LABORATORIO DE BIOQUIMICA 502504 GUIA No 6.1- Enzimas mitocondriales : citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa I. EL PROBLEMA. Identificar la actividad de algunas enzimas específicas presentes en el tejido animal como la citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa, mediante el uso de aceptores electrónicos coloreados e identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias sobre este sistema enzimático.
II. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN. -
Exprese en forma de ecuación química las reacciones que catalizan las enzimas que se estudiaran en esta práctica. Realice la ficha técnica de los reactivos a utilizar en esta práctica, los cuales se especifican en el numeral 4.
III. FUNDAMENTO TEORICO. Cadena de transporte de electrones: La cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. El complejo citocromo oxidasa es el componente final de la cadena y está constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II). Aproximadamente Aproximadamente el 90% del consumo celular de oxígeno se debe a la acción de este complejo. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrónicos más fuertes como el cianuro, azida y monóxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimático y se interrumpe el transporte de electrones produciéndose una cianosis celular. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH 2) en presencia del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.
El ciclo de Krebs y la succínico deshidrogenasa (SDH) La succínico deshidriogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocóndria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, malato, oxalacético y oxálico, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de succinato.
El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso e un aceptor electrónico artificial como el azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoaxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.
IV. MATERIALES Y REACTIVOS. Material por grupo de laboratorio.
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10 tubos de ensayo dos erlenemeyer de 150ml un vaso de precipitados de 500ml Un mortero con mano Cuatro pipetas de 5ml Cinco pipetas de 2ml Dos tubos de centrífuga Una gradilla Un pipeteador
Materiales y reactivos generales. (volúmenes calculados para 10 grupos de laboratorio)
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Arena lavada Buffer fosfato 0,1M y pH 7.4 (300ml) Solución malonato de sodio 1% (100ml) Solución cianuro de potasio 0,05M (50ml) PELIGROSO Solución de p-fenilendiamina al 1% (100ml) Solución de succinato de sodio al 1% (100ml) Solución de azul de metileno 0,01% (100ml) Aceite mineral (200ml) Agua destilada Baño de maría termostatado a 37ºC Tejido hepático fresco Tejido cardiaco fresco Tejido muscular fresco
V. PROCEDIMIENTO. 1.
Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas.
Tomar una muestra de aproximadamente 5g de tejido libres de sangre y colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una masa suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfatos hasta completar un volumen aproximado de 15ml. Transfiera la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y manténgalo en un baño con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pase la muestra a tubos de centrífuga y centrifugue a 1500 rpm por 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml y márquelo como extracto enzimático y manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso. 2.
Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa:
Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la Tabla No 1.
TABLA No 1. REACTIVO (ml)
B
1
2
3
Buffer fosfato pH 7.4 Malonato de sodio 1% Cianuro de potasio 0,05M Agua destilada Extracto enzimático p-fenilendiamina 1%
1,0 0,0 0,0 2,0 1,0 0,0
1,0 0,0 0.0 1.0 1.0 1.0
1,0 0,0 1.0 0.0 1.0 1.0
1,0 1,0 0.0 0.0 1.0 1.0
Mezcle bien el contenido de cada tubo e incube a 37ºC hasta cuando aparezca el complejo coloreado. Observe y anote los resultados obtenidos en cada tubo. 3. Seguimiento de la reacción catalizada por la succinico deshidrogenasa: Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la tabla No 2.
TABLA No 2. Reactivo (ml)
B
1
2
3
4
Buffer fosfato pH 7.4 Succinato de sodio 1% Azul de metileno Malonato de sodio 1%
3.0 0.0 0.5 0.0
2.5 1.0 0.5 0.0
2.0 1.0 0.5 0.0
1.5 1.0 0.5 0.0
1.0 1.0 0.5 1.0
Extracto enzimático Aceite mineral
1.0 1.0
0.5 1.0
1.0 1.0
1.5 1.0
1.0 1.0
Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño agregue el extracto enzimático, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el momento en que colocó el extracto enzimático y anote el tiempo requerido para la decoloración de cada tubo. Anote los resultados de cada tubo.
VI. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRACTICA. -
Datos y observaciones debidamente tabulados Análisis de las observaciones de la práctica Revise de nuevo los objetivos de la práctica y evalúe si se cumplieron total o parcialmente, y redacte unas conclusiones en donde exprese en forma clara lo aprendido.
VII. BIBLIOGRAFÍA. -
Plummer, D. Bioquímica práctica,1981. Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, México. Bohinski, R.C. Bioquímica.1998. Quinta Edición, Pearson Educación. México.
