UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA
CBS
Reporte de Laboratorio Practica 3.- Ciclo del glioxilato
UEA: Bioquímica Microbiana Catedrático(a): Armando Mejía Álvarez Grupo: BG58
Laboratorio: A2-AB
Integrantes: Equipo No. 5
Huerta Jiménez Lucía Paulina Jiménez Maganda Lesley Millán Sánchez Viridiana Palma Hernández Luis Alberto Ninive Ortiz Fierros Sánchez Bárcenas Hanzonit Etelberto
Fecha de entrega del Reporte: 19 de marzo de
2012
Introducción: La levadura Saccharomyces cerevisiae se adapta al agotamiento de glucosa a través de diversos mecanismos, incluyendo la reprogramación de la expresión génica y la síntesis de proteínas. La liberación de la represión por glucosa altera la transcripción de genes implicados en diversos procesos celulares, tales como la gluconeogénesis, el ciclo del glioxilato, el ácido tricarboxílico (TCA) del ciclo, la respiración, la β-oxidación, y la utilización o el transporte de azúcares alternativas. Las enzimas de la vía de la gluconeogénesis y el ciclo de glioxilato son indispensables para el crecimiento en fuentes de carbono no fermentables, tales como etanol, lactato, o glicerol.
Objetivo:
Reactivos: Medio Semilla, 200 ml (7 tubos 25 ml c/u) A pH = 7 Glucosa 0.5 % KH2PO4 0.05 %
(NH4)2SO4 0.1 %
Extracto de levadura 0.2 %
Medio de Fermentación o Producción 200 ml (6 tubos con 25 ml c/u) a pH=7 (NH4)2SO4 0.1% Extracto de levadura 0.2 %
KH2PO4 0.05 %
Alcohol etílico absoluto 3 %
Materiales •
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15 tubos de 50 ml con tapón y rosca 5 tubos de ensaye de 2 ml 1 probeta graduada de 50 ml 1 vaso de precipitados de 250 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml
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1 pipeta de 5 ml 2 espátulas 1 asa de siembra 1 mechero Fisher 1 Piceta con agua 1 Piceta con alcohol 1 parrilla de agitación 1 barra magnética 1 potenciómetro 2 pipetas Pasteur
Metodología: Preparamos dos medios de cultivo líquido. Del primer medio preparamos 200 ml en total, agregándole Glucosa 1 g, (NH4)2SO4 0.2 g, KH2PO4 0.1 g, Extracto de levadura 0.4 g, pH 7. El medio 2 también fue de 200 ml, contenía (NH 4)2SO4 0.2 g, KH2PO4 0.1 g, Extracto de levadura 0.4 g, Alcohol etílico absoluto 7. 633 ml. Hicimos los cálculos necesarios para cada reactivo y cada medio, después los pesamos. Para cada medio hicimos el mismo procedimiento de preparación (medio 1 y medio 2), agregamos 100 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y los reactivos correspondientes en cada medio, los mantuvimos en constante agitación para que se diluyeran, les medimos el pH, que estuviera en 7, después lo aforamos a 200 ml. Al terminar de preparar los medios los esterilizamos en la autoclave por 15 minutos a 115 lb/pulg, Cuando terminamos de esterilizar los medios, los vaciamos en los tubos con rosca, en un área desinfectada con alcohol al 70 % previamente, el medio 1 lo vaciamos en 7 tubos con rosca y el medio 2 en otros 6 tubos con rosca, después dejamos
enfriar un poco los tubos, para que posteriormente le sembramos el microorganismo a cada tubo, bajo las mismas condiciones de desinfección del área. Ya que tuviéramos nuestros cultivos con el microorganismo, a cada tubo le pusimos en su interior una campana de Durham, con la boquilla hacia abajo, tapamos cada tubo con la rosca y las dejamos por una semana en el laboratorio (esto con el objetivo de detectar desprendimiento de gases, en este caso CO 2). Resultados Primero observamos el estado de los tubos, en su estado de reposo, para ver si no hubo contaminación (turbidez), si hubo biomasa en el fondo de los tubos y la presencia de CO 2. Obtuvimos crecimiento en de levadura en los dos medios, salvo algunos tubos, de acuerdo a la siguiente tabla: Tubo Medio 1 Medio 2
1
2
3
4
5
6
7
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
No
No
Si
Si
Si
De los tubos que obtuvimos crecimiento de levadura, las que tuvieron presencia de CO2 en las campanas de Durham fueron las siguientes: Tubo Medio 1 Medio 2
1
2
3
4
5
6
7
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
-
-
-
Si
No
No
Después se agitaron los tubos, para observar la turbidez (proporcional a la concentración de biomasa la levadura) y si hubo liberación de CO2, esto debido a que la levadura aun seguía metabolizando el sustrato (glucosa o etanol)
Medio 1 (Con Burbujas, al agitar ligeramente)
Medio 1 al agitar (presencia de burbujas, CO2 en el tubo y turbidez, debido a la alta concentración de biomasa)
Medio 2 (Liberación de CO2 en el tubo y biomasa en el fondo)
Medio 2 (Turbidez, sin liberación de burbujas)
Discusión La presencia de burbujas en el medio 1 indica la liberación de CO 2, que es normal en el metabolismo de la levadura cuando usa un sustrato de 6 carbonos, en este caso, glucosa, ya que realiza la fermentación alcohólica, donde se obtiene etanol, pasa por el ciclo de Krebs, y en esta vía hay si hay liberación de CO 2, pues se forma del piruvato a acetil Co-A, oxalosuccinato a alfa-cetoglutarato y de este a la succinilCoA. Reacción global del ciclo de Krebs Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O CoA-SH + 3 + (NADH + H ) + FADH2 + GTP + 2 CO2 →
En el medio 2, con sustrato de etanol, que tiene dos carbonos y en teoría no se forma CO 2, en el caso de los tubos 6 y 7 del medio dos. Debido a que en la ausencia de un sustrato de 6 carbonos, en este caso, etanol que es un sustrato no fermentable, (la saccaromyces es sensible a este y solo tolera un 20% de la concentración total, por lo tanto es más factible en medios minimos) se lleva a cabo el ciclo del glioxilato, donde hay dos enzimas exclusivas, que es la isocitrato liasa que convierte el isocitrato a succinato y glioxalato, la malato sintasa que interniene en la formación de malato a partir del glioxalato y de la acetil-CoA. Esta ruta evita las descarboxilaciones, (para evitar perdida de carbono) es por eso que no se produce CO 2. ¿Por qué se forma CO2 en algunos tubos, si se tiene un sustrato de C2, es decir el etanol?
En condiciones aerobias, la levadura puede llevar a cabo la respiración celular (y en consecuencia el ciclo de Krebs), pero para obtener un mayor rendimiento energético, el Etanol se convierte en acetato, y a su vez en Acetil
CoA. Y pasa al ciclo del glioxilato. Pero en algunos casos (dependiendo de las condiciones de la levadura, ya sean aerobias y de la disponibilidad de enzimas) el oxalacetato puede entrar para sintetizar glucosa por medio de la gluconeogénesis, formándose glucosa, y esta entra de nuevo a la glucolisis, formándose piruvato, este se transforma a Acetil Co A, liberándose una molecula CO 2, y este pasa al ciclo de Krebs liberándose dos moléculas de CO 2. Pero debido al mayor gasto energético que esto implica, se forma menos biomasa, por lo tanto esta reacción es se realiza en menos cantidad y se produce muy poco CO 2.
Conclusión Las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza la glucólisis y posteriormente se forma etanol, debido al fenómeno de represión catabólica (fenómeno común a muchos microorganismos por el cual la transcripción de los genes implicados en la utilización de fuentes de carbono alternativas está reprimida en presencia de azúcares represores, fundamentalmente la glucosa y la fructosa, que son metabolizadas con mejor eficiencia). Una vez que estos azúcares escasean, se produce la respiración del etanol, vía ciclo de krebs. Evolutivamente esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energéticamente desfavorable para la reproducción del organismo, dado que se obtiene mucha menos energía en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Una vez que el ciclo de Krebs presente deficiencias de sustratos, se lleva a cabo el ciclo del glioxilato para crear intermediarios, que reemplazaran a ciertas moléculas del ciclo o que pasaran a biosíntesis, o para compensar la deficiencia de energía, regresando a gluconeogénesis y nuevamente a glucolisis.
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Enlaces Web: (Link encontrado usando un buscador web), Fecha de consulta: 26/02/2012, 17:40, Link final: http://enologos2008.unicongress.org/archivos/file/Madrid/ENOLOGOS/09%20g rado%20alcoholico%20segun%20levadura.pdf
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