PRACTICA 3. CUANTIFICACIÓN DE LA CANTIDAD DE PROTEÍNA DE UNA MUESTRA VEGETAL
En la mayoría de trabajos bioquímicos es bueno cuantificar la proteína total de un extracto proteico después de los distintos pasos de extracción, purificación, etc., con el fin de poder saber los rendimientos de estos procesos y si éstos han sido adecuados o no. Existen varios métodos de cuantificación de proteínas, pero los más usados son aquellos en los que un colorante se une, de forma inespecífica, a las proteínas, dando al extracto una coloración característica y cuantificable en un colorímetro. Los diferentes métodos colorimétricos tienen diferentes características en cuanto a sensibilidad y linealidad de respuesta, pero el más utilizado de todos ellos es la cuantificación con el reactivo de Bradford (1976), que se basa en la reacción del azul Comassie con las proteínas y posterior medida de la absorbancia desarrollada a 595 nm. Para determinar la concentración de proteína es necesario disponer de una curva patrón en la que se mide la A
595
de unas soluciones cuya cantidad de proteína se conoce y después se
interpolarán en la curva patrón los valores de absorbancia obtenidos en las muestras cuya concentración de proteína se pretende determinar. El
objetivo es cuantificar la proteína total del extracto enzimático obtenido, así
como en los sedimentos y sobrenadantes obtenidos con los dos agentes precipitantes, por uno de los métodos más utilizados: el método de Bradford.
Protocolo experimental 1. Material y reactivos - Centrífuga - Tubos de ensayo - Muselina - Pipetas Pasteur - Extracto enzimático de hojas de naranjo y algunas diluciones del mismo (1/3, 1/10 y 1/20).
- Tampón fosfato sódico 0.2 M pH 7.5 - Colorímetro - Tubos de ensayo - Pipetas y micropipetas (5 mL y 100 L) - Reactivo de Bradford 5X - Curva patrón de BSA
2. Procedimiento 2.1. Preparación del extracto enzimático La preparación del extracto enzimático es muy sencilla. Se trituran en un mortero de porcelana 2 g de hojas troceadas, lavadas previamente con agua destilada y secadas, a las que se le añade 20 mL de tampón fosfato sódico 0.2 M pH 7.5. Se fil tra en muselina sobre el tubo de centrífuga córex y el homogeneizado se centrifuga a 18000 rpm
a 4ºC durante 20 min. El sobrenadante constituye el extracto enzimático. Se
utilizará el extracto enzimático diluido con el tampón de reacción para que la reacción sea cuantificable. Inicialmente se probará con 1/3, 1/10 ó 1/20).
2.2. Preparación del reactivo de Bradford (5x) Disolver 100 mg de Azul Comassie G en 50 mL de etanol 96%, añadir 100 mL de H3PO4 y agua destilada hasta 200 mL y después filtrar. Este reactivo está concentrado cinco veces (5x). Para utilizarlo se diluye con cuatro partes de agua (1 parte de Bradford y 4 partes de agua). Para determinar la concentración de proteína, a 100 de la muestra se le añaden 5 mL del reactivo de Bradford diluido y se mide A
L
595
.
2.3. Preparación de la curva patrón de BSA En primer lugar se prepara una disolución patrón de seroalbúmina bovina (BSA) al 0.1% aproximadamente. Para ello se pesan unos 12 mg de BSA en la balanza de precisión y se disuelven en 10 mL de agua. Dado que la BSA en polvo se encuentra
hidratada, la concentración de las disoluciones preparadas gravimétricamente es sólo aproximada. La concentración exacta de la BSA en la disolución patrón se determinará espectrofotométricamente de acuerdo con la Ley de Lambert-Beer, sabiendo que, para la BSA,
280
-1
-1
cm . (La Ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia
de una determinada sustancia a una longitud de onda dada es i gual a la concentración de la misma (M) por el coeficiente de extinción molar de esa sustancia a esa longitud de onda y por el paso óptico de la cubeta del espectrofotómetro (cm)) . 280
A
=
280
A
·c·l
c=
ε
280
280
⋅l
En la tabla siguiente se detallan las mezclas de reacción necesarias para la obtención de la curva patrón de la BSA. A cada uno de estos tubos se le añadieron 5 mL de reactivo de Bradford diluido y, a continuación, se midió la A
595
, siendo los valores de
absorbancia los que se dan en la tabla siguiente:
l
l agua
A595
disolució n BSA 0 (blanco)
100
15
85
30
70
45
55
60
40
75
25
Conocida la concentración real de BSA es posible determinar la concentración de BSA en cada una de las alícuotas anteriores. Representando la absorbancia de la BSA a 595 nm frente a la concentración real, obtenemos la recta patrón buscada, donde x será la concentración de proteína en
g
de proteína/mL.
2.4. Determinación de la cantidad de proteína. Para determinar la cantidad de proteína total del extracto se mezclarán 100
l
de
extracto con 5 mL del reactivo de Bradford diluido y se medirá la absorbancia a 595 nm. Si se satura el espectrofotómetro se ha de elegir la dilución del extracto que dé un valor de absorbancia que esté dentro del rango de la curva patrón obtenida (diluciones el extracto 1:2, 1:3 ó 1:5 con el tampón). Así, los 100 adecuada.
L
de extracto serán de la dilución
(Recordad que antes de usar este reactivo de Bradford debe diluirse a la
quinta parte con agua destilada) . El blanco se hace añadiendo 100 L de tampón a 5 mL del reactivo de Bradford diluido. El cálculo de la proteína contenida en el extracto se realiza interpolando el valor de la absorbancia a 595 nm en la curva patrón de BSA obtenida anteriormente. Los resultados finales se han de expresar en
g
de proteína por mL de extracto, por lo que
hay que considerar los factores de dilución necesarios.
