Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación Universidad Nacional Del Perú Facultad de Medicina Humana Escuela profesional de Enfermería Practica de Laboratorio # 3
Cromatografía
ASIGNATURA:
BIOQUIMICA
DOCENTES:
DRA.VIOLETA MORIN GARRIDO DR. CARLOS HOLGUIN MAURICCI
ALUMNA:
FIORELLA DIOSESFERNANDEZ
Piura - 2015
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MARCO TEORICO
Cromatografía: La cromatografía es uno de los principales métodos para la separación de especies químicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
Funciones: Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis). Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.
Tipos de cromatografía: Dependiendo de la naturaleza de la fase estática y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía: Cromatografía sólido-líquido. La fase estática o estacionaria es un sólido y la móvil un líquido. Cromatografía líquido-líquido. La fase estática o estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido. Cromatografía líquido-gas. La fase estática o estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas. Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas. Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre. Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar. Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas. Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil.
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PRACTICA DE LABORATORIO Cromatografía Es un método analítico de separación de sustancias de una mezcla, estas sustancia puede ser colorada, o no, gases y compuestos volatilizables. Partes del sistema cromatógrafo 1. Fase fija: es la parte donde se realiza la separación del componente, puede ser papel silicagel, gas inerte, etc. 2. Fase móvil: es el solvente que a través de la fase fija va a eludir arrastrando con el soluto que se quiere separar. Características para la separación: 1. 2. 3. 4.
Peso del soluto. Polaridad del soluto y del solvente. Afinidad al soluto por la parte fija Coeficiente de participación.
Fase de la cromatografía 1. Extracción: procesamiento de la muestra para extraer el principio activo por método físico: Mecánico y solubilidad. 2. Concentración: aplicación solvente orgánico volátiles. 3. Cromatograma: poner la muestra para su recorrido a través de la fase fija 4. Revelado: usar sustancia patrones, densitómetro y reactivo apropiado. Tipos de cromatografía 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Cromatografía de papel (mono y bidimensional) Cromatografía capa fina Cromatografía de gas. Cromatografía de participación o reparto Cromatografía de exclusión molecular Sphadex Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de columna Cromatografía por electroforesis Cromatografía de exclusión molecular.
Precipitación isoeléctrica La solubilidad de la mayor parte de proteínas globulares se halla profundamente influida por el pH del sistema, casi todas las proteínas muestran un minino de solubilidad aunque el pH al que ello ocurre varia de una a otra. El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoelctronico definido como aquel valor del pH al que la molécula no posee carga eléctrica. Ejemplo: Ovoalbumina (huevo) , pH 4.6 , ureasa pH 5 en esas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas agregados insolubles. Puesto que las diferencias proteínas poseen valores de pH isoeléctrico diferente, con frecuencia pueden separarse una de otra, mediante precipitación
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isoeléctrica, cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de uno de sus componentes. La mayor parte o casi todo el componente precipitará quedando solución de proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico precipitado permanece en su conformación nativa y puede disolverse en un media a pH apropiado y concentración adecuada.
PRIMER PARTE METODOS CROMATOGRAFICPS Y DE SEPARACION DETERMINACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS.
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LA
1. DISEÑO EXPERIMENTAL a. Cromatografía en papel Les será dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15*25 cm aproximadamente, manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo en lo posible, colóquelo sobre un papel limpio. Engrape, un hilo a la parte superior del papel Whatman. Con un lápiz marque el punto de origen, trazando una línea, esta debe estar por encima de la altura de solvente. Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestra según el esquema (no toque el papel con los dedos)
NOTA: Para aplicar la muestra tocar el papel levemente con el tubo capilar puesto verticalmente. Retire el tubo cuando la mancha halla alcanzando unos 3 mm. De diámetro. Una vez seca la mancha repetir la aplicación dos veces más.
Coloque el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede sumergido 1 o 2 cm. En el solvente. Dejar el papel en posición rectal asegurando los hilos a los lados de la cinta adherida. Una vez que la muestra haya corrido, sacar el papel y marca el límite de migración de frente del solvente. Secar los papeles en un horno. Rociar una solución reveladora, Ninhidrina –colina-ácido acética glacial. Calentar el papel en un horno a 100°C hasta que aparezcan las manchas de los aminoácidos. Calcular el Rf de cada mancha, y haga la identificación tentativa de los aminoácidos, comparando los Rf, obtenidos con la muestra problema.
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2. EXPERIMENTACION Y OBSEVACIONES a. Cromatografía en papel Ante que todo analizamos por qué se da el fenómeno de arrastre de las proteínas, en debate, se concluyó que las causas son: El peso molecular La polaridad La disolvancia
Ahora pasamos en si al experimento: 1. Tenemos en primer lugar las muestras: En dos cristales se chancaron dos tipos de hojas, una verde y otra roja (por el caroteno) para extraer, las proteínas en dos pequeños frascos. Se preparó también un tercer frasco con una muestra de la mezcla de ambos líquidos, el cual actuará como el desconocido. 2. Ahora procedemos a echar la gota del liqido obtenido sobre la fase fija, que es papel filtro de celulosa. La fase fija se marca de las siguientes manera : Frente del solvente: se
marca después de realizado el efecto
Línea de inicio: se marca antes
de echar las gotas para que todas estén a una misma
3. Ahora colocamos la fase de solvente, que constituye la fase móvil: se usa generalmente metanol o piridina. Y procedemos a utilizar el efecto de arrastre y dejamos que el rastro cromático de las proteínas suba. En este punto ya se marca el frente del solvente.
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CUESTIONARIO 1. Que entiende por cromatografía? Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla. 2. Diga tres aplicaciones de la cromatografía en muestra biológicas Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes.
Análisis de carbohidratos en bebidas: la adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de refracción o ultravioletas
Isómeros de carotenoides: el HPLC en combinación con detectores calorimétricos permite el análisis de los carotenoides dietéticos en tejidos animales y vegetales.
. 3. Diga el fundamento de 2 tipos de cromatografía Cromatografía en placa fina: La cromatografía en capa fina es una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite: ‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. ‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. ‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente
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(fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente
La cromatografía de gases es una técnica muy utilizada para separar los diferentes compuestos volátiles de una muestra. La fase móvil es un gas inerte, (nitrógeno o helio) que transporta la muestra volatilizada en el inyector a través de la columna cromatográfica. La fase estacionaria generalmente está constituida por una columna de metil polisiloxano, o derivados de éste. Los diferentes compuestos se separan en función de su grado de volatilidad (punto de ebullición, peso molecular) y su afinidad por la fase estacionaria. Entre los detectores más utilizados caben mencionar el detector FID (ionización de llama) que por su alta versatilidad, hace posible la detección de un elevado tipo de compuestos.
4. Que entiende por punto isoeléctrico de las proteínas. Punto isoeléctrico de las proteínas: Es el pH al que un polianfólito tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. 5. Que entiende por coagulación, precipitación y desnaturalización de proteínas COAGULACION: Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70° C o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria. PRCIPITACION: La precipitación de las proteínas consiste en la desnaturalización de la estructura terciaria originando la formación de un "coágulo" que se observa como un "precipitado" en la solución. un cambio estructural de DESNATURALIZACION: es las proteínas o ácidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas.
6. Como se clasifican las proteínas
Proteínas fibrosas: las proteínas fibrosas tienen una estructura alargada, formada por largos filamentos de proteínas, de forma
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cilíndrica. No son solubles en agua. Un ejemplo de proteína fibrosa es el colágeno.
Proteínas globulares: estas proteínas tienen una naturaleza más o menos esférica. Debido a su distribución de aminoácidos (hidrófobo en su interior e hidrófilo en su exterior) que son muy solubles en las soluciones acuosas. La mioglobina es un claro ejemplo de las p roteínas globulares. Estas se dividen en:
Hélice alfa: esta estructura se desarrolla en forma de espiral sobre sí misma debido a los giros producidos alrededor del carbono beta de cada aminoácido. La mioglobina es un claro ejemplo de proteína de hélice alfa.
Hoja plegada beta: cuando la cadena principal se estira al máximo, se adopta una configuración conocida como cadena beta. La tenascina es un ejemplo de las proteínas hoja plegada beta.
Alfa/beta: Las proteínas que contienen una estructura secundaria que alterna la hélice alfa y la hoja plegada beta. Un ejemplo de proteína alfa/beta es la triosa fosfato isomerasa. Esta estructura es conocida como un barril TIM. La helicoidal alterna y los segmentos de hoja plegada beta forman una estructura de barril cerrado.
Alfa + Beta: En estas proteínas, la hélice alfa y la hoja plegada beta se producen en regiones independientes de la molécula. La ribonucleasa A es un ejemplo de proteína alfa + beta.
Proteínas de membrana: son proteínas que se encuentran en asociación con las membranas lipídicas. Esas proteínas de membrana que están embebidas en la bicapa lipídica, poseen grandes aminoácidos hidrófobos que interactúan con el entorno no polar de la bicapa interior. Las proteínas de membrana no son solubles en soluciones acuosas. Un ejemplo de proteína de membrana es la rodopsina. Debes tener en cuenta que la rodopsina es una proteína integral de membrana y se encuentra incrustada en la bicapa. La membrana lipídica no se muestra en la estructura presentada.
7. Diga las funciones de las proteínas Catálisis: Está formado por enzimas proteicas que se encargan de realizar reacciones químicas de una manera más rápida y eficiente. Procesos que resultan de suma importancia para el organismo. Por ejemplo la pepsina, ésta enzima se encuentra en el sistema digestivo y se encarga de degradar los alimentos. Reguladoras: Las hormonas son un tipo de proteínas las cuales ayudan a que exista un equilibrio entre las funciones que realiza el cuerpo. Tal es el caso de la insulinaque se encarga de regular la glucosa que se encuentra en la sangre. Estructural: Este tipo de proteínas tienen la función de dar resistencia y elasticidad que permite formar tejidos así como la de dar soporte a otras estructuras. Este es el caso de la tubulina que se encuentra en el citoesqueleto.
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Defensiva:
Son las encargadas de defender el organismo. Glicoproteínas que se encargan de producir inmunoglobulinas que defienden al organismo contra cuerpos extraños, o la queratina que protege la piel, así como el fibrinógeno y protrombina que forman coágulos. Transporte: La función de estas proteínas es llevar sustancias a través del organismo a donde sean requeridas. Proteínas como la hemoglobina que lleva el oxígeno por medio de la sangre. Receptoras: Este tipo de proteínas se encuentran en la membrana celular y llevan a cabo la función de recibir señales para que la célula pueda realizar su función, comoacetilcolina que recibe señales para producir la contracción.
8. En que se fundamenta la electroforesis La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.
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9. En que se fundamenta el método cromatografía de exclusión e intercambio iónico , ejemplo medico
Cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad. 10. En que se fundamenta la cromatografía liquida de alta precisión y ejemplo de aplicación medico
Cromatografía liquida de alta precisión: La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
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