Pemisahan Protein Putih Telur dengan Fraksinasi (NH 4)2SO4
I. TUJUAN Menentukan berat molekul protein albumin dari putih telur pada berbagai fraksi (NH4)2SO4 dengan teknik SDS-PAGE
II. TEORI DASAR Protein merupakan komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein juga berperan dalam metabolisme dalam bentuk enzim. Adapun sifat-sifat protein sendiri yaitu memiliki tingkat kelarutan berbeda dengan awalnya sebelum ditambahkan dengan larutan garam dengan konsentrasi tertentu. Proses penambahan garam dalam pengendapan protein disebut sebagai proses salting . Proses ini dibagi lagi menjadi dua, yaitu: salting yaitu: salting in dan in dan salting salting out . Penambahan garam pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan kelarutan protein ( salting salting in), in), tetapi protein akan mengalami presipitasi garam pada konsentrasi tinggi ( salting salting out ). ). Endapan yang terbentuk dapat dilarutkan kembali, protein tidak mengalami denaturasi. Mekanisme salting Mekanisme salting out terjadi terjadi melalu dehidrasi protein akibat penambahan garam. Ion garam dapat menarik molekul air yang melarutkan protein sehingga protein menjadi tidak larut.
III. DATA PENGAMATAN Data migrasi:
-
-
Marker Jarak migrasi (cm)
Mr (kDa)
log Mr
0,6
116
2,06446
1,5
66,2
1,82086
2,6
45
1,65321
3,3
35
1,54407
4,4
25
1,39794
Sampel Fraksi
Jarak Migrasi
0 – 20 %
r1 = 2,1
r2 = 3,7 20 – 50 %
r1 = 2,0 r2 = 3,6
50 – 70 %
r1 = 2,1 r2 = 3,5
IV. Pengolohan Data 1. Kurva Jarak migrasi Marker Terhadap log Mr
Jarak Migrasi Marker terhadap log Mr 2 1.5 y = -0.1711x + 2.1204 R² = 0.9789
r M g 1 o l
Series2 Linear (Series2)
0.5 0 0
1
2
3
4
jarak migrasi marker (cm)
2.
Perhitungan ukuran protein berdasarkan jarak migrasi Persamaan garis yang diperoleh : y = - 0,1711x + 2,1204 Dengan cara mensubstitusikan nilai migrasi tiap protein sampel sebagai x ke dalam persamaan, diperoleh ukuran protein. Bila jarak migrasi protein = 2,1 cm, maka : log Mr = (- 0,1711 x 2,1) + 2,1204 = 1,76109 Mr = 57,6886 kDa Dengan cara yang sama, diperoleh Mr protein pada berbagai fraksi: fraksi 0-20 % 20-50 % 50-70 %
V. Pembahasan
jarak migrasi
log Mr
Mr (kDa)
2,1 3,7 2,0 3,6 2,1 3,5
1,76109 1,48733 1,7782 1,50444 1,76109 1,52155
57,6886 30,71355 60,00674 31,94773 57,6886 33,2315
Percobaan fraksinasi protein pada putih telur menggunakan prinsip salting out, yaitu dengan menambahkan garam pada larutan protein. Garam memiliki kelarutan yang lebih tinggi di dalam air dibandingkan dengan protein. Maka ketika ditambahkan garam, lalu disentrifugasi, sebagian protein akan mengendap karena garam lebih mudah untuk terhidrasi dibandingkan protein. Pada percobaan ini garam yang dipakai adalah garam amonium sulfat karena garam tersebut yang memiliki kelarutan yang tinggi dalam air, dan juga mudah didapat, murah, serta tidak berbahaya. Pada dasarnya garam lain pun dapat dipergunakan dalam percobaan ini, namun tetap harus memiliki 4 kriteria tersebut. Pada percobaan ini digunakan 3 kondisi pengendapan, yaitu 0-20% jenuh, 20-50% jenuh, dan 50-70% jenuh. Pada pengendapan yang pertama, protein yang paling tidak larut dalam air akan mengendap, dan seterusnya Kelarutan protein dalam air ditentukan oleh sifat hidrofobik dan hidrofiliknya. Jika sifat hidrofobiknya besar, maka protein akan lebih kecil kelarutannya dalam air. Sifat hidrofobik dan hidrofiliknya ditentukan oleh gugus R yang terikat pada asam amino tsb. Endapan yang dihasilkan kemudian dilarutkan dalam buffer, dan diberi larutan staining untuk memberikan warna pada protein agar ketika di suntikkan ke dalam gel elektroforesis, warnanya bisa dilihat, dibaca, dan dihasilkan data. Setelah semalam direndam dalam larutan staining, baru pita protein dapat terlihat, karena larutan staining peka terhadap keberadaan protein. Elektroforesis SDS-PAGE adalah elektroforesis yang didasarkan pada prinsip ukuran molekul. Dalam proses ini, gel dibuat dari poliacrylamida yang juga berperan sebagai fasa diam. Di kedua ujung gel tersebut diberi beda tegangan sehingga, protein yang bermuatan dapat bergerak dari satu ujung ke ujung yang lain sesuai hukum coulomb (muatan yang sejenis akan tolak menolak, dan sebaliknya). Maka, pertama-tama protein diberi muatan negatif, agar ketika sudah dinyalakan elektrodanya, larutan protein dapat bergerak menyusuri gel elektroforesis dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan besar dari molekul proteinnya. Semakin besar molekul proteinnya, semakin lambat dia berjalan, dan menghasilkan jarak migrasi yang lebih kecil. Data jarak migrasi ini kemudian dibandingkan dengan marker SDS-PAGE melalui kurva kalibrasi sehingga akan diperoleh data massa molekul protein dalam masing-masing fraksi. Pada pembuatan gel pada SDS-PAGE, ada 2 jenis gel, yaitu stacking gel dan seperating gel. Stacking gel adalah tempat untuk menginjeksi serta menata sampel protein sebelum proses running dimulai. Terbuat dari 40% akrilamid sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Bahan ini juga bersifat inert, sehingga tidak bereaksi dengan protein yang diinjeksikan. Pada gel ini ditambahkan buffer tris pH 6,8 untuk memberi muatan negatif pada protein, dan mempertahankan pH protein agar tidak berubah (fungsi umum buffer). Terdapat juga 10% H2O yang berperan sebagai pelarut polar dan media polar untuk aliran listrik dalam gel. Reagen SDS digunakan sebagai surfaktan yang dapat memutus ikatan pada protein (denaturasi), lalu menyelubungi protein dengan muatan negatif. 10% APS pun dimasukkan sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid, dibantu dengan TEMED sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari APS, serta
sebagai pemadat sehingga percampurannya dilakukan terakhir, agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum bahan tercampur. Selanjutnya adalah seperating gel yang berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat/ ukuran molekulnya. Komposisinya tidak berbeda jauh dengan stacking gel. Perbedaannya ada pada volume dari setiap zat yang digunakan. Pada pembuatan gel ini, buffer tris yang digunakan adalah pada pH 8,8 yang berfungsi agar muatan protein negatif. Larutan gel yang sudah dibuat dicetak menggunakan plate, lalu diberikan aquades pada seperating gel yang setengah padat agar permukaannya datar, setelah padat aquades tsb diserap, baru setelah itu stacking gel ditambahkan di atas seperating gel. Hasil yang didapat dari data tahun lalu adalah pada setiap persentase kejenuhan protein terdapat 2 jenis protein dengan berat molekul berkisar 55-60 kDa dan 30-33 kDa. VI. KESIMPULAN Protein yang paling banyak terdapat dalam putih telur adalah albumin dengan berat molekul sekitar 57,6886 kDa
VII.
DAFTAR PUSTAKA
Boyer, Rodney F. 1993. Model Experimental Biochemistry, 2nd ed . Michigan: The Benjamine/ Cummings Publishing Company, Inc. Page: 248-249 Lehninger, Albert L. 1993. Dasar-dasar Biokimia, jilid 1. Jakarta: Penerbit Erlangga. Page: 144-145 http://www.seoulin.co.kr/shop/products/product_01.php?category=11865A000000000 diakses pada 5 Oktober 2014
