PEMERIKSAAN HBsAg
Tanggal praktikum : 4 November 2013 I. Tujuan 1. Untuk mengetahui cara pemeriksaan HBsAg 2. Untuk mengetahui adanya antigen virus Hepatitis B Surface (HBsAg) dalam sampel serum pasien.
II. Metode Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah Elisa Enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Assay)
III. Prinsip HBsAg ELISA merupakan pemeriksaan berdasarkan metoda sandwich immunoassay. Antibodi monoklonal spesifik terhadap HBsAg dilekatkan pada well sample kemudian serum sampel yang mengandung HBsAg ditambahkan sehingga terbentuk ikatan antigen-antibodi, selanjutnya ditambahkan anti HBs yang dilabel konjugat peroksidase sehingga terbentuk ikatan komplek dan melepaskan peroksida yang bereaksi dengan chromogen membentuk senyawa berwarna biru yang intensitasnya sebanding dengan konsentrasi HbsAg dalam sampel. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam sulfat sebagai stop solution sehingga warna berubah menjadi kuning yang dibaca absorbannya dengan alat ELISA Plate Reader pada λ 450 nm dan 620-700 620-700 nm.
IV. DASAR TEORI A. Pengertian Hepatitis B Virus hepatitis B (VHB) adalah virus DNA, suatu prototif virus yang termasuk keluarga Hepadnaviridae. Virus ini memiliki DNA yang sebagian berupa untaian tungaal (single stranded DNA) dan DNA polymerase endogen yang berfungsi menghasilkan DNA untaian ganda (double stranded DNA, dsDNA). Virion lengkap VHB terdiri atas suatu struktur berlapis ganda dengan diameter keseluruhan 42 nm. Bagian inti sebelah dalam (inner core) yang berdiameter 28 nm dan dilapisis selaput (envelop) yang tebalnya 7 nm mengandung dsDNA dengan berat molekul 1.6X
106. Bagian envelop yang mengelilingi core terdiri ataskompleks dengan sifat biokimia heterigen ; bagian ini mempunyai sifat antigen berbeda dengan antigen core (HBcAg) dan disebut antigen permukaan hepatitis B surface antigen (HbsAg). HbsAg diproduksi lebih banyak oleh hepatosit yang terinfeksi dan dilepaskan ke dalam darah sebagai partikel bulat berukuran 17-25 nm (diametrer rata-rata 20 nm) dan sebagian partikel tubuler berdiameter sama yang panjangnya berkisraan natara 100-200 nm. Antibody terhadap HBcAg dan HBsAg masing-masing disebut antyi HBc dan anti-HBs. Keberadaan antiHBs dalam sirkulasi melindungi seseorang terhadap infeksi dengan VH B. Selain kedua jenis antigen di atas antigen lain yang diketahui adalah HBeAg yang merupakan bagian integral dari kapsid virion VHB. HBeAg dapat beredar bebas dalam darah atau membentuk kompleks dengan IgG. Karena kaitannya ssangat erat dengan nukleokapsid VHB, maka HBeAg merupakan petanda yang dapat dipercaya yang menunjukkan banyaknya virion dalam serum. Sebaliknya ant HBe digabungkan dengan kadar virion yang lebih rendah. Hepatitis B adalah salah satu peradangan hati yang disebabkan oleh suatu virus hepatitis B. Hepatitis B muncul dalam darah dan menyebar melalui kontak dalam darah, air mani dan cairan vagina yang terinfeksi atau penggunaan bersama jarum obat. Hepatitis B merupakan penyakit yang dapat berjalan akut maupun kronik. Sebagian penderita hepatitis B akan sembuh secara sempurna dan mempunyai kekebalan seumur hidup, tapi sebagian lagi gagal memperoleh kekebalan. Virus hepatitis B dengan komponen antigen permukaan (HbsAg). Diameter 42 nm, dengan ” core ” 4 nm. ” coat virion ” merupakan ” surface antigen ” atau HbsAg ”. Suface antigen biasanya diproduksi berlebihan sehingga dijumpai dalam darah penderita. Pada hepatitis agresif, hati mengalami peradangan kronik, fibrotik dan mengecil dan dapat menjurus. Gejalanya meliputi penyakit kuning, lemah, rasa sakit pada perut dan muntah. B.
Pengertian HBsAg Pengertian HbsAg Antigen permukaan virus hepatitis B (hepatitis B surface antigen,
HBsAg) merupakan material permukaan dari virus hepatitis B. Pada awalnya antigen ini dinamakan antigen Australia karena pertama kalinya diisolasi oleh seorang dokter peneliti Amerika, Baruch S. Blumberg dari serum orang Australia. HBsAg merupakan petanda serologik
infeksi virus hepatitis B pertama yang muncul di dalam serum dan mulai terdeteksi antara 1 sampai 12 minggu pasca infeksi, mendahului munculnya gejala klinik serta meningkatnya SGPT. Selanjutnya HBsAg merupakan satu-satunya petanda serologik selama 3 – 5 minggu. Pada kasus yang sembuh, HBsAg akan hilang antara 3 sampai 6 bulan pasca infeksi sedangkan pada kasus kronis, HBsAg akan tetap terdeteksi sampai lebih dari 6 bulan dan tidak adanya anti-HBc IgM. Beberapa kasus menunjukkan peningkatan menjadi hepatitis kronis berhubungan dengan adanya penyakit kronis yang diderita, misalnya kegagalan ginjal, infeksi HIV, dan diabetes..HBsAg positif yang persisten lebih dari 6 bulan didefinisikan sebagai pembawa (carrier). Sekitar 10% penderita yang memiliki HBsAg positif adalah carrier, dan hasil uji dapat tetap positif selam bertahun-tahun.
C.
Pemeriksaan HBsAg Pemeriksaan HBsAg berguna untuk diagnosa infeksi virus hepatitis B, baik untuk keperluan
klinis maupun epidemiologik, skrining darah di unit-unit transfusi darah, serta digunakan pada evaluasi terapi hepatitis B kronis. Pemeriksaan ini juga bermanfaat untuk menetapkan bahwa hepatitis akut yang diderita disebabkan oleh virus B atau superinfeksi dengan virus lain. HBsAg positif dengan IgM anti HBc dan HBeAg positif menunjukkan infeksi virus hepatitis B akut. HBsAg positif dengan IgG anti HBc dan HBeAg positif menunjukkan infeksi virus hepatitis B kronis dengan replikasi aktif. HBsAg positif dengan IgG anti HBc dan anti-HBe positif menunjukkan infeksi virus hepatitis B kronis dengan replikasi rendah. Pemeriksaan HbsAg secara rutin dilakukan pada pendonor darah untuk mengidentifikasi antigen hepatitis B. Transmisi hepatitis B melalui transfusi sudah hampir tidak terdapat lagi berkat screening HbsAg pada darah pendonor. Namun, meskipun insiden hepatitis B terkait transfusi sudah menurun, angka kejadian hepatitis B tetap tinggi. Hal ini terkait dengan transmisi virus hepatitis B melalui beberapa jalur, yaitu parenteral, perinatal, atau kontak seksual. Orang yang berisiko tinggi terkena infeksi hepatitis B adalah orang yang bekerja di sarana kesehatan, ketergatungan obat, suka berganti-ganti pasangan seksual, sering mendapat transfusi, hemodialisa, bayi baru lahir yang tertular dari ibunya yang menderita hepatitis B.
Ada tiga pemeriksaan standar yang biasa digunakan untuk menegakkan diagnosa infeksi hepatitis B yaitu: 1. HBsAg (hepatitis B surface antigen): adalah satu dari penanda yang muncul dalam serum selama infeksi dan dapat dideteksi 2 -8 minggu sebelum munculnya kelainan kimiawi dalam hati atau terjadinya jaundice (penyakit kuning). Jika HBsAg berada dalam darah lebih dari 6 bulan berarti terjadi infeksi kronis. Pemeriksaan HBsAg bisa mendeteksi 90% infeksi akut. Fungsi dari pemeriksaan HBsAg diantaranya :
Indikator paling penting adanya infeksi virus h epatitis B –
Mendiagnosa infeksi hepatitis akut dan kronik –
Tes penapisan (skrining) darah dan produk darah (serum, platelet dll) –
Skrining kehamilan
2. Anti HBs (antobodi terhadap hepatitis B surface antigen): jika hasilnya “reaktif/positif” menunjukkan adanya kekebalan terhadap infeksi virus hepatitis B yang berasal dari vaksinasi ataupun proses penyembuhan masa lampau. 3. Anti HBc (antibodi terhadap antigen inti hepatitis B): terdiri dari 2 tipe yaitu Anti HBc IgM dan Anti HBc IgG. Anti HBc IgM: - Muncul 2 minggu setelah HBsAg terdeteksi dan bertahan hingga 6 bulan. - Berperan pada core window(fase jendela) yaitu saat dimana HBsAg sudah hilang tetapi anti-HBs belum muncul Anti HBc IgG: - Muncul sebelum anti HBcIgM hilang - Terdeteksi pada hepatitis akut dan kronik - Tidak mempunyai efek protektif Interpretasi hasil positif anti-HBc tergantung hasil pemeriksaan HBsAg dan AntiHBs. V. ALAT DAN BAHAN 5.1 Alat 1. VI. Cara Kerja prosedur pemeriksaan : a. Dipipet masing-masing 100 µl serum control (+), serum control (-), dan sample yang akan dianalisa, kemudian dimasukkan ke dalam tiap sumur yang telah ditandai, kecuali blanko
b.
Plate ditutup dengan kertas pelekatdan diinkubasi pada suhu 37 – 40 °C selama 1 jam
c.
Plate diangkat lalu kertas perekat dibuang. Kemudian diisap dengan aspirator lalu diisi dengan larutan pencuci. Teknik penghisapan dan pencucian diulangi sebanyak 4 kali. Setelah pencucian terakhir, larutan yang teersisa dalam sumur tersebut diserap dengan tisu (tahap 3)
d. Ditambahkan 100 µl larutan konjugat kedalam masingmasing sumur kecuali sumur untuk blanko e.
Palate ditutup dengan kertas perekat dan diinkubasi pada suhu 37-40 °C selama 30 menit.
f.
Menjelang 5-10 menit inkubasi kedua berkhir, encerkan larutan kromogen dengan buffer substrat, larutan ini dibuang jika memberikan warna biru
g.
Plate tersebut diangkat dan kertas perekatnya dibuang. Lakuakan teknik pencucian plate seperti tahap III
h.
Ditambahkan 100 µl substart-TMB kedala masing-masing sumur
i.
Diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit
j.
Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 µl H2SO4 dalam masing-masing sumur
k. Pembacaan sumur blano dilakukan pada panjang gelombang 450 nm, dilanjutkan dengan pembacaan masing-masing absorban sumur yang tidak lebih dari 30 menit. Pembacaan Hasil :
Negative control [NC] < 0,200 Hitung negative control rata-rata [NCx] Negative control harus berada p ada range 0,6 – 1,4 kali dari NCx - - f. 2.8.4
Tes validatif PC-NCx C
ut Off Value (COV) = NCx + 0,050
Interpretasi Hasil : Ada atau tidaknya HBsAg dalam sample yang diperiksa ditentukan oleh hubungan nilai absorban
VII.
Pembahasan
Pemeriksaan HBsAg merupakan pemeriksaan yang berguna untuk diagnosa infeksi virus hepatitis B, baik untuk keperluan klinis maupun epidemiologik, skrining darah di unit-unit transfusi darah, serta digunakan pada evaluasi terapi hepatitis B kronis. Pemeriksaan ini juga bermanfaat untuk menetapkan bahwa hepatitis akut yang diderita disebabkan oleh virus B atau superinfeksi dengan virus lain. Dimana HBsAg sendiri merupakan petanda serologik infeksi virus hepatitis B pertama yang muncul di dalam serum dan mulai terdeteksi antara 1 sampai 12 minggu pasca infeksi, mendahului munculnya gejala klinik serta meningkatnya SGPT. HBsAg dalam darah dapat dideteksi dengan tehnik enzyme immunoassay (EIA), enzyme linked immunoassay (ELISA), enzyme linked fluorescent assay (ELFA), atau immunochromatography test (ICT).
Pencucian untuk menghilangkan pembungkus antigen terbentuk kompleksbiotin dan streptolisin menghubungkan alkalin fosfat mengkatalisis hidrolis dan substrat menghasilkan fluoresensi,
Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain : ·
Teknik pengerjaan relatif sederhana
·
Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) ·
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
·
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik) ·
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain : ·
Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen) ·
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal. ·
Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal. ·
Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengan cekungan seban yak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat dan bahan lain yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara lain : ·
Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan
berupa antibodi). ·
Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
·
Sampel yang ingin dites.
·
Cairan pencuci (buffer).
·
Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.
·
Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.
·
ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.
knik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody. Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibody penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan antigen penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody detector sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibody detector yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibody detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :
Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda). http://pandudingin.blogspot.com/2012/04/elisa-test.html
