Universidad de Guanajuato División de Ciencias Naturales y Exactas Laboratorio de Fisicoquímica en Bioloía y Farmacia!
PRACTICA 9: ACTIVIDAD ENZIMAT ENZIMATICA "aría Dolores #errera Equi$o %& "ata Ledesma "aría Fernanda 'illanueva (olís Luis Enrique Fec)a de t*rmino& +,-,.-+,/0 Fec)a de entrea& +1-,.-+,/0
PRACTICA 9: ACTIVIDAD ENZIMATICA
OBJETIVOS: Al finalizar la práctica el alumno será capaz e: 1. Observar la actividad de la enzima catalasa. 2. Comparar la actividad de la catalasa de tejidos de organismos vivos, con un catalizador no proteico. 3. Examinar los factores que afectan la actividad enzimtica. I!TRO"#CCIO!:
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miliramo de proteína (U!m prot) o por mililitro de disolución (U!ml). "e#ido a que las enzimas son catalizadores$ se de#e de tener en cuenta que un catalizador es una sustancia que disminu%e la enería de activación de una reacción química$ incrementando así$ la velocidad de la reacción. La ma%oría de las reacciones de los sistemas vivos son reversi#les$ es decir$ que en ellas se esta#lece el equili#rio químico. &or lo tanto$ las enzimas aceleran la formación de equili#rio químico$ pero no afectan las concentraciones finales del equili#rio. Las enzimas se pueden clasificar de la siuiente manera'
n las proteínas conuadas podemos distinuir dos partes' • •
Apoenzima: s la parte polipeptídica de la enzima. Cofactor: s la parte no proteica de la enzima$ % pueden ser '
a) *ones metálicos' +avorecen la actividad catalítica eneral de la enzima$ si no están presentes$ la enzima no actúa. stos iones metálicos se denominan activadores. emplos' Fe2+, Mg2+, Cu2+, K +, Na+ y Zn2+.
#) ,oenzimas' la ma%oría de los cofactores son de esta naturaleza. -stas son eneralmente son compuestos oránicos de #ao peso molecular$ por eemplo$ las vitaminas del compleo /0 son coenzimas que se requieren para una respiración celular adecuada.
,uando etas dos partes se encuentran unidas se les conoce como oloenzima. La sustancia so#re la cual actúa una enzima se llama sustrato$ % estos a su vez son específicos para cada enzima$ así entonces' 2La sacarosa es el sustrato de la sacarasa que actúa rompi3ndola en sus componentes. Se dice que e4iste una actividad enzimática cuando la enzima (E % el sustrato (! se com#inan para formar un compleo intermedio enzima sustrato (E"!$ el cual se descompone formando un producto % reenerando la enzima.
l rado de especificidad de las enzimas es mu% alto$ pueden distinuir incluso entre diferentes tipos de isómeros. Se cree que la especificidad de la enzima es de#ido a la forma particular de una peque5a parte conocida como sitio acti#o$ la cual se fia a la contraparte complementaria en el sustrato. Unidad de actividad enzimática:
6ecientemente$ el Sistema *nternacional de unidades (S*) a definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por seundo. sta unidad se llama 7atal (7at). ,omo 1 mol son 189 µmoles % 1 minuto son 98 seundos$ resulta que 1 7atal equivale a 98 4 189 U. sta unidad es mu% rande$ de forma que se utilizan frecuentemente los su#múltiplos como el micro7atal (µ7at$ 1829 7at) o el nano7atal (n7at$ 182: 7at). ,uando se conoce el peso molecular del enzima puro % el número de centros activos por mol3cula de enzima$ las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recam#io del enzima$ o sea$ el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo % por unidad de tiempo.Las enzimas son proteínas que catalizan todas las reacciones #ioquímicas. ;demás de su importancia como catalizadores #iolóicos$ tienen mucos usos m3dicos % comerciales.
Factores que afectan la actividad enzimática.-
4isten diversos factores que pueden afectar la actividad enzimática$ favoreciendo así la velocidad de reacción o retrasándola$ estos factores se mencionan a continuación' Concentraci$n %e& sustrato
; ma%or concentración del sustrato$ a una concentración fia de la enzima se o#tiene la velocidad má4ima. "espu3s de que se alcanza esta velocidad$ un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. Concentraci$n %e &a enzima.
Siempre % cuando a%a sustrato disponi#le$ un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática acia cierto límite . 'emperatura.
Un incremento de 18<, duplica la velocidad de reacción$ asta ciertos límites. l calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada$ la enzima pierde su actividad. p.
l p= óptimo de la actividad enzimática es >$ e4cepto las enzimas del estómao cu%o p= óptimo es ácido. )resencia %e cofactores.
?ucas enzimas dependen de los cofactores$ sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. &ara las enzimas que tienen cofactores$ la concentración del cofactor de#e ser iual o ma%or que la concentración de la enzima para o#tener una actividad catalítica má4ima. $ATERIA% RE&#ERI"O ! tubos de ensa"e de 13 x 1## mm 1 agitador de vidrio 2 pipetas graduadas de $ m% 1 vaso de precipitados de 1$# m% 1 gradilla metlica 1 parrilla de calentamiento con agitaci&n • • • • • •
REACTIVOS 'er&xido de (idr&geno al 3 ) *cido clor(+drico #.1 -idr&xido de sodio #.1 Cianuro de potasio #.1 • • • •
"ESARRO%%O E'PERI$E!TA% En los siguientes experimentos mide la velocidad de reacci&n de acuerdo a la siguiente escala # / no (a" reacci&n0 1 / lenta0 2 / moderada0 3 / rpida0 / mu" rpida. PARTE A( Comparación de la actividad de la catalasa y el dióxido de manganeso 1. Coloca en tubos de ensa"e 1 m% de per&xido de (idr&geno al 3 ). 2. *grega a cada tubo las siguientes sustancias Tu)o 1 2 3
A*re*ar n poco de arena fina n poco de nO 2 na porci&n de papa cruda na porci&n de (+gado
3. egistra la velocidad de reacci&n en cada tubo " compara los resultados obtenidos. PARTE B. Efecto del pH sore la actividad en!im"tica 1. Coloca una peque4a cantidad de papa fresca en 3 tubos de ensa"e. sa el agitador " un poco de arena fina para triturar la papa. 2. *grega 1 m% de agua destilada al primer tubo, 1 m% de -Cl #.1 al segundo " 1 m% de 5aO- #.1 al tercer tubo. egistra el p- de cada tubo. 3. *diciona a cada tubo 1 m% de per&xido de (idr&geno al 3 ) " registra los resultados al cabo de $ minutos. PARTE C( Efecto de la temperat#ra 1. Coloca una peque4a cantidad de papa en un tubo de ensa"e " tritura con arena, 'on el tubo en un ba4o de agua (irviendo durante $ minutos. 2. *4ade 1 m% de per&xido de (idr&geno al 3 ). Observa " registra los resultados. 3. epite lo anterior pero a temperatura ambiente. . Coloca en dos tubos de ensa"e 1 m% de per&xido de (idr&geno al 3 ). Coloca uno de los tubos en un ba4o de agua a 367C " el otro tubo en un ba4o de agua (elada, durante $ minutos. *gregar una peque4a cantidad de papa triturada a cada tubo. Compara las velocidades de reacci&n. PARTE "( Efecto de #n in$iidor 1. Coloca una peque4a cantidad de papa en un tubo de ensa"e " tritura con arena, agrega 3 gotas de 8C5 #.1 . ezcla bien el contenido del tubo. 2. *4ade 1 m% de per&xido de (idr&geno al 3 ) al tubo " registra los resultados.
Anotaci+n e las o)ser,aciones - resultaos el e.perimento - su iscusi+n /( Ela)ora una ta)la con los resultaos o)tenios( O)ser,aciones - resultaos e Parte A: comparaci+n e la acti,ia e la catalasa - el i+.io e ma*naneso( Tu)o O)ser,aci+n Velocia / *pareci& un leve burbujeo 1 Arana fina en la superficie del tubo 0 -ubo efervecencia de color 3 O.io e man*aneso negro 1 'resencia de efervecencia 2 Papa crua blanca 2 9e inmediato comenz& la 34*ao formaci&n de espuma blanca
O)ser,aciones - resultaos e Parte B: efecto el p3 so)re la enzima( Tu)o p3 O)ser,aci+n Velocia O)ser,aci+n Velocia antes e a*re*ar al a*re*ar espu5s e espu5s e 6 30O0 30O0 6min e min e a*re*ar 30O0 a*re*ar 30O0 / : 'resencia de 2 =e observ& a>n 3 Papa 7 arena efervescencia ms 7 /m% e blanca ;reacci&n efervescencia a*ua mu" lenta< estilaa 0 # 5o se observaron # =e observ& mu" 1 Papa 7 arena cambios poca 7 /m% e 3Cl efervescencia 8(/$ al 1 blanca 1 Papa 7 arena 7 /m% e !aO3 8(/$ al 1
1
5o se observaron cambios
#
E observo algo de efervecencia balnaca
2
O)ser,aciones - resultaos e Parte C: efecto e la temperatura Tu)o O)ser,aci+n Velocia / 5o (ubo cambio alguno # Papa 7 arena 7 3 0O0 caliente; 0 =e percibi& la formaci&n de Papa 7 arena 7 3 0O0 a efervescencia blanca casi temperatura am)iente; al instante. 1 %a reacci&n fue casi al 3 30O0 caliente; 7 papa instante mu" rpidamente se comenz& a formar la efervescencia. 2 %a reacci&n fue ms lenta 2 30O0
ela)ora un *ráfico e )arras(
,omo se puede persivir en la rafica$ el iado fue el que presento una ma%or velocidad de reaccion$ mostrando mas produccion de #ur#ueo$ mientras que la arena fina fue la que casi no tenia reaccion con el pero4ido.asi entonces se puede decir que el iado es que contenia mas enzima$ por tanto u#o mas actividad enzimatica.
Como se puede observar al momento de agregar el per&xido, solo (ubo reacci&n apreciable en el tubo que conten+a papa?arena?1ml de agua destilada, el cual ten+a un p- de :. =in embargo en los otros dos tubos, que conten+an acido (e (idr&xido no se percibi& actividad enzimtica, esto se debe a que el p- &ptimo de la actividad del per&xido es de :.
,omo se o#serva en esta rafica$ despues de dear pasar @minutos de arear el pero4ido a los tu#os$ se comenzo a ver la presencia de actividad en el tu#o que contenia acido e idro4ido$ sin em#rao la actividad del tu#o que contenia aua destilada (p=A9) seuía teniendo la velocidad ma%or de reacción$ por lo tanto se puede decir que la enzima si tiene su actividad má4ima a un p= casi neutro.
,omo se puede o#srvar en esta rafica$ la actividad enzimatica si se ve afectada por la temperatura$ % en este caso se lora ver que a temperaturas $mu% altas no a% actividad$ sin em#aro la temperatura am#iente es la optima para la actividad del la enzima. ston se de#e a que a altas temperaturas la enzima puede descomponerse %a que se loran romper alunos de los emlaces peptídicos de la proteína$ aciendo que se desnaturalice % por tanto %a no tena actividad enzimatica.
n este caso o#servamos que el B,C efectivamente si sirve como un ini#idor de la actividad enzimatica de nuestra encima$ %a que no u#o presencia de reaccion aluna. sto lo loramos verificar al momento de no o#servar cam#io aluno en la reacción.
1( ?Puee el per+.io e
* pesar de que el per&xido de (idr&geno es relativamente estable a temperatura ambiente, numerosas sustancias act>an como catalizadores de su descomposici&n, entre otras metales de transici&n, lcalis, " &xidos metlicos. %a luz del d+a tambi@n favorece la descomposici&n del per&xido de (idr&geno, por lo que debe conservarse en envases opacos. *. "escri)e el efecto el tamao e part4cula> e la temperatura> el p3 - el
in
Efecto del p- sobre la actividad enzimtica %os enzimas poseen grupos qu+micos ionizables ;carboxilos ACOO-0 amino A5-20 tiol A=-0 imidazol, etc.< en las cadenas laterales de sus aminocidos. =eg>n el p- del medio, estos grupos pueden tener carga el@ctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformaci&n de las prote+nas depende, en parte, de sus cargas el@ctricas, (abr un p- en el cual la conformaci&n ser la ms adecuada para la actividad catal+tica. Este es el llamado p- &ptimo. %a ma"or+a de los enzimas son mu" sensibles a los cambios de p-. 9esviaciones de pocas d@cimas por encima o por debajo del p- &ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. *s+, la pepsina gstrica tiene un p- &ptimo de 2, la ureasa lo tiene a p- 6 " la arginasa lo tiene a p- 1#. Como ligeros cambios del p- pueden provocar la desnaturalizaci&n de la prote+na, los seres vivos (an desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el p- intracelular %os amortiguadores fisiol&gicos. •
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qu+micas por cada 1#BC de incremento, la velocidad de reacci&n se duplica. %as reacciones catalizadas por enzimas siguen esta le" general. =in embargo, al ser prote+nas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. %a temperatura a la cual la actividad catal+tica es mxima se llama temperatura &ptima. 'or encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacci&n debido a la temperatura es contrarrestado por la p@rdida de actividad catal+tica debida a la desnaturalizaci&n t@rmica, " la actividad enzimtica decrece rpidamente (asta anularse. * ma"or temperatura, ma"or velocidad de reacci&n. %a temperatura representa uno de los tipos de energ+a presente en la reacci&n. El sentido del flujo de energ+a entre los miembros de la reacci&n, determina si esta es exot@rmica o endot@rmica. •
Efecto de los in(ibidores sobre la actividad enzimtica Ciertas mol@culas pueden in(ibir la acci&n catal+tica de un enzima son los in(ibidores. Estos in(ibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original ;in(ibidor competitivo< o bien alteran la •
conformaci&n espacial del enzima, impidiendo su uni&n al sustrato ;in(ibidor no competitivo<. Efecto del tama4o de part+cula =uperficie de contacto * ma"or superficie de contacto, ma"or velocidad de reacci&n. %a superficie de contacto determina el n>mero de tomos " mol@culas disponibles para la reacci&n. * ma"or tama4o de part+cula, menor superficie de contacto para la misma cantidad de materia. •
Conclusiones
=e cumpli& el objetivo de la prctica al comparar la actividad de la enzima catalasa en diferentes muestras observando su velocidad de reacci&n, donde logramos ver que en un tejido vivo la actividad enzimtica de la catalasa es mu" rpida0 =e demostr& que el p- influ"e en la actividad enzimtica de las prote+nas as+ mismo se comprob& que el factor temperatura es de gran influencia en la actividad enzimtica "a que se observ& ma"or velocidad de actividad a temperaturas altas que en temperatura ambiente o bajas. En la prueba del efecto de in(ibidor se corrobor& que al adicionar una especie qu+mica con esta funci&n si se evita que la enzima tenga actividad pues despu@s de agregar el in(ibidor " realizar la prueba "a no se observ& reacci&n como en los casos que no ten+an in(ibidor. REDERE!CIAS =urve" of C(emistr", %aborator" Experiments, 6t( Edition, * anual for C(emistr" 1#, $, :. 9epartment of c(emistr", =o"ut(ern Oregon niversit", *s(land, Oregon, =*, 1!, pgs. :A62. CDE5CD*= DO%OFDC*= de las mol@culas al (ombre, *daptaci&n de la versi&n azul del DO%OFDC*% =CDE5CE= CDC% =G9H, Educational 'rograms Dmprovement Corporation, Ienezuela. @xico, 162, pgs. 2#1 J 2#. Enzimas> recuperao e: fec recuperao e: fec recuperao e: fec
