Microbiología Médica
Universidad del Valle de México Campus: Chapultepec Microbiología Médica Coprocultivo Integrantes: Simón Zetune Calderón Eduardo Pérez Valles Asael González Martínez
Microbiología Médica
Practica # 2 Coprocultivo
Objetivo Marco Teórico Se denomina coprocultivo a la siembra de una muestra adecuada de heces en medios de cultivo apropiados para el desarrollo de bacterias entéricas patógenas. Muestra adecuada es aquella que ha sido recolectada durante el periodo agudo de la enfermedad, cuando es más fácil comprobar presencia de pus, moco o sangre, y antes de la administración de antimicrobianos. Para realizar el examen se emplean heces que no tengan más de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de algodón. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1º ml de un líquido conservador, o bien, depositar en éste el hisopo rectal. Los coprocultivos se realizan para identificar parásitos, enfermedades entérales y virus en el aparato gastrointestinal. De las muestras que se pueden estudiar, la que tienen más probabilidades de contenerel mayor número y variedad de microorganismos es la materia fecal. En el coprocultivo clásico se examinan las heces fecales para detectar y descartar Salmonella, Shigella, Yersinia, E. colienteropatogena y cultivos deSthaphy lococcus. Cuando
las siembras no se p ueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1º ml de un líquido conservador, o bien, depositar en éste el hisopo rectal. El líquido o solución conservadora se prepara de la siguiente manera: NaCl 4.2 g Glicerol 300 ml y y y
y
K2HPO4 3.1 gv KH2PO4 1.0 g
y
H2O 700 ml
Este líquido, al que se le añade rojo fenol, se distribuye en tubos, que se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120° C. Las muestras tomadas mediante hisopado rectal pueden ser portadas en tubos que contengan medio de Cary-Blair, colocando el hisopo en su interior. FLORA NORMAL
Bacteroides
f ra gilis. Lactobacilus spp.( anaerobios). C lostridium per fr i ngens Peptostreptococcus spp. Proteus spp. C andid a spp. Pseudomona spp.
FLORA
PATÓGENA
Sal monell a typhi Sal monell a spp. Shi gell a spp. E scherichi a coli ( enterotoxina). K lebsiell a spp. Y ersi ni a enterocolítica. V ibrio choler ae.
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Para facilitar el aislamiento de bacterias entéricas patógenas se utilizan medios de enriquecimiento y medios selectivos. Los más empleados son los siguientes: Agar Sal Manitol Este medio, es diferencial debido a que se pueden detectar microorganismos fermentadores de manitol y selectivo por su elevada concentración de cloruro de sodio, por lo que se utiliza para microorganismos estafilococos, en este caso la detección va enfocada a Staphylococcus aureus. Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus, basado en la tolerancia que poseen a una alta concentración de cloruro sódico (7,5%). Sirve también como medio diferencial de cepas fermentadoras del manitol. Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la única especie del género que produce esta fermentación. Este medio utiliza la misma base que el Ágar Sangre. Antiguamente se añadían los hematies a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio su componente. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, manitol, rojo fenol, agar y agua destilada. Agar Salmonella-Shigella:
Este medio selectivo, empleado para aislar Salmonella y Shigella ejerce una buena inhibición sobre agentes coliformes, sin limitar el desarrollo de los patógenos gramnegativos. Se utiliza especialmente junto al agar-sulfito de bismuto, para siembra de materiales provenientes de medios enriquecedores, como caldo tetrationato y caldo con selenito. Contiene sales biliares, lactosa, citrato y tiosulfato sódico, citrato férrico, verde brillante y rojo neutro como indicador. Shigella y Salmonella, como también otros agentes que no fermentan la lactosa, aparecen como colonias lisas, transparentes a opacas; las pocas colonias fermentadoras de la lactosa que se pueden desarrollar tienen color rojo y un centro negro. Conviene señalar que la bilis o las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos grampositivos y esporulados sin interferir en el crecimiento de los bacilos gramnegativos. La inhibición de microorganismos Gram positivos se debe a su contenido de sales biliares, verde brillante y citratos. La diferenciación de los microorganismos entéricos se logra por la incorporación de lactosa en el medio. Los microorganismos que fermentan la lactosa producen ácido, el cual al reaccionar con el indicador rojo neutro, forma colonias de color rojo. Los microorganismos no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras. Este último grupo contiene la mayoría de los microorganismos patógenos intestinales incluyendo Salmonella y Shigella. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico, facilitan la detección de sulfuro de hidrógeno, manifestándose por colonias con centro.
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Composición por Litro:
Peptona de casina y carne- 5g Extracto de carne de buey- 5g Lactosa- 10g Citrato sódico- 8.5g Tiosulfato sódico- 8.5g
Citrato de hierro- 1g Sales Biliares- 8.5g Rojo neutro- 0.025g Agar- 15g Verde brillante- 0.3mg
Agar MacConkey. Es un medio selectivo-diferencial que contiene sales biliares, las cuales inhiben la flora gram positiva. Los agentes del grupo coliforme dan colonias de color rojo, debido a que fermentan la lactosa. En cambio, Salmonella y Shigella sp. forman colonias incoloras. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa con el indicador Rojo ne utro.Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario. LECTURA: Colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Sal monell a, Shi gell a, Pseudomonas Colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) y y
Material
Cantidad
Sustancias
Cantidad
Puente de Tinción
1
Lugol
Lo necesario
Asa Bacteriológica
1
Cristal violeta
Lo necesario
Mechero
1
Safranina
Lo necesario
Porta Objetos
10
Alcohol - Acetona
Lo necesario
Aceite de inmersión
Lo necesario
Equipo
Microscopio óptico
Material Biológico
Muestra de SS fecales
Microbiología Médica Procedimiento
Toma con el asa estéril un poco de materia fecal y depositarla cerca de la orilla de cada una de las placas.
Proceder al aislamiento por el método de estría cruzada.
Incubar a 37oC por 24 a 48 horas
Hacer un frotis de cada colonia diferente, y teñirlo con Gram.
R esultados
Interpretar el resultado, anotando las características morfológicas de cada colonia diferente que haya crecido
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EMB
Se detectaron 2 tipos de colonias:
Colonia Rosa mexicano: Forma.- Convexa Borde.- Entero Agrupación.- Circular
Colonia morada con contorno verde metalico: Forma.- Convexa Borde.- Entero Agrupación.- Circular
Bacilos Gram
Bacilos Gram -
SS (Salmonella ± Shigella)
Colonia Amarillas con manchas negras en medio Forma.- Convexa Borde.- Entero Agrupación.- Circular
Bacilos Gram -
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Mac Conkey
Se detectaron dos tipos de colonias: Colonia Translucida: Forma.- Convexa Borde.- Entero Agrupación.- Circular
Colonia Rosa: Forma.- Convexa Borde.- Entero Agrupación.- Puntiforme
Cocos Gram -
Bacilos Gram -
Pruebas bioquímicas
MIO Color original.- Morado Positivo al reactivo de Kovac.- Presencia de un anillo rosa, lo cual indica que es positivo al indol Tope amarillo.- Negativo a ornitina Turbio.- Movilidad de la bacteria
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TSI Color original.- Naranja Cambio de color a amarillo.- Utiliza Sacarosa Presencia de Gas
CITRATO DE SIMONS Color original.- Verde Cambio de color a azul.- Indica que es positivo a la prueba de Citrato
Análisis de Resultados Las enterobacterias son las principales bacterias causales de de las infecciones intestinales, estando entre ellas las mas graves (salmonelosis y shigelosis). Su forma de contagio es muy facil y muy comun en paises subdesarrollados. Ya que es principalmente por contaminacion fecal y, al haber una mala educacion sanitaria, ausencia de servicios higienicos (letrinas adecuadas, falta de agua potable), hace que estos tipos de infecciones sean por lo demás frecuentes. Una caracteristica comun es el aumento de la incidencia de estas enfermedades el epocas de verano, por el mismo motivo de la informalidad en la venta de la comida, refrescos, helados, y otros, preparados con mala higiene o no cuidados correctamente de la contaminacion. psatogenas. En esta caso al hace n uestro análisis encontramos dos tipos de colonias en el medio EMB encontramos dos tipos de colonias y se rebeló que f ueron bacilos gran(-) y gran(+), los bacilos gran negativos es una característica normal del tracto gastro intestinal, en el caso de que hubieran sido muy delagdos podríamos hablar de una infección por campylobacter; en el caso de los bacilos gram negativos se puede hablar de clostridium di fi f icile En el agar SS que medio selectivo empleado para aislar Sal monell a y Shi gell a se encontraron bacilos gran negativos que como se menciono antes son habituales del el tracto gastro intestinal. -
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Microbiología Médica En el agar de Mac Conkey encontramos dos tipos de colonias unas rosas que eran pertenecientes a bacilos gram negativo y otra colonia tranparente perteneciente a cocos q ue también son normales en lael traco gastrointestinal en caso de haber sido positivos se p uede hablar de una posible infección por estafilococo,
Conclusión
El propósito de esta práctica f ue identificar las finalidades de un análisis prococultivo de laboratorio así como saber que agar usar para este análisis y para qué sirve cada uno y los organismos esperados tener en cada medio ya que son selectivos y de esta manera poder identificar rápidamente las bacterias patógenas y comunes en las heces por la técnica de la tinción de gram además observamos algunas pruebas bioquímicas que se le hacen a diferentes medios para de estar manera interpretar diferentes factores como si la bacteria tiene movilidad si hay presencia de gas en otras particularidades
Bibliografía http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm
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