SOBRE EL ACTO JURÍDICO. REQUISITOS DE VALIDEZ DE LAS CONVENCIONES. LAS NULIDADESFull description
Descripción: Psiclogia II
Descripción completa
metalurgi fisik2Deskripsi lengkap
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Descripción: practica
Prá ctica II: ESTUDIO
ES PECTROFOTOMÉ TRICO Y ESP ECTROF LUORIMÉTRICO E LA
TRANSICIÓN AL CALINA DEL CIT OCROMO C
Intro ducción
El c tocromo c humano, es una pr oteína que juega un doble pap el en diferentes com partimentos
celulares . Por un a parte,
transfiere electrones en la ca dena respiratoria mitocondrial y por otra actúa como induct or de la apoptosis en el citoplasma. En el intervalo de pH de 1 a 1, el citocromo c o!idado e!hibe al m enos
cinc conformaciones diferentes debidas a cambios en los ligandos a !iales del grupo hemo y"o al propio plegamiento de la proteína.
#a transici$n alcalina del citocromo c supone la sustituci$ n de la metionina %& como ligando a!ial del grupo hemo por una lisi na, fen$meno que puede se uirse espe ctrofotom'tricamente (observand o la banda
de absorc i$n a )** nm+ a r!"i#trar !#$! ctro# !ntr ! %&& ' ()& n*. El estudio de este cambio estructural, que p odría
tener un efecto directo so bre la funci$ n de la proteína se m uestra como ejemplo e las múltiples aplicaciones de l as t'cnicas espectrofotom'tricas.
Figura 1. Esqu emas de los ligando s del gru o hemo (parte supe rior) y modelos estru cturales (p arte inferi r) del ferricitocromo c en el e tado III (A ), en el estado alcalino (estado IV) (B) y n el estad o V o desplegado () (!omado d e "erroud et al.
"#A$ %&&', 1&% 1'&*1 ''),
La $ráctica
En sta prctic a, el obje ivo es determinar el pH al qu se produ ce la tran sici$n
alcalina de cito cromo c, reali-ando medidas de bsorbancia a )** nm variando el pH de la muestra problema.
Mat! ria
/uestra de citocromo c de cora-$n de caballo a 0&& / en tamp$n fosfato 2 m/ a pH ).2.
3isoluci$n ferricianuro 2& m/ 3isoluci$n de 4a5H &.1/ 3isoluci$n de H6l &. / 7ir s indicadoras de pH
8 9idrios de reloj (para depositar tro-os de 2 mm de tiras de pH+ 8Par afilm (me-clar reactivos en la cubeta por inv ersi$n, no a gitar+
Proc !di*i!nto
+ Pro gramar el espectrofot $metro en modalidad de espectro (scan+, con un rango entre :2& nm y )&& nm, una e scala en el eje ; (bsorbancia+ entre & y &.2 y mod lidad <59 E=#;> o ?@PE=P5 ?A6AB4 3E E?PE67= 5? (7ecla )+, para ir acumuland o los disti tos espectros y visuali-ar así mejor la trans ci$n.
+ Hacer un blan co muestr omitida (s in cit c+ con **) C# d e tamp$n fosfato y D Cl de ferric ianuro. =eali-ar un e s pectro entre )&& y :2 & nm 7E6 # F1 (65 ==E66AB4 3E #G4E 3E ?E+. 3e esta forma se s alva y alm acena este espectro c omo blanco para
que el espect rofot$metro lo sustra iga de la s medidas posteriore s con mu estra
(cito cromo c+.
+
Par a mantener el citocro mo c totalm ente o!ida do, aIadir
la muestr a de citocro mo c
(pipe tear **) C en la cube ta reducid de plstico+ D l de l a disoluci$ n de ferricia nuro, de m anera que la concent aci$n final ser && / de ferric anuro y el volumen fin al de mue stra 1m#. / e-clar la m uestra por inversi$n t apando con un Parafil m la cubeta.
8 =egistrar el e spectro de absorci$n entre )&& :2& nm ( 5J5 @7A#AK= # /A?/ 6@E7 L@E P= E# #465MMM+. conti nuaci$n, teclear el bo t$n de cursor y desp la-arse co n 'l hasta N O )** nm. /edir )** nm de la muestra probl ema a pH ).2.
8 dicionar la c ntidad de 4a5H propuesta en la tabla a con tinuaci$n, comprobar el pH
y re
istrar de uevo el e specto y lu ego la )* * nm de la muestra.
86o mprobar q ue el pH es el corre cto pipete
ndo D Cl de la mue stra depositada en l a cubeta sobre una tira indicad ora de pH . Evaluar visualmente con la
ama de colores del indicador que el pH es coherente. = eali-ar estas comprobaciones s$lo a los valores de pH ind icados en la 7abla siguiente.
8 =epetir el paso anterio a los pH : % * *. *.D *.) *.% 1& 1&.2 11.
8 =epresentar las absorbancias medidas frente al pH y determinar el pH al que se produce la transici$n alcalina.
8=eali-ar espectros de emisi$n de fluorescencia intrínseca del citocromo c a pH ).2 y pH 11 para evaluar cambios conformacionales en la proteína inducidos por el pH (Ne!c O *2 nm N em O 01&8D&& nm+. El citocromo c de cora-$n de caballo tiene 1 7rp y D 7yr.
R!,!r!ncia#
Perroud et al. P4? @? 1&, D* (&&2+ 1:2:&Q1:2:2.
Rarcía8Heredia et al. iochimica et iophysica cta 1:*: (&1&+ *%1Q**0.
Folding of Horse 6ytochrome c in the reduced state. huyan .S. y
@dgaonTar, J.. Journal of /olecular iology 01 (&&1+ 1102811)&.
