UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE SAN JUAN DEL RÍO DIVISIÓN DE QUÍMICA
Procesos Biotecnológicos Practica # 1Preparación de medios de cultivo para microbiología
Ingeniería Química
12/06/2013
OBJETIVO El alumno aprenderá la preparación de los diferentes medios de cultivo
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INTRODUCCION: Para cada bacteria a ser cultivada es necesario proveer el ambiente bioquímico y biofísico apropiado. El ambiente bioquímico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propósitos y utilizaciones. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y también son utilizados para la identificación de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. Los Medios de Cultivo se clasifican de acuerdo a su estado físico (líquido, sólido, semisólido) y a la finalidad de su uso. La preparación de los medios de cultivo es un proceso que también se menciona en este trabajo. MARCO TEORICO: El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Composición de un medio de cultivo:
componentes indispensables: agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgánicos ( P, e, N, Mg, S, etc.)
componentes
alternativos:
isosmotizantes
(NaCl),
agente
solidificante
(agar-
agar), tampones, indicadores de pH, etc. Tipos de medios de cultivo:
En función de su consistencia: -
medios líquidos
-
medios sólidos (en tubo, en placa)
-
medios semisólidos
En función de su composición: -
medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura)
-
medios sintéticos
Existen medios de cultivo cuya composición permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la selección
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de determinados
grupos
de organismos, o
se desarrollan para el
estudio de
determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos.
medios selectivos
enriquecimientos
medios para test bioquímicos
Preparación de un medio de cultivo:
Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua destilada
Ajustar el pH del medio, si procede
Para la preparación de medios sólidos se adiciona agar-agar como agente solidificante. Para asegurar la completa disolución del agar, el medio se calienta hasta ebullición al mismo tiempo que se somete a agitación previamente a su esterilización en el autoclave.
Esterilización de medios de cultivo: Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos: Medios sólidos en placa - tapar el matraz con tapón de algodón graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C, 15-20 min). Una vez estéril repartir el medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su solidificación. Medios sólidos en tubo (agar inclinado) - tras la ebullición del medio con agar, éste se reparte en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos se cubren con tapón (de aluminio), etc.). Para llevar a autoclavar. Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posición inclinada para su solidificación. Medios líquidos – una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en tubos a razón de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapón y llevar a esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estériles en tubos de plástico estériles. Medios semisólidos – se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar-agar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaeróbicas, existen diversas metodologías para ello. Los medios semisólidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios). DESARROLLO: [3]
2 2 1 1 1 1 1 1
1
Materiales y equipos Cajas petri estériles Potenciómetro Tubos de ensaye con tapón Mecheros Matraz Erlenmeyer de 250 ml Probeta de 100ml Balanza granataria Parrilla Espátula Autoclave Cinta testigo Tubos de ensayo medianos Pipeta graduada de 10 ml Pipeta graduada de 1 ml Probeta de 100 ml Frasco de dilución Balanza Granataría
Reactivos Buffer pH 4, 7, 10 Solución salina al 0.9% Agua destilada Sal y manitol Agar MIO, TSI Caldo lactosado Agar Nutritivo Agar Salmonella o TCBS Caldo de infusión cerebro corazón Algodón, papel manila, agua destilada Solución de hipoclorito de sodio al 2 ppm
PROCEDIMIENTO: 1. Elaborar un tapón de algodón y un gorro de papel estraza para el matraz de 1000 ml, procurando que este embone perfectamente. 2. Medir 500 ml de H3O destilada 3. Verter los 500 ml de H3O destilada en el matraz Erlenmeyer de 1000 ml. 4. Pesar 11.5 g de la fórmula de Agar Nutritivo en la balanza y agregar al matraz Erlenmeyer de 1000 ml que contiene los 500 ml H3O destilada. 5. Tomar la franela y doblarla a lo largo para rodear la boquilla del matraz Erlenmeyer. 6. Calentar sobre la llama del mechero tipo Fisher con movimientos circulares, hasta que la solución no presente partículas y del color ámbar vire a un color con tendencia transparente. 7. Colocar el tapón de algodón y el gorro de papel estraza. Marcando el matraz con una tira de cinta testigo. 8. Esterilizar en el autoclave a 121 °C / 15 lbs. de presión durante 15 minutos. 9. Verificar cuidadosamente el vire en la tira de cinta testigo 10. Colocar el matraz recién esterilizado sobre la mesa de trabajo.
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RESULTADOS:
Preparación general de medios de cultivo
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AGAR NUTRITIVO:
Leer la etiqueta
Pesar 11.5
del Agar
gramos del
Nutritivo
Agar Nutritivo
Vaciar 500 ml de
de agua destilad en
un matraz
el mismo matraz
Erlenmeyer
Erlenmeyer
Hasta su completa
medir el pH
deseado 6.6
Calentar el Agar nutritivo con agitación
disolución
Si
obtenido el pH
pesados y 500 ml
agua destilada en
Dejar enfriar y
Una vez
Vaciar los gramos
No
suave
Agregar NaOH para neutralizar
pH de 6.8± 0.2
Agregar HCl para acidificar
Colocar el tapón de Esterilizar en
Colocar en la
autoclave a una
mesa de
marcarlo con cinta
presión de 15Lb
trabajo para
testigo
durante 15 min
su uso.
algodón y el gorro de papel estraza al ME y
Puntos críticos en la preparación de los medios de cultivo
pH Temperatura Pesaje de los medios Condiciones de esterilización
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COMPETENTES DEL MEDIO DE CULTIVO
Agar nutritivo
CUESTIONARIO 1.- ¿Qué norma mexicana nos indica el procedimiento para la realización de medios de cultivo? NOM-065-SSA1-1993, que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. 2.- ¿Qué pasa si el medio de cultivo se excede en el calentamiento? Los medios que contiene azucares como parte de sus componentes principales generalmente se caramelizan al someterlos a altas temperaturas, modificando el aspecto final del medio. 3.- ¿Cuántos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos? Medio
Ejemplo
Medios basales A.N. M.E Medios enriquecidos G.A.S., G.Ch. Medios selectivos o inhibitorios A.V.B. y A.BP. Medios Diferenciales bioquímicas Medios de enriquecimiento Caldo tetrationato Medios de transporte Cary-Blair Medios de conservación B.A.B. Nota: estos también pueden clasificarse según el estado de agregación en solidos (agares) y líquidos (caldos).
4.- ¿Cuál es la diferencia entre un medio líquido y un sólido? La diferencia principal entre ellos es que un medio solido contiene agar el cual le da la consistencia sólida al medio, además de sus usos ya que estos tienen diferentes objetivos. Med io s líqu id os .
Se emplean fundamentalmente para:
Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos. Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. [7]
Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
Medios sólidos.
Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología. 5.- Defina que es un medio de cultivo Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular. Conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que permiten que los microorganismos crezcan y se reproduzcan. Aportan carbón y nitrógeno y elementos minerales, factores decrecimiento, agua y pH adecuado. 6.- ¿Qué sucede si el medio está muy frío y se desea vaciar? Este no caerá debido a que se ha gelificado totalmente. 7.- Diferencie entre los términos: Desarrollo y Crecimiento 8.- Usos y cuidados del potenciómetro. Los principales cuidados que hay que tenerse a la hora de utilizarse el potenciómetros es que el electrodo no debe de tocar el fondo del recipiente donde se coloque ni ser golpeado y que este se deberá de calibran con las soluciones buffer de pH 4, 7, y 10 antes de ser utilizado. Su uso principal es medir el pH de las soluciones como caldos, y soluciones para ajustar el pH de los medios. 9.- Investiga la técnica Gram La tinción Gram es una técnica utilizada para la identificación de bacterias Gram positivo y Gram negativo mediante el uso de ciertos colorantes como la safranina, el azul violeta, violeta de genciana y otros colorantes los cuales tienen la capacidad de teñir las paredes de las células esto debido a que algunas de ellas tienen una sustancia llamada peptidoglucano o mureína la cual provoca la retención o no del colorante. Las bacterias Gram positiva se visualizan de color moradas y las Gram negativa se visualizan de color rosa o rojo o grosella. PASOS A SEGUIR PARA REALIZAR UNA TINCIÓN GRAM Tinción Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.
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Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias. Decoloración Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tinción de contraste Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.
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CONCLUSIONES *Cervantes Alonso Ana Laura Previo a la preparación de un medio de cultivo es necesario conocer el tipo de MO con el que se ha de trabajar, esto nos permitirá delimitar que medio el más adecuado para su crecimiento. Hay factores como la temperatura y pH que son críticos en su preparación pues la mayoría de veces de estos depende el obtener un buen medio de cultivo y que cumpla con las especificaciones requeridas. En la práctica ajustamos el pH del agar nutritivo usando NaOH para neutraliza hasta alcanzar un pH de 6.6. *Morales Ortiz Erick Los medios de cultivo son agentes nutritivos que permiten la recuperación y proliferación de los MO por lo que su preparación debe ser cuidadosa siempre cuidando que cumpla con las especificaciones establecidas en la norma y su etiquetado, pues en ellos se especifican factores como la temperatura, pH y las fuentes de nutrientes que contiene, que son críticos en el crecimiento de los MO. Es por eso que para su preparación se necesita conocer el tipo de MO con el que hemos de trabajar. En la preparación del agar nutritivo se ajustó su pH a 6.6 para que fuera apto para el crecimiento de MO según marca la etiqueta del frasco del agar. *Rodríguez Fajardo José Jonny Las condiciones de temperatura y pH son condiciones críticas en la preparación de los medios de cultivo, ya que las altas temperaturas afectan las azucares q contienen algunos medios, pues estas se caramelizan, de igual manera el pH ya que si este tiende a acido no proliferan ningún tipo de bacterias; pero no así los hongos y levaduras. Por eso la importancia de trabajar bajo las especificaciones que marca la norma y el etiquetado de cada medio. Pues en este caso necesitábamos un pH de 6.8; así que se ajustó el pH del agar nutritivo a 6.6 con NaOH. Sanabria Celestino Kennedi La preparación de un medio de cultivo es fundamental en la proliferación de MO por lo que tiene que hacerse cuidadosamente. Teniendo en cuenta aspectos representativos del tipo demedio ya sea sólido, semisólido o un caldo; así como el pH, temperatura de preparación, etc. Otro factor a tomar en cuenta para la preparación del medio es el tipo de MO con el que se pretende trabajar, pues este defina las características del medio. En el caso de nuestra practica se preparó un agar nutritivo al cual se le ajusto el pH de ácido a prácticamente neutro de 6.5 para poder cumplir con los requerimientos especificados para su uso que son de un pH de 6.8 ± 0.2 BIBLIOGRAFÍA
NOM-065-SSA1-1993, que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. Microbiología industrial presentación de power point.
http://www.buenastareas.com/ensayos/Medios-De-Cultivo/839009.html
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http://egg.umh.es/frvalera/manualDePracticas.pdf
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