Las células crecen por absorción de materiales nutrientes, que utilizan como elementos de construcción para producir nuevo protoplasma, cuando las células bacterianas alcanzan la madures, su tamaño máximo, se dividen en dos, y cada célula hija iniciara una nueva vida independiente y nueva. El periodo entre la formación inicial de una bacteria y su división final en dos células hijas recibe el nombre de tiempo de generación, este varía para un tipo determinado de bacterias. También varía cuando el periodo de incubación, las condiciones atmosféricas o cualquier otro requisito de crecimiento sufren alteración. Los tiempos de generación de las bacterias van desde 20 min. Hasta varias horas. Durante esas primeras horas las células de ajustan a su nuevo medio, aumentan su índice metabólico y entonces formaran nuevo protoplasma, todo ello preparándose para una fase reproductiva. El ritmo o velocidad de crecimiento de las bacterias se mantendrá en tanto se disponga de nutrientes abundantes, y se conserve la acumulación de productos tóxicos bajo el nivel crítico, esta fase puede extenderse debido a la alteración del cambiante ambiente el que se puede ver afectado por la aireación del medio de cultivo, por ajustes del PH, por una combinación de tales procedimientos. Cuando no se verifica tal regulación o intervención, el ambiente alterado hará que entre el cultivo en la siguiente fase, la fase estacionaria. Las condiciones básicas para el buen crecimiento y desarrollo de cualquier organismo incluyendo a las bacterias, son:
A) B) C) D) E)
Un medio adecuado que proporcione proporcione nutrientes. Una atmosfera adecuada. Presión osmótica y PH adecuados. Temperatura apropiada Humedad.
Una atmosfera adecuada puede significar la presencia o ausencia de oxigeno, ola provisión de otro medio gaseoso, algunos organismos también requieren de otras condiciones atmosféricas, otros necesitan aumento de C0 2 o aumento de H 2S La presión osmótica adecuada se refiere por lo general a la concentración de ion hidrogeno en el medio, o sea el PH. También puede referirse a la concentración de sal y azúcar en los medios, igualmente la temperatura más adecuada varia también, la humedad es un requisito entre todos los seres vivos.
Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
PH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante) El periodo entre la formación inicial de una bacteria y su división final en dos células hijas recibe el nombre de tiempo de generación. Este tiempo de generación varia para los diferentes tipos de bacterias. También varia para un tipo determinado de bacterias, cuando el periodo de incubación, las condiciones atmosféricas o cualquier otro requisito de crecimiento sufren alteración, los tiempos de generación de las bacterias van desde 20 minutos hasta varias horas. El primer periodo de ajuste y reconstitución recibe el nombre de fase de retardación, ya que parece retardarse el aumento esperado en el número de los organismos. Suponiendo que prevalezcan condiciones óptimas, los organismos se multiplicaran en la siguiente fase, la fase log, a una velocidad gobernada por su tiempo mínimo de generación. Para casi todo tipo de bacterias esto significa una duplicación del número de organismos viables cada 20 minutos. Este ritmo o velocidad de crecimiento se mantendrá en tanto se disponga de nutrientes abundante, y se conserve la acumulación de productos tóxicos de desecho bajo el nivel crítico. Puede extenderse esta fase por alteración del cambiante ambiente, el que se puede ver afectado por la aireaccion del medio de cultivo, por ajustes del PH, por la aspiración y sustitución del medio, o por una combinación de tales procedimientos. Cuando no se verifica tal regulación o intervención, el ambiente alterado hará que entre el cultivo en la siguiente fase, la fase estacionaria. Durante el curso de esta tercera fase, el cambiante ambiente llegara a un punto en el cual el numero de organismos que mueren igualara al número de los que se reproducen. Esta fase se conoce como fase estacionaria, ya que naturalmente el número de organismos viables mantendrá un equilibrio.
La duración de esta fase la determinaran la velocidad o índice del agotamiento de nutrientes, y la de acumulación de desechos. Pronto provocara esto la fase final, la fase de declinación. Durante esta cuarta y última fase, el número de organismos que mueren excederá del numero de los que se están reproduciendo. Esta fase continuara hasta que todos los organismos del cultivo hayan expirado.
Medio de cultivo en la placa de petri: Mediante la incorporación de un agente solidificante, como el agar, en un medio liquido, resulta un gel solido cuando se vierte el medio de cultivo en una caja de petri, cuando todavía esta tibio, es decir a mas de 45 ⁰C. al extender una pequeñísima porción de la muestra, o bien una diminuta gota de un cultivo mixto en caldo, sobre la superficie de esta placa. Colonias como recordaremos, son los descendientes de una solas bacteria, agrupados en un montoncito visible. Hay en la actualidad diferentes métodos para extender o untar. Uno, fácil y eficaz, puede llevarse a cabo así: A) se usa un alambre delgado, o un asa de alambre o de platino para transferir el cultivo o la muestra. Puede esterilizarse este alambre o asa entre una y otra colocándolos sobre una flama de Bunsen hasta el rojo vivo. B) el inoculo, cultivo o espécimen, se extienden en una capa muy delgada sobre una pequeña área de la placa. C) partiendo de esta área se diluye el inoculo haciendo correr la serie de franjas (regueros) desde esa área se diluye el inoculo haciendo correr una serie de franjas desde esa área al resto de la placa siguiendo un patrón determinado. Como la idea es diluir el inoculo, deben hacerse correr las franjas en un solo sentido, evitando tocar otras franjas ya esparcidas, al hacer las siguientes: si el método contiene relativamente pocas bacterias, aparecerán colonias aisladas a lo largo de las primeras franjas o regueros. El bacteriólogo experimentado puede diferenciar muchas bacterias simplemente mirando las colonias. Las principales formas de los medios de cultivo son: Entera o completa, ondulada, lobulada, dentada irregular, radialmente estirada y lobulada, fimbriada, franjeada, rizoide, dentada, plana, elevada, convexa baja, aboveada, umbronada, papilada convexa. *Consistencia: la colonia puede ser butirosa, mucoide, translucida u opaca. *Transparencia: la colonia puede ser transparente, traslucida u opaca.
*Pigmentación: los diferentes cultivos pueden producir todos los colores. También es frecuente que cambien la producción de pigmento bajo condiciones variables.
Métodos de inhibición selectiva. En bacteriología médica podemos ser frecuentemente selectivos en nuestro enfoque cuando se trate de aislar agentes patógenos de ciertos especímenes. Cuando sabemos cuáles bacterias no deseamos aislar, podemos crear condiciones que impidan que esas bacterias indeseables crezcan.por desgracia nos encontraremos a menudo con que estos métodos que impiden que crescan las bacterias no deseadas, también inhibirán las que deseamos. Además, es frecuente que los tecnólogos olviden, que aunque muchas condiciones inhibidoras impiden el crecimiento de las bacterias que desean eliminar, pocas destruyen en realidad esas bacterias. En consecuencia, a menudo consideran como cultivos puros a muchas mezclas compuestas por colonias aparentemente puras, que están creciendo sobre otros tipos viables de bacterias. Cuando se transfiere a la colonia con los contaminantes subyacentes a otro medio, para un nuevo ensayo de la colonia es natural que los resultados sean pocos dignos de confianza. Sin perjuicio de lo anterior, varios métodos de inhibición selectiva dan excelentes resultados cuando se les llega a usar cuidadosamente. Algunos de estos métodos de inhibición selectiva muy frecuentemente usados son los siguientes: A) El crecimiento a altas o bajas temperaturas, para el aislamiento de termófilos y psicrofilos respectivamente. B) La incubación anaeróbica o aerobica naturalmente excluirá a los aerobios y anaerobios respectivamente. C) La variación del PH excluirá a muchas bacterias. D) La incorporación de inhibidores específicos, como los antisueros y varios agentes químicos. Las sales biliares por ejemplo inhibirán a muchas bacterias grampositivas. Algunos métodos especiales para cultivar bacterias merecen mayor atención: Cultivo anaeróbico: En el curso de los años se han empleado varios métodos distintos para el cultivo anaeróbico de bacterias. Los siguientes se encuentran entre los mas populares: A) Medios liquidos: tales como el caldo de tioglicolato, el caldo de carne cocida y otros, pueden servir para cultivar a casi todos los anaerobios, pero solo resultan prácticos cuando son relativamente frescos.
B) Frasco de spray: este es un frasco de diseño especial, con dos compartimientos, donde asienta perfectamente la parte inferior de un disco de petri. Los dos compartimientos quedan separados por un reborde bajo, situado en la parte inferior del frasco. C) Frascos de Gaspak: estos se han sustituido a los frascos de torbal En los frascos de torbal se necesita reemplazar el oxigeno por el hidrogeno usando una bomba de vacío, una fuente de hidrogeno y un catalizador interno. El frasco Gaspak sigue un principio semejante al usado en la técnica spray, presentando las ventajas adicionales de contar con paquetes desechables de reactivos y un frasco más grande en donde caben 10 placas a la vez. Se agregan cuidadosamente 10 ml. de agua a un gaspak desechable. Se colocan tanto el gaspak como un indicador con los cultivos en el frasco y se cierra la tapa. Un catalizador para la temperatura del interior hará que ocurra una reacción química que consuma todo el oxigeno dentro del frasco en unos 30 min.
Cultivos para recuento de organismos viables. Para calcular el número de bacterias viables que hay en una muestra liquida, o en un cultivo liquido, puede seguirse una técnica bastante simple. Se pueden hacer diluciones de la muestra en caldo e ⁰ y verterse la mezcla en una caja de petri. Al ocurrir la incubación apropiada se desarrollaran bacterias viables formando colonias detectables que quedaran enterradas en el medio. Contando el numero de colonias producidas y multiplicando estas por el factor de dilución puede hacerse recuentos exactos del numero de bacterias viables que haya en 1 ml de la muestra original.
Método de dilución. Al diluir sultivos mixtos en caldo, se llegara a una dilución final que solo contenga uno de los tipos. Este método solo será útil para separar un tipo de otro, o bien para separarlo de otros tipos que en conjunto deben estar presentes en menores números que aquel que deseamos aislar. Si no puede el lector visualizar perfectamente las dificultades y limitaciones de este método, trate de de obtener un saco que contenga digamos 200 bolitas rojas, 100 azules, 50 verdes, y 10 amarillas; con un total de 360.
