción de RNA, su posterior cuantificación y análisis de integridad en geles de Agarosa.

15


Conocimientos aplicados.

-

Manejo de instrumental y técnicas de laboratorio.

-

Técnicas biología molecular.

-

Manejo en relación a la bioseguridad requerida en la preparación

-

de los distintos medios y las técnicas empleadas en el Laboratorio.

-

Calculo para la preparación de los distintos medios y soluciones requeridos durante el trabajo.

-

Manejo de datos en planilla Excel.

Indicar los nuevos conocimientos (teóricos, técnicos, administrativos) que adquirió durante el desempeño de sus actividades.

Dentro de los conocimientos adquiridos se encuentran principalmente temas que no estuvieron relacionados estrictamente con la práctica que ejercí diariamente, si no que tienen relación con el trabajo del laboratorio en general, como la generación de mapas genéticos saturados, AFLPs, y QTLs, técnicas que se realizan diariamente en el Departamento de Mejoramiento Genético y Biotecnología. Con relación a mi práctica dentro del laboratorio, los conocimientos adquiridos fueron los conceptos esenciales para poder superar problemas durante las extracciones y determinar cual son los puntos determinantes en un protocolo tan delicado como el de la extracción de RNA total, como es hacer un trabajo metódico, teniendo especial cuidado en la contaminación de los materiales con RNAas y detección de soluciones contaminadas.

16


Indicar las principales fortalezas y debilidades que percibió durante su desempeño respecto de conocimientos de su formación profesional.

Durante la práctica ejercida en el Centro Regional de Investigación La Platina, INIA, no se presento ningún inconveniente al desarrollar las actividades asignadas por el Dr. Patricio Hinrichsen y por Gonzalo Ravest. Los conocimientos técnicos otorgados durante los años de estudio en la universidad me permitieron poder ejercer sin mayores problemas los desafíos planteados en la práctica profesional. Por el contrario, una de las mayores debilidades fue encontrarme con todos los problemas logísticos que se presentan dentro de la institución, como es el caso de la burocracia para el pedido de reactivos y el retraso que estos presentan para ser entregados.

Perspectivas profesionales.

Una institución como el CRI se enfrenta a una elevada competitividad, la cual un Ingeniero en Biotecnología es obligado a enfrentarla y relacionar las actividades de investigación y difusión de tecnologías con menores costos de producción y lograr una mayor rentabilidad, de fácil acceso la sociedad, manteniendo al mismo tiempo los altos estándares de calidad, generando tecnologías limpias que conserven el medio ambiente, productos aptos para el consumo humano y cumpliendo con las exigencias del mercado internacional.

17


Referencias.

1.- Instituto de Investigaciones Agropecuarias – INIA La Platina. http://www.inia.cl/link.cgi/Platina/QuienesSomos/ 2.- Instituto de Investigaciones Agropecuarias – INIA La Platina. Directivos. http://www.inia.cl/link.cgi/Platina/QuienesSomos/814 3.- Instituto de Investigaciones Agropecuarias – INIA la Platina Departamentos. http://www.inia.cl/link.cgi/Platina/Investigacion/Departamentos/mb/ 4.- Karen E Reid, Niclas Olsson, James Schlosser, Fred Peng and Steven T Lund: An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development. BCM Plant

Biology. 2006 5.- Shinjiro Yamaguchi: Gibberellin Metabolism and its Regulation. Annu. Rev. Plant Biol. 2008.59:225-251.

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PRÁCTICA PROFESIONAL Final

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