Laboratorio de Biofísica PRÁCTICA “POTENCIAL DE ACCIÓN”
Introducción Todas las células tienen potencial de reposo en base a una diferencia iónica dentro y fuera de la célula, pero no todas tienen capacidad de desarrollar potenciales de acción. Las células excitables poseen un potencial de reposo muy estable (entre ‐60 y ‐100 mV). En las células no excitables, el potencial de reposo es menos estable, pueden haber oscilaciones entre ‐40 y ‐60 mV, está más despolarizado. En células en reposo, la permeabilidad de la membrana hacia el potasio es mayor que la permeabilidad al sodio. Estimulación, como actividad sináptica proveniente de otras células nerviosas, puede despolarizar la membrana. Los canales de sodio son sensibles a la despolarización de membrana y responden abriéndose, que resulta en un aumento en la permeabilidad de sodio. Si la despolarización excede cierto nivel (umbral), un potencial de acción es producido. Mientras la permeabilidad del sodio incrementa, la conductancia también aumenta, y esto lleva a una mayor despolarización de membrana. Con mayor numero de canales abiertos, la conductancia del sodio y la despolarización aumentaran hasta que se alcance un potencial de equilibrio para el sodio. Pero antes de que este equilibrio sea alcanzado, dos eventos importantes ocurren: los canales de sodio sensibles al voltaje se cierran pronto después de su apertura, y los de potasio se abren. Con estos canales abiertos, los iones de potasio salen de la célula y causan una repolarización (pasando por una hiperpolarización), volviendo al estado de reposo inicial (ver figura 1). La propagación del potencial de acción del sitio de inicio a otros sitios a lo largo del nervio causado por las cargas positivas en la célula, que se mueven a regiones adyacentes (no estimuladas) y despolarizando esta región lo suficiente para crear un potencial de acción. De este modo la señal se mueve de una región a otra del axón.
Figura 1. Gráfica típica de registro de un potencial de acción. La duración es de varios milisegundos y la amplitud de decenas de milivoltios.
Aspectos teóricos básicos Todas las células poseen potencial de reposo pero no todas son capaces de generar un potencial de acción. Las células excitables que generan potenciales de acción son: A. Neuronas: células nerviosas. B. Células musculares: músculo liso (vísceras internas, útero, uréteres e intestino), músculo estriado (músculo esquelético y del corazón). C. Células sensoriales: receptores de la vista y del oído. D. Células secretoras: glándulas salivales, parótida. E. Células relacionadas con el sistema endócrino: adenohipófisis, islotes de Langerhans. Las células las podemos estimular de forma: • Mecánica. Punzón • Química. Con un neurotransmisor • Eléctrica. Es la más parecida a la fisiología y mide exactamente la intensidad del estímulo que estamos aplicando a esa célula.
Para poder cumplir con los objetivos de la práctica en necesario comprender una serie de conceptos que van a ayudar a correlacionar los diferentes datos que se obtendrán a través del fisiógrafo. A continuación se da una breve explicación de cada uno de éstos. Ley de todo o nada El potencial de acción se transmite sin decremento y a largas distancias y por la ley del todo o nada, una vez alcanzada la intensidad mínima que es el potencial umbral, se dispara el potencial de acción hasta +30‐+40mV. Despolarización lenta. ‐70 mv hasta ‐55 mv Despolarización rápida. ‐ 55 mV hasta +35 mV. Repolarización rápida. + 35 mv 2/3 del descenso Repolarización lenta (hasta ‐ 70 mV) Hiperpolarización. ‐70 mV hasta ‐ 75 mV. La ley se cumple para fibras aisladas, para una fibra única, pero no se cumple cuando existen múltiples fibras nerviosas (axones)
Periodos refractarios Supone una situación de no excitabilidad de la membrana cuando una célula acaba de ser estimulada y acaba de generar un potencial de acción, el potencial de acción inmediatamente no puede generar otro. Absoluto: período de tiempo inmediatamente después de un potencial de acción en donde no hay respuesta independientemente de la intensidad del estímulo que se le aplique.
Relativo: período de tiempo después del período absoluto en donde si que hay respuesta pero sólo si se le aplica una intensidad de estímulo por encima del umbral de excitación de la célula Velocidad de conducción La velocidad a la cual un potencial de acción se propaga. La velocidad de conducción se mide conociendo 2 parámetros: 1. La distancia entre el estimulador y el registrador 2. Potencia Factores que condicionan la velocidad de conducción: a. El diámetro de la fibra. A mayor diámetro, mayor velocidad de conducción. Existe una relación entre el incremento del diámetro y en incremento de la velocidad de conducción. b. La temperatura. La velocidad de conducción se eleva progresivamente al elevar la temperatura, desde 5ºC hasta 40ºC, a partir de los 40ºC se estabiliza. Si se superan los 45ºC hay un bloqueo de la conducción nerviosa y como consecuencia la muerte, por eso es tan importante controlar la temperatura del organismo. Una fiebre que supere los 40ºC se debe bajar porque podría causar daños irreversibles en el sistema nervioso. c. La edad de la fibra. La velocidad de la fibra es mayor en función de la edad y se detiene manteniendo una velocidad fija cuando se llega a la pubertad.
Objetivos Registros extracelulares de potenciales de acción a partir de una lombriz de tierra anestesiada (Lumbricus ssp.). Diferenciar entre la respuesta todo o nada de un axón simple y la sumación espacial o reclutamiento de un conjunto de fibras. Determinación de la velocidad de conducción en un nervio dado. Entender la naturaleza bidireccional de los potenciales de acción. Materiales y Método Preparado del espécimen (Lombriz de tierra) Para anestesiarla se coloca en una caja petri, la cual se llena con suficiente solución de etanol y de Ringer, hasta cubrir por completo al organismo. El tiempo necesario para que la lombriz se deje de mover varía alrededor de 5 minutos. Si la lombriz no reacciona al tacto esta lista para los experimentos, si sigue reaccionando dejarla en la solución unos cuantos minutos más. La lombriz se coloca en la charola de disección (a partir de este paso véase figura 2). La lombriz debe ser manipulada cuidadosamente, cuidando de no estirarla demasiado (esto podría dañar las fibras nerviosas). Se
utilizan tres alfileres para fijarla, dos para cada uno de los extremos y un último alfiler a 10‐15 mm del extremo anterior (este extremo es el que se encuentra más cerca del clitelo). Para mantener anestesiado el organismo se rocían algunas gotas de etanol/solución Ringer a lo largo del cuerpo fusiforme con una jeringa. El exceso de solución a los lados del cuerpo se elimina con papel secante. Demasiada solución podría interferir en los experimentos. Conectar los electrodos estimulantes a los dos alfileres del extremo anterior. En el primer alfiler el cable positivo (ánodo) y después el negativo (cátodo). Colocar los cables de plata a lo largo del cuerpo, con los extremos clorados en contacto con el cuerpo. Estos cables van conectados a los siguientes cables: primero el cable que hace tierra, después a 10 mm el cable blanco (R1) y a otros 10 mm el cable negro (R2). Estar seguros de que ningún cable esta en contacto con otro cable.
Figura 2. Se muestran cada una de las posiciones de los alfileres y cables necesarios para realizar mediciones acertadas. Estar seguros de que ningún cable esta en contacto con otro cable, esto afectaría las mediciones.
Ejercicio 1: Voltaje umbral Revise la lombriz constantemente para asegurarse que no se esta secando o moviendo. Si esto ocurre colocar unas gotas de etanol/solución de Ringer con una jeringa. Remueva el exceso de líquido con papel secante. En el panel de estimulo revise que el voltaje esté programado a 0.2 V. Presione START. Después de un retraso de 2 ms el aparato estimulará el nervio y grabará su comportamiento por un tiempo de 25 ms. Si no observa alguna respuesta, incremente el voltaje a 2 V y presione START. En caso de no obtener respuesta incremente el voltaje a 3 V. Una vez que obtenga una respuesta al estímulo, reduzca el voltaje a la mitad y vuelva a presionar START. En caso de obtener una respuesta, vuelva a reducir el voltaje a la mitad y presione START. En caso de no obtener una respuesta incremente el voltaje 0.05 V cada vez, hasta obtener una respuesta presionando START cada vez que se cambie el voltaje.
El voltaje al cual se obtenga la primera respuesta es conocido como el voltaje umbral. Confirme esto disminuyendo el voltaje 0.05 V cada vez y verá cómo desaparece el potencial de acción. Nota: Es posible que encuentre una fuerza de estímulo que genere una respuesta intermitentemente. Esto es normal. El umbral se define como la fuerza del estímulo que da una respuesta el 50% de las veces. Análisis. Seleccione los valores que mejor demuestren el voltaje umbral. Arrastre el marcador del inicio del artefacto de estímulo, mueva el cursor al inicio de la respuesta y dé clic para transferir el Δ en el tiempo al panel de valores.
Ejercicio 2: Velocidad de conducción En este experimento, se registrarán los potenciales de acción de dos sitios diferentes a lo largo de la lombriz para determinar la velocidad de conducción de los impulsos nerviosos. Sitio proximal de registro En el panel de estímulo colocar la amplitud de estímulo por arriba del valor umbral para las fibras laterales gigantes. Esto debe asegurar que las dos fibras están siendo estimuladas verdaderamente. Presione START. Incremente el estímulo si es necesario, presionando START cada vez, hasta obtener respuesta de ambas fibras, la media y la lateral. Añadir en la casilla de COMMENT ‘DISTANCIA 1’ a este registro para posterior análisis. Usar una regla para medir la distancia entre el cátodo (electrodo negativo) al electrodo de registro más cercano (R1). Registre este valor como la distancia 1 en la tabla. Sitio distal de registro Cuidadosamente cambie los dos electrodos de registro de manera que queden más cerca de la parte posterior de la lombriz, manteniendo una separación entre ellos de 5 a 10 mm. Si su lombriz es lo suficientemente grande, intente cambiarlos a una distancia de por lo menos unos 30 mm. Presionar START. Si es necesario incremente la amplitud de estímulo hasta que observe respuesta de las fibras lateral y media. Añadir a la casilla de COMMENT ‘DISTANCIA 2’. Medir con una regla la distancia entre el cátodo y el electrodo de registro más cercano. Registre este valor como la distancia 2 en la tabla. Periodo de latencia Seleccionar un registro apropiado para ¨DISTANCIA 1¨. Colocar el marcador al comienzo del artefacto de estimulo. Mover el cursor al comienzo de la respuesta de la fibra media y transferir el valor de tiempo Δ al panel de valores. Colocar el valor en la tabla de datos de Velocidad de conducción. Seleccione un registro apropiado para la DISTANCIA 2 y repetir los pasos indicados en el párrafo anterior.
Cálculos El artefacto de estímulo se acciona en el momento que se presenta el estímulo. El retraso entre el artefacto de estímulo y la respuesta del impulso nervioso refleja el tiempo que toma al potencial de acción llegar del cátodo al electrodo en donde se capta. La fórmula para calcular la velocidad de conducción es: Velocidad de conducción= Distancia / Tiempo Si la distancia es medida en milímetros y el periodo de latencia es dado en milisegundos, la unidad de velocidad será mm.ms‐1= m.s‐1, es decir metro por segundo. Para calcular la velocidad de conducción por el método absoluto, se usa una sola distancia y su periodo de latencia correspondiente: Velocidad de conducción= D1/PL1 (o D2/PL2) Para calcular la velocidad de conducción por el método diferencial se utiliza la siguiente ecuación: Velocidad de conducción= (D2‐D1)/(PL2‐PL1)
Ejercicio 3: Periodo Refractario En esta parte del experimento se le darán 2 estímulos al nervio, disminuyendo progresivamente el intervalo entre ellos cada vez que se estimule. En el panel del estimulador coloque la amplitud de los estímulos aproximadamente a la mitad entre los valores de umbral de ambos nervios utilizados durante los experimentos pasados (Ejercicios 1 y 2). Esto asegura que sólo la fibra media será estimulada. Coloque el intervalo entre estímulos en 10 ms. Presione START. El programa estimulará dos veces al nervio con el intervalo seleccionado. Se espera observar dos artefactos de estímulo, cada uno seguido por una respuesta. Repita el procedimiento del párrafo anterior, disminuyendo el intervalo 1 ms cada vez. Análisis: examine sus datos, note que no se observa una respuesta total del potencial de acción después de que haya sido estimulado completamente.
Ejercicio 4: Reclutamiento de fibras individuales En este ejercicio se intentará estimular a todas las fibras que conforman el nervio hasta encontrar la amplitud máxima del potencial de acción del nervio. Coloque la amplitud del estímulo en el valor umbral, presione START y determine en la gráfica el valor de la amplitud del potencial de acción. Estimule incrementando el voltaje de estímulo en 0.5 V y registre la amplitud del potencial de acción cada vez, hasta llegar al punto en el que todas las fibras hayan sido estimuladas y ya no exista un incremento en la respuesta.
Realice una gráfica de la amplitud del potencial de acción vs. intensidad del estímulo. Determine la Amplitud Máxima del Potencial de Acción y la intensidad eficaz 50 (que es la intensidad a la que el 50% de las fibras del nervio han sido estimuladas).
Ejercicio 5: Bidireccionalidad Desconectar el cátodo y remover el alfiler de la lombriz. Colocar este alfiler en la parte posterior, como se muestra en la figura. Mover el ánodo a la parte posterior también. Reconectar las conexiones para que el estímulo esté al final de la cola. En el panel, poner la amplitud del estímulo por abajo del umbral de la fibra gigante mediana. Presionar START. Seguir incrementando la amplitud del estímulo en pasos de 0.05V, presionando START cada vez, y notar una respuesta de la fibra media, y después (con suficiente intensidad del estímulo) de la fibra lateral. Análisis Examinar los datos. ¿El potencial de acción se presentó como las veces anteriores? Si no es así, describir los mecanismos detrás de estos resultados.
Referencias ADInstruments. 2006‐2007. LabTutor Experiments.
