Panduan Praktikum Fitokimia

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA SEMESTER 4

Disusun oleh :

Ferry Ferdiansyah Sofian Ami Tjitraresmi Yasmiwar Susilawati Dudi Runadi

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015

KATA PENGANTAR Praktikum analisis fitokimia merupakan bagian dari paket materi kuliah fitokimia yang diberikan kepada mahasiswa agar mahasiswa mengetahui

cara-cara

analisis

khususnya tumbuhan obat.

komponen

kimia

dalam

tumbuhan,

Materi praktikum disusun sedemikian rupa

sehingga dapat menunjang serta sekaligus memberikan gambaran yang lebih jelas mengenai materi yang diberikan pada perkuliahan. Melalui praktikum yang terarah diharapkan dapat meningkatkan motivasi dan merangsang inovasi baru dari mahasiswa dalam teknis praktis. Buku panduan praktikum analisis fitokimia ini diupayakan dapat memberi gambaran mengenai tahapan analisis fitokimia yang biasa dilakukan oleh para peneliti bahan alam, dimulai dengan tahapan pengenalan metabolit sekunder dalam tanaman obat melalui penapisan fitokimia, metode ekstraksi untuk memisahkan sebagian besar komponen kimia,

metode

pemisahan

metabolit

sekunder

dengan

teknik

kromatografi, serta metode pemurniannya, sehingga diperoleh komponen tunggal/isolat. Selain itu, juga dipelajari mengenai isolasi minyak atsiri dengan metode destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan. Teknik yang diberikan dalam buku panduan ini merupakan teknik dasar namun dapat diterapkan di laboratorium dan cukup terandalkan. Harapan kami semoga buku Panduan Praktikum Analisis Fitokimia ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya untuk proses pembelajaran di Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, khususnya dalam mata kuliah Fitokimia. Jatinangor, Februari 2015

Penyusun

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN

i


DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR ............................................................ i DAFTAR ISI .....................................................................

ii

PENDAHULUAN

...............................................................

1

Bahan Praktikum

...............................................................

2

Pembagian Tugas Grup Praktikum ........................................

3

Jadwal Praktikum ...............................................................

8

Modul Praktikum 1 ...........................................................

9

Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat .......................

9

Lembar kerja 1 ...................................................................

17

Modul Praktikum 2 ...........................................................

20

Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia Tumbuhan Obat

...

20

Lembar kerja 2 ...................................................................

27

Modul Praktikum 3 ...........................................................

30

Metode Pemisahan Ekstrak ...................................................

30

Lembar kerja 3A .................................................................

36

Lembar kerja 3B .................................................................

38

Modul Praktikum 4 ..........................................................

41

Metode Pemurnian Fraksi ....................................................

41

Lembar kerja 4A ................................................................

48

Lembar kerja 4B ................................................................

50

Modul Praktikum 5 ..........................................................

52

Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri ..............................

52

Lembar kerja 5 ..................................................................

56


ii


1

PENDAHULUAN Fitokimia ialah suatu ilmu yang terletak antara kimia organik bahan alam dan biokimia tumbuhan. Bidang yang menjadi perhatiannya adalah aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, meliputi struktur kimianya, biosintesisnya, perubahan dan metabolismenya, penyebarannya secara alamiah, serta fungsi biologinya. Untuk mengenai

melakukan

analisis

fitokimia

diperlukan

pengetahuan

metode pemisahan, pemurnian, dan identifikasi kandungan

kimia dalam tumbuhan. Pemanfaatan teknik analisis fitokimia yang sudah dikenal

secara

umum

dan

inovasinya

terhadap

teknik

tersebut

diharapkan mampu menangani masalah-masalah yang timbul dalam analisis fitokimia yang terjadi di kemudian hari. Buku

ini

berupa

panduan

praktikum

analisis

fitokimia

bagi

mahasiswa, terdiri dari beberapa topik, dimulai dengan penapisan fitokimia, ekstraksi, fraksinasi, pemurnian/isolasi, serta isolasi minyak atsiri dengan destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan. Metode penapisan fitokimia merupakan praktikum paling mendasar yang bertujuan untuk mengetahui golongan metabolit yang terkandung dalam simplisia dan merupakan panduan untuk melakukan ekstraksi, pemisahan, dan identifikasi isolatnya. Ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu ekstraksi dengan menggunakan pelarut atau tidak menggunakan pelarut organik; dengan penambahan suhu (cara panas) atau pada suhu kamar (cara dingin); atau dengan beberapa metode ekstraksi lainnya.

Pemilihan

metode ekstraksi tergantung pada sifat kimia dari kandungan tumbuhan tersebut. Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi mengandung berbagai macam metabolit primer dan sekunder. Untuk pemisahan metabolit dalam ekstrak tersebut, dapat digunakan beberapa cara metode fraksinasi seperti ekstraksi cair-cair (ECC) dan

kromatografi

dipercepat (Fast Chromatography). Metode pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memperoleh suatu isolat/komponen yang terdapat dalam fraksi. Pemurnian dapat dilakukan

PENDAHULUAN



2

dengan satu atau gabungan beberapa teknik kromatografi, seperti kromatografi datar dan metode kromatografi kolom. Topik lain membahas metode penetapan kadar minyak atsiri menggunakan metode destilasi dengan alat destilasi Stahl. Metode penetapan kadar minyak atsiri menggunakan alat destilasi Stahl ini merupakan metode yang paling sederhana tetapi mempunyai ketepatan dan ketelitian yang dapat diandalkan, sehingga metode ini dapat dikatakan menjadi metode baku bagi penetapan kadar minyak atsiri dalam suatu simplisia.

Selain itu,

dilakukan isolasi

minyak atsiri

menggunakan destilasi air, serta destlasi uap dan air untuk jumlah simplisia yang lebih banyak dari bagian tanaman. Selain itu, isolasi minyak atsiri pun dapat dilakukan metode enfleurasi untuk simplisia dari bagian bunga tanaman, serta metode ekstraksi hasil pemerasan dari bagian kulit buah tanaman.

BAHAN PRAKTIKUM a. PENAPISAN FITOKIMIA (MODUL 1) Grup I

Grup III

1. Morindae citrifoliae fructus

1. Andrographidis herba

2. Chinae cortex

2. Guazumae folium

Grup II

Grup IV

1. Retrofracti fructus

1. Curcumae domesticae rhizoma

2.

2. Rhei radix

Coffeae semen

Catatan : Jumlah simplisia yang digunakan ±10 gram.

b. ISOLASI (MODUL 2 S/D MODUL 4) 1. Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) ; 250 gram 2. Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa) ; 250 gram 3. Andrographidis herba (Herba Sambiloto) ; 250 gram 4. Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit) ; 250 gram

Catatan : untuk metode Refluks dan Soxhlet, jumlah simplisia yang digunakan sebanyak 100 gram.

PENDAHULUAN



3

c. ISOLASI DAN PENETAPAN KADAR MINYAK ATSIRI (MODUL 5) 1. Caryophylli flos (200 g), menggunakan destilasi uap dan air. 2. Jasmini Flos (100 g), menggunakan metode enfleurasi. 3. Canangae

odoratae

Flos

(100

g),

menggunakan

metode

enfleurasi. 4. Zingiberis Rhizoma (100 g/500 g), menggunakan destilasi air atau destilasi uap dan air. 5. Citri aurantifoliae Percarpium (500 g), menggunakan metode pemerasan dan ekstraksi. 6. Melaleucae leucadendrae Folium (100 g/500 g), menggunakan metode destilasi air atau destilasi uap dan air.

PEMBAGIAN TUGAS GRUP PRAKTIKUM Satu kelompok praktikum dibagi dalam 4 grup dengan pembagian tugas sebagai berikut :

KELOMPOK 1 : SENIN (13.00-16.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP

Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)

I

METODE EKSTRAKSI

BAHAN

Maserasi (etanol 70%)

III

Andrographidis herba (Herba Sambiloto)

Dengan Alat Refluks (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)

IV

Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)

Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)

II

METODE FRAKSINASI KCV

METODE ISOLASI

TARGET ISOLASI SENYAWA

K.Kolom

ECC

K.Kolom

Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon) Alkaloid (misal : piperin)

ECC

KLT Preparatif

KCV

KLT Preparatif

Terpenoid (misal : andrografolid) Curcuminoid (misal : curcumin)

b. ISOLASI MINYAK ATSIRI GRUP

BAHAN

METODE ISOLASI

I

Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh)

Destilasi uap dan air

II

Jasmini Flos (Bunga Melati)

Enfleurasi

III

Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe)

Destilasi air

IV

Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis)

Pemerasan dan ekstraksi

PENDAHULUAN



4

KELOMPOK 2 : SELASA (10.00-13.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP

BAHAN Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)

METODE EKSTRAKSI

III


Dengan Alat Refluks (etanol 95%) Dengan alat Soxhlet (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)

IV


Dengan Alat Refluks (etanol 95%)

I

II


METODE ISOLASI


KLT Preparatif


KCV

K.Kolom

ECC

KLT Preparatif

ECC

K.Kolom



BAHAN

METODE ISOLASI

I



II

Canangae odoratae Flos (Bunga Kenanga)

Enfleurasi

III

Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih)

Destilasi air

IV



KELOMPOK 3 : RABU (10.00-13.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP

BAHAN

METODE EKSTRAKSI

METODE FRAKSINASI ECC

METODE ISOLASI


KLT Preparatif



Maserasi (etanol 70%) Maserasi (etanol 95%)

KCV

KLT Preparatif

III


KCV

K.Kolom

IV


Dengan alat Soxhlet (etanol 95%) Dengan Alat Refluks (etanol 95%)

ECC

K.Kolom

I

II

PENDAHULUAN




5


BAHAN

METODE ISOLASI

I



II


Enfleurasi

III


Destilasi air

IV



KELOMPOK 4 : RABU (13.00-16.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP

BAHAN

METODE EKSTRAKSI


Dengan alat Soxhlet (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)

III


IV


Dengan Alat Refluks (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)

I

II


METODE ISOLASI


KLT Preparatif


ECC

K.Kolom

KCV

K.Kolom

ECC

KLT Preparatif



BAHAN

METODE ISOLASI

I



II


Enfleurasi

III


Destilasi air

IV



PENDAHULUAN



6

KELOMPOK 5 : KAMIS (10.00-13.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP


I

II

METODE EKSTRAKSI

BAHAN

III


IV


Dengan Alat Refluks (etanol 95%) Dengan alat Soxhlet (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)


METODE ISOLASI


K.Kolom


KCV

KLT Preparatif

ECC

KLT Preparatif

ECC

K.Kolom



BAHAN

METODE ISOLASI

I



II


Enfleurasi

III


Destilasi air

IV



KELOMPOK 6 : JUMAT (07.00-10.00) a. ISOLASI SENYAWA GRUP

BAHAN Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)

I

II

III


IV


PENDAHULUAN

METODE EKSTRAKSI Maserasi (etanol 70%) Dengan Alat Refluks (etanol 95%) Dengan alat Soxhlet (etanol 95%) Maserasi (etanol 95%)

METODE FRAKSINASI ECC

METODE ISOLASI


K.Kolom

KCV

K.Kolom


KCV

KLT Preparatif

ECC

KLT Preparatif




7


BAHAN

METODE ISOLASI

I



II


Enfleurasi

III


Destilasi air

IV



PENDAHULUAN



8

JADWAL PRAKTIKUM Semua grup melakukan Modul Praktikum 1 (Penapisan fitokimia) sampai Modul Praktikum 5 (isolasi minyak atsiri) yang dikerjakan sesuai dengan jadwal praktikum berikut ini : Pertemuan ke1 2

3

4

5

KEGIATAN Responsi : Teori Metode Pemisahan Senyawa Bahan Alam a. b.

Presentasi metode isolasi sampel.Persiapan alat, bahan, dan responsi studi literatur metode isolasi Ekstraksi (2 Kelompok awal)

a.

Diskusi : Metode Isolasi Sampel

b.

Ekstraksi (2 Kelompok akhir)

c.

Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok awal)

a.

Penapisan Fitokimia (masing-masing kelompok 2 sampel)

b.

Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok akhir)

c.

Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok awal)

Evaluasi mutu ekstrak : a.

Perhitungan Rendemen Ekstrak

b.

Perhitungan Bobot Jenis Ekstrak

c.

Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok akhir)

d.

Pemantauan KLT, dan

e.

Pemantauan Pola Dinamolisis

6

Fraksinasi : ECC dan KCV

7

a.

Fraksinasi Lanjutan : ECC dan KCV

b.

KLT fraksi dan penetapan senyawa identitas

c.

Isolasi Minyak atsiri dengan Destilasi Stahl

a.

Persiapan isolasi senyawa identitas, penetapan eluen KK dan pengembang KLT preparatif KLT minyak atsiri

8

b. 9 10 11

Isolasi senyawa identitas dengan KK atau KLT preparatif dari ekstrak dan minyak atsiri a. KLT isolat b.

Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi

a.

KLT isolat (Lanjutan)

b.

Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi (Lanjutan)

c.

Perhitungan rendemen isolat

12

Presentasi Akhir (2 kelompok)

13

Presentasi Akhir (2 kelompok)

PENDAHULUAN



9

MODUL PRAKTIKUM 1 Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan

pengujian

penapisan

fitokimia

terhadap

beberapa

simplisia tumbuhan obat sehingga diketahui golongan metabolit sekunder yang terkandung dalam simplisia tersebut.

TUJUAN INSTRUKSIONAL Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu menganalisis kandungan metabolit sekunder suatu simplisia tumbuhan obat atas dasar hasil pengujian penapisan fitokimia.

TEORI Tumbuhan obat adalah tumbuhan atau bagian-bagiannya yang digunakan

baik

untuk

pencegahan

ataupun

pengobatan

penyakit-

penyakit tertentu, atas dasar pengggunaan secara empirik ataupun pengujian ilmiah. Pengujian khasiat suatu tanaman obat dilakukan melalui uji pra klinik hingga uji klinik. Pengembangan obat tradisional di Indonesia semakin menunjukkan kemajuan yang mengarah kepada upaya memasuki jalur pelayanan kesehatan formal. Obat tradisional yang akan memasuki jalur pelayanan kesehatan formal dituntut mempunyai kualitas yang memenuhi standar yang

telah

ditetapkan.

Evaluasi

kualitas

ini

diperlukan

untuk

mendapatkan obat tradisional yang memenuhi persyaratan, memiliki khasiat, dan aman digunakan. Khasiat atau aktivitas farmakologi yang menjadi tumpuan bagi penggunaan suatu tumbuhan sebagai tumbuhan obat ditentukan oleh kandungan senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan atau bagian tumbuhan tersebut. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang mempunyai arti penting dalam kaitan dengan khasiat atau aktivitas

MODUL PRAKTIKUM 1



farmakologi

tumbuhan

obat

adalah

10

senyawa

metabolit

sekunder

kelompok alkaloid, tanin dan polifenolat, mono dan sesquiterpen, senyawa kuinon, glikosida jantung, flavonoid, triterpenoid dan steroid, serta saponin. Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai tumbuhan obat atau dalam hal penelusuran senyawa aktif baru yang berasal dari bahan alam yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obatobat baru atau menjadi prototype senyawa obat dengan aktivitas tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji sederhana

tetapi

terandalkan.

Metode

uji

fitokimia

yang

banyak

digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat dilakukan di lapangan atau di laboratorium.

METODE EVALUASI FITOKIMIA Metode

evaluasi

fitokimia

meliputi

penapisan

fitokimia

dan

pencarian senyawa identitas melalui analisis kromatografi.

1. PENAPISAN FITOKIMIA a. Alkaloid Alkaloid

adalah

senyawa

metabolit

sekunder

yang

dalam

struktur molekulnya terdapat atom Nitrogen (umumnya heterosiklik). Adanya

pasangan

elektron

bebas

pada

atom

Nitrogen

ini

menyebabkan alkaloid dapat membentuk kompleks yang tidak larut dengan logam-logam berat. Fenomena ini merupakan dasar bagi reaksi pengenalan adanya alkaloid dalam simplisia tumbuhan obat. Alkaloid

adalah

kelompok

atau

golongan

senyawa

kimia

metabolit sekunder asal tumbuhan atau hewan dengan struktur yang mempunyai

atom

Nitrogen

(umumnya

terikat

dalam

lingkar

heterosiklik), bersifat basa, serta mempunyai aktivitas fisiologis tertentu.

MODUL PRAKTIKUM 1



11

Berdasarkan biosintesisnya, alkaloid terbagi atas: (1) True alkaloid (alkaloid sesungguhnya), biosintesisnya berasal dari asam amino, bersifat basa, umumnya mempunyai atom Nitrogen dalam lingkar heterosiklik (2) Proto alkaloid, merupakan amina yang bersifat sederhana dengan

atom

Nitrogen

yang

tidak

terdapat

dalam

lingkar

heterosiklik. Contoh meskalin, efedrin (3) Pseudo alkaloid, biosintesisnya tidak berasal dari asam amino. Contohnya basa purin (antara lain kafein) Umumnya alkaloid bersifat basa karena adanya pasangan elektron bebas pada atom Nitrogennya (Teori Asam-Basa Lewis). Dalam tumbuhan biasanya alkaloid terdapat dalam bentuk garam (tartrat, laktat, sitrat). Sifat kimia alkaloid ini merupakan dasar bagi cara isolasi maupun pengenalannya. Pengenalan alkaloid didasarkan pada kemampuannya membentuk senyawa kompleks tidak larut dengan pereaksi-pereaksi yang mengandung logam berat, misalnya pereaksi Mayer (mengandung kalium ioda dan raksa (II) klorida), pereaksi Dragendorff (mengandung Bismuth subnitrat dan raksa (II) klorida). Alkaloid dengan pereaksi Mayer akan memberikan endapan putih, sedangkan pereaksi Dragendorff akan memberikan endapan jingga coklat. Walaupun reaksi pengenalan alkaloid dengan kedua pereaksi

tersebut

merupakan

reaksi

pengenalan

umum

tetapi

beberapa senyawa non alkaloid dapat mengendap dengan pereaksipereaksi tersebut di atas, misalnya protein, kumarin, α-piron, hidroksi flavon serta tannin. Reaksi pengenalan palsu tersebut terkenal dengan sebutan reaksi positif palsu (false positive). Perlu menjadi perhatian, selain adanya reaksi positif palsu, dengan metode ini senyawa alkaloid kuarterner dalam simplisia tidak dapat diubah menjadi alkaloid bentuk basa dan akan tetap tinggal dalam sel, sehingga tidak dapat dikenali dengan metode pengendapan oleh reaksi-reaksi tersebut di atas. Keadaan seperti itu disebut sebagai reaksi negatif palsu (false negative).

MODUL PRAKTIKUM 1



12

Metode: Simplisia dibasakan dengan ammonia encer, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan beberapa milliliter kloroform sambil terus digerus. Setelah disaring, filtrat dikocok dengan asam klorida 2 N. Lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan diperlakukan sebagai berikut : (1) Bagian pertama digunakan sebagai blangko (2) Bagian kedua ditetesi dengan larutan pereaksi Mayer, kemudian diamati ada atau tidaknya endapan berwarna putih (3) Bagian ketiga ditetesi dengan larutan pereaksi Dragendorff, kemudian diamati ada atau tidaknya endapan jingga coklat

b. Flavonoid Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yang memberikan berbagai warna pada tumbuhan. Flavonoid mempunyai struktur yang sangat bervariasi, namun pada umumnya mempunyai struktur dasar:

Gambar. Struktur dasar Flavonoid Pengenalan flavonoid didasarkan pada reaksi reduksi gugusan karbonil pada lingkar δ-lakton menjadi gugusan alkohol membentuk senyawa hidroksi yang berwarna-warna tergantung pada gugusan fungsional yang terikat pada lingkar A atau B. warna yang terjadi dapat ditarik oleh amil alkohol. Metode: Senyawa dipanaskan dengan campuran logam Magnesium dan asam

klorida

5N,

kemudian

disaring.

Adanya

flavonoid

akan

menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat ditarik oleh amil

MODUL PRAKTIKUM 1



13

alkohol. Untuk lebih memudahkan pengamatan sebaiknya digunakan percobaan blangko.

c. Tanin dan Polifenol Tanin dan senyawa polifenolat alam mudah dikenali melalui pengenalan gugusan fenol yang dapat memberikan warna biru-hitam dengan pereaksi besi (III) klorida. Untuk membedakan tanin dengan polifenolat alam, digunakan sifat tanin yang dapat mengendapkan larutan gelatin 1%. Metode: Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air di atas tangas air, kemudian disaring panas-panas. Sebagian kecil filtrat ditetesi larutan besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan adanya tanin dan polifenol alam. Sebagian kecil filtrat diuji ulang dengan penambahan larutan gelatin 1%. Adanya endapan putih menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat tanin.

d. Saponin Saponin adalah senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan yang bersifat dapat membentuk busa, serta dapat menghemolisis sel darah merah. Struktur kimia umumnya merupakan glikosida, yang bila dihidrolisis akan menghasilkan bagian glikon (senyawa gula) dan aglikon (senyawa non gula). Struktur aglikon tannin umumnya merupakan struktur triterpenoid dan struktur steroid, hingga ditinjau dari strukturnya saponin dapat dipilah menjadi saponin-triterpenoid dan saponin-steroid. Reaksi pengenalan saponin didasarkan pada sifatnya yang mampu memberikan busa pada pengocokan dan persisten pada penambahan sedikit asam atau pada pendiaman. Metode: Di atas tangas air, dalam tabung reaksi, simplisia dicampur dengan air dan dipanaskan beberapa saat, kemudian disaring. Setelah dingin filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama

MODUL PRAKTIKUM 1



14

lebih kurang 30 detik. Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1 cm dan persisten selama beberapa menit serta tidak hilang setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat saponin.

e. Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid Monoterpenoid dan sesquiterpenoid adalah senyawa-senyawa C10-C15

yang

monoterpenoid

tersusun dan

dari

unit

sesquiterpenoid

isoprene ini

(C5H8).

merupakan

Senyawa komponen-

komponen penyusun minyak atsiri. Reaksi pengenalan didasarkan pada kemampuannya membentuk warna-warna dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat. Metode: Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat dari pinggir cawan. Terbentuknya warnawarna

menunjukkan

adanya

senyawa

monoterpenoid

dan

sesquiterpenoid.

f.

Steroid dan Triterpenoid Senyawa kelompok steroid dan triterpenoid adalah senyawasenyawa kelompok metabolit sekunder yang mempunyai struktur dasar yang hampir sama.

(a)

(b)

Gambar. (a) Steroid, (b) Triterpenoid

MODUL PRAKTIKUM 1



Pengenalan

senyawa

triterpenoid

15

dan

steroid

didasarkan

kemampuannya membentuk warna dengan pereaksi LiebermannBurchard.

Pereaksi Liebermann-Burchard dibuat dengan cara mencampurkan 20 bagian asam asetat anhidrat dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Pereaksi ini harus digunakan dalam media bebas air. Metode: Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga kering.

Pada

residu

diteteskan

pereaksi

Liebermann-Burchard.

Terbentuknya warna ungu menunjukkan bahwa dalam simplisia mengandung

senyawa

kelompok

triterpenoid,

sedangkan

bila

terbentuk warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa kelompok steroid.

g. Senyawa Kuinon Senyawa kuinon umumnya merupakan turunan p-benzokuinon.

Gambar. p-benzokuinon Pengenalan

senyawa

ini

didasarkan

pada

kemampuannya

membentuk garam berwarna antara hidrokuinon dengan larutan alkali kuat (NaOH atau KOH).

MODUL PRAKTIKUM 1



16

Gambar. Reaksi hidrokuinon dengan larutan alkali kuat Metode: Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air, kemudian disaring. Filtrat ditetesi dengan larutan NaOH. Terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya senyawa kelompok kuinon.

PUSTAKA Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening Of Plants.J. Pharm. Sci. 55(3): 243-269 Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia. Terjemahan K. Padmawinata dan I. Sudiro.: Penerbit ITB. Bandung Marini, C.P. 1981. Plant Screening By Chemical And Chromatography Prosedure in the Field Condition. J. Chromatogr. 213:117-122

MODUL PRAKTIKUM 1



17

LEMBAR KERJA 1 PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 1

: Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat

NAMA MAHASISWA

: .............................................................

NPM

: .............................................................

KELOMPOK

: .............................................................

NAMA TANAMAN

: .............................................................

NAMA SIMPLISIA

: .............................................................

METODE DAN HASIL :

1

Golongan Senyawa ALKALOID

2

SENYAWA

No

POLIFENOLAT

MODUL PRAKTIKUM 1

Prosedur

Hasil (+/-)

Paraf Asisten

1. 1 gram serbuk simplisia dibasakan dengan 10 mL amonia 10%, digerus menggunakan mortar. 2. Tambahkan 5 mL kloroform, gerus kuat. 3. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas, masukkan ke dalam tabung reaksi. 4. Tambahkan kedalamnya HCl 2N (1:10 v/v). Kocok kuat hingga terbentuk 2 lapisan. 5. Lapisan asam dipipet,kemudian dibagi menjadi 3 bagian : a. Filtrat 1 : ditambahkan pereaksi Mayer, terjadinya kekeruhan atau endapan putih menunjukkan adanya alkaloid. b. Filtrat 2 : ditambahkan pereaksi Dragendorff, terjadinya endapan jingga coklat menunjukkan adanya alkaloid. c. Filtrat 3 : digunakan sebagai blanko. 1. 50 mg serbuk simplisia dalam tabung reaksi dididihkandalam 50 mL air selama 15 menit,



No

Golongan Senyawa

Prosedur

2.

3

TANIN

3.

4

FLAVONOID

1.

2. 3.

5

MONOTERPENOID DAN SESQUITERPENOID

6

STEROID DAN TRITERPENOID

MODUL PRAKTIKUM 1

1.

18

Hasil (+/-)

Paraf Asisten

kemudian didinginkan dan disaring (Filtrat A). Kedalam filtrat ditambahkan larutan pereaksi FeCl3 1%. Terbentuknya warna biruhitam menunjukkan adanya senyawa polifenolat. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan gelatin 1%, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin. 1 gram serbuk simplisia ditambahkan 50 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit serbuk Mg dan 5 mL HCl 2N. Kemudian tambahkan amillalkohol, lalu dikocok kuatkuat dan dibiarkan hingga memisah. Terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik dengan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. 1 gram simplisia digerus dengan 5 mL eter, kemudian dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas (Filtrat B).

2. Filtrat ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering. 3. Ke dalam residu diteteskan larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat melalui pinggir cawan, terbentuknya warnawarna menunjukkan adanya mono dan sesquiterpenoid. 4. Filtrat B ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.



No

Golongan Senyawa

7

KUINON

8

SAPONIN

19

Prosedur

Hasil (+/-)

Paraf Asisten

5. Ke dalam residu diteteskan 2 hingga 3 tetes pereaksi Liebermann Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya golongan triterpenoid, sedangkan terbentuknya warna biru hijau menunjukkan adanya golongan steroid. 6. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan KOH 5% terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya golongan kuinon 7. Sejumlah 10 ml Filtrat A, dikocok vertikal dalam tabung reaksi selama 10 detik. 8. Terbentuknya busa yang persisten pada penambahan asam klorida atau pada pendiaman selama lebih kurang 10 menit, menunjukkan adanya golongan saponin.

KESIMPULAN :

Dalam simplisia yang diperiksa, diperkirakan terdapat senyawa metabolit sekunder golongan: 1. ................................................................................ 2. ................................................................................ 3. ................................................................................ 4. ................................................................................ 5. ................................................................................ 6. ................................................................................

Paraf Asisten Praktikum Hari/Tanggal :

(

MODUL PRAKTIKUM 1

)

Paraf Praktikan Hari/Tanggal :

(

)



20

MODUL PRAKTIKUM 2 Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia Tumbuhan Obat

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan obat dengan beberapa metode ekstraksi.

TUJUAN INSTRUKSIONAL Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan mampu melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan obat dengan cara sederhana namun terandalkan.

TEORI Pada analisis fitokimia tumbuhan obat idealnya digunakan bahan baku segar yang dididihkan dengan alkohol selama beberapa menit segera setelah dikumpulkan. Hal ini dimaksudkan untuk menonaktifkan enzim, supaya tidak terjadi reaksi enzimatis selama percobaan dilakukan. Kadang-kadang tumbuhan yang akan diteliti tidak dapat diperoleh dengan segera dan bahkan mungkin kolektornya tinggal di daerah atau benua lain, sehingga bahan baku dikeringkan terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi. Pengeringan ini harus dilakukan dengan hati-hati dan dijaga jangan sampai terjadi perubahan kimia. Oleh karena itu, tumbuhan sesegera mungkin dikeringkan diudara terbuka tanpa menggunakan panas tinggi. Setelah kering, bahan bisa disimpan lama sebelum dilakukan ekstraksi. Ekstraksi

merupakan

tahap

awal

pada

jalur

isolasi

metabolit

sekunder dari tumbuhan obat. Ekstraksi dapat dibagi menjadi beberapa golongan tergantung dari beberapa keadaan yang menyertainya. Ditinjau dari suhu, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan, yaitu ekstraksi dingin dan ekstraksi panas. Ekstraksi dingin misalnya maserasi dan perkolasi. Ekstraksi dingin dilakukan terhadap bahan tumbuhan yang

MODUL PRAKTIKUM 2



21

mengandung senyawa yang bersifat termolabil. Metode ini memerlukan waktu yang relatif lebih lama bila dibandingkan dengan ekstraksi panas. Ekstraksi

panas

misalnya

dengan cara

infus,

dekok, refluks,

dan

menggunakan alat soxhlet. Ditinjau dari banyaknya ulangan proses, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan pula, yaitu ekstraksi satu kali, misalnya maserasi dan ekstraksi berulang kali, misalnya dengan alat soxhlet. Dalam hal ini efektivitas proses ekstraksi akan ditentukan oleh banyaknya pengulangan proses ekstraksi. Ekstraksi berulang akan lebih efektif dibanding dengan ekstraksi satu kali, sesuai dengan perumusan sebagai berikut :

Wn Wo K V S n

= = = = = =

Jumlah zat yang belum terekstraksi Jumlah zat mula-mula Koefisien partisi zat Volume awal Volume larutan pengekstraksi Jumlah pengulangan ekstraksi

Persamaan di atas umumnya digunakan untuk ekstraksi cair-cair, namun untuk ekstraksi padat-cair secara umum persamaan tersebut juga dapat diterapkan. Ditinjau dari penggunaan pelarut, metode ekstraksi terdiri atas metode yang menggunakan pelarut seperti maserasi, perkolasi, soxhlet, refluks, infus, dekok dan digesti dan metode ekstraksi tanpa pelarut misalnya destilasi uap yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan titik uap. Terdapat beberapa metode ekstraksi lainnya misalnya ekstraksi dengan karbondioksida superkritik, ekstraksi ultrasonik dan ekstraksi energi listrik. Cara ekstraksi yang tepat tergantung pada jaringan tumbuhan, kadar air dan golongan senyawa yang akan diisolasi. Pada umumnya diperlukan mematikan jaringan tumbuhan terlebih dahulu dengan etanol mendidih supaya tidak terjadi oksidasi enzimatis atau hidrolisis. Etanol merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi tahap awal dan dapat digunakan untuk menghilangkan klorofil yang terdapat pada simplisia, misalnya daun yang berwarna hijau. Pada ekstraksi pertama klorofil akan

MODUL PRAKTIKUM 2



22

tertarik dan pada ekstraksi selanjutnya dengan etanol diharapkan simplisia telah bebas dari klorofil. Berdasarkan pengertian bahwa ekstraksi adalah metode penarikan metabolit sekunder dari tumbuhan atau bagian tumbuhan dengan pelarut yang sesuai, maka dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip: polar loves polar, nonpolar loves nonpolar, artinya bila kita akan mengekstraksi senyawa polar, harus digunakan pelarut polar dan apabila kita akan mengekstraksi senyawa nonpolar, maka harus digunakan pelarut nonpolar. Namun pada prakteknya ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut dalam gradasi kepolaran, mulai dari nonpolar ke polar atau dari polar ke nonpolar. Contoh pelarut polar adalah air, metanol, etanol, pelarut semi polar adalah aseton, etil asetat, kloroform dan pelarut nonpolar adalah n-heksana, eter minyak tanah, toluen, benzene.

Pelarut-pelarut

nonpolar

benzena,

kloroform

dan

karbon

tetraklorida sekarang jarang digunakan, karena sifatnya hepatotoksik atau karsinogenik.

Pelarut metanol merupakan pelarut yang baik daripada

etanol tetapi kini dihindari karena memiliki sifat toksik akut dan kronik. Untuk memperoleh ekstrak total, pelarut yang digunakan dipilih yang dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung dalam simplisia tanaman obat. Campuran pelarut alkohol-air merupakan campuran yang baik

untuk ekstraksi awal dan diperbolehkan menurut

peraturan . Faktor utama untuk mempertimbangkan pemilihan cairan pernyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja/proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan keamanan. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum putar pada tekanan rendah (rotavapor=rotary evaporator) hingga diperoleh ekstrak kental. Terhadap ekstrak kental dilakukan pemeriksaan kualitas ekstrak yang meliputi parameter kimia dan fisika seperti organoleptik, pola kromatogram (lapis tipis dan dinamolisis), kadar air, dan bobot jenis ekstrak.

MODUL PRAKTIKUM 2



23

PROSEDUR EKSTRAKSI 1. MASERASI Bagian dasar maserator dilapisi dengan kapas sebagai penyaring. Kemudian dimasukkan sebanyak 250 gram serbuk simplisia ke dalam maserator. Tambahkan pelarut etanol 70% atau 95% secukupnya dan biarkan selama kira-kira 10 menit agar terjadi proses pembasahan simplisia, kemudian ditambahkan pelarut etanol sampai seluruh serbuk simplisia terendam. Didiamkan selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian. Ekstraksi diulangi sampai ekstrak cair yang diperoleh hampir tidak berwarna. Ukur volume ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 30-40 oC sehingga diperoleh ekstrak kental.

2. EKSTRAKSI DENGAN ALAT SOXHLET Tuangkan 250 mL pelarut etanol 95% ke dalam labu alas bulat atau

sampai

kurang

lebih

1/2-2/3

bagian

volume

labu

dan

ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia sebanyak 50 gram disiapkan dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung Soxhlet. Pasang alat soxhlet sesuai tempatnya dan tambahkan 50 mL pelarut dari bagian atas tabung soxhlet untuk pembasahan simplisia dan nyalakan heating mantle sampai suhu mencapai titik didih pelarut.

Ekstraksi simplisia sampai tetesan pelarut hampir tidak

berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental.

3. EKSTRAKSI DENGAN CARA REFLUKS Sebanyak 50 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu alas bulat, tambahkan kedalamnya pelarut etanol 95% sebanyak 250 ml. Pasangkan kondensor dengan alat refluks dan nyalakan heating mantle sampai suhu titik didih pelarut.

Ekstraksi dilakukan sampai

tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental.

MODUL PRAKTIKUM 2



24

PEMERIKSAAN PARAMETER EKSTRAK: Pemeriksaan parameter ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas

ekstrak

dilihat

dari

sifat

fisik

dan

kandungan

kimianya.

Parameter yang diperiksa adalah sebagai berikut : 1. Organoleptik Ekstrak Pemeriksaan

menggunakan

panca

indera

untuk

mendiskripsikan

bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak yang diperoleh.

2. Rendemen Ekstrak Rendemen dapat ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :

%

Untuk menetapkan rendemen ekstrak, sejumlah tertentu ekstrak kental dalam cawan penguap ditimbang kemudian diuapkan di atas penangas air dengan temperatur 40-50˚C sampai bobot tetap. Tentukan berat ekstrak setelah penguapan dengan mengurangkan dengan bobot cawan kosong, kemudian hitung rendemen ekstrak (% b/b) sesuai dengan rumus di atas.

3. Bobot Jenis Ekstrak Penetapan bobot jenis ekstrak dapat dilakukan sebagai berikut. Ditimbang

piknometer

dengan

volume

tertentu

dalam

keadaan

kosong. Kemudian piknometer diisi penuh dengan air dan ditimbang ulang. Kerapatan air dapat ditetapkan.

Kemudian piknometer

dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak, lalu ditimbang. Melalui berat ekstrak yang mempunyai

volume tertentu, dapat ditetapkan

kerapatan ekstrak. Bobot jenis ekstrak ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :

MODUL PRAKTIKUM 2



25

4. Kadar Air Ekstrak Penetapan kadar air ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa cara misalnya dengan titrasi langsung atau tidak langsung (pereaksi Karl-Fischer), destilasi atau gravimetri. Pada praktikum ini akan dilakukan penetapan kadar air dengan destilasi menggunakan destilasi toluene. Prosedur : Ke dalam labu bersih dan kering dimasukkan sejumlah ekstrak kental yang telah ditimbang seksama kemudian tambahkan 200 ml toluene, hubungkan alat. Tuangkan toluene ke dalam labu penerima melalui alat pendingin.

Panaskan labu hati-hati selama 15 menit.

Setelah toluen mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, biarkan tabung penerima mendingin hingga suhu kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, baca volume air. Hitung kadar air dalam % v/b

5. Pola Kromatogram Lapis Tipis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan fasa diam silika gel GF 254 dan fasa gerak/pengembang kombinasi pelarut dengan perbandingan

yang

cocok.

Untuk

memperoleh

perbandingan

pengembang yang optimal, dapat diperoleh dari literatur atau datadata penelitian atau mencoba dengan perbandingan pelarut polar, semipolar atau non polar yang umum. Prosedur : Pelat silika gel disiapkan dengan ukuran tertentu kemudian ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan pipa kapiler, biarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap.

Pelat

silika kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan cairan pengembang. Proses kromatografi dihentikan sampai cairan pengembang sampai ke garis

MODUL PRAKTIKUM 2



26

depan. Amati pola kromatogram dibawah lampu UV 254 dan 366 nm dan hitung Rf setiap bercak yang teramati. Penampak bercak dapat juga menggunakan asam sulfat 10% dalam metanol.

6. Pola Dinamolisis Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut. Kertas saring Whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi, kemudian dipasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring bersumbu ini kemudian ditutupkan pada cawan petri yang berisi maserat/ekstrak cair. Biarkan terjadi proses difusi sirkular selama kurang lebih 10 menit. Pola dinamolisis diamati.

PUSTAKA Harborne, J.B. 1973. Phytochemical Methods , A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. Chapmann and Hall. London, 132. Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Dirjen POM. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 9-17. Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia, jilid IV. 154-157

MODUL PRAKTIKUM 2



27

LEMBAR KERJA 2 PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 2

: Ektraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia Tumbuhan Obat

NAMA MAHASISWA

: .............................................................

NPM

: .............................................................

KELOMPOK

: .............................................................

NAMA SIMPLISIA

: .............................................................

METODE EKSTRAKSI

: .............................................................

HASIL PERCOBAAN

:

1. Organoleptik Ekstrak Bentuk

: ....................

Warna

: ....................

Bau

: ....................

Rasa

: ....................

2. Rendemen Ekstrak Volume ekstrak kental

: .................

mL

Berat cawan kosong

: .................

g

Berat cawan + ekstrak

: .................

g

Berat cawan+ekstrak setelah penguapan : .................

g

Berat simplisia awal

: .................

g

Rendemen ekstrak

: .................

% b/b

Berat piknometer kosong

: .................

g

Berat piknometer + air

: .................

g

Berat air

: .................

g

Volume piknometer

: .................

ml

Kerapatan air

: .................

g/mL

Berat piknometer + ekstrak

: .................

g

Volume piknometer

: .................

mL

Berat ekstrak

: .................

g

3. Bobot Jenis Ekstrak

MODUL PRAKTIKUM 2



28

Kerapatan ekstrak

: .................

Bobot jenis ekstrak

: .................

g/mL

4. Kadar Air Ekstrak Berat ekstrak uji

: .................

g

Volume air

: .................

mL

Kadar air

: .................

% v/b

5. Pola Kromatogram Lapis Tipis PENGAMATAN No.bercak

Rf

Sinar tampak

MODUL PRAKTIKUM 2

UV 254 nm

UV 366 nm

H2SO4 10%



29

6. Pola Dinamolisis

Keterangan : Diameter 1 : ........ cm ; warna ......................... Diameter 2 : ........ cm ; warna ......................... Diameter 3 : ........ cm ; warna ......................... Diameter 4 : ........ cm ; warna ......................... Diameter 5 : ........ cm ; warna .........................


(

MODUL PRAKTIKUM 2

)


(

)



30

MODUL PRAKTIKUM 3 Metode Pemisahan Estrak

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan

pemisahan

metabolit

sekunder

dari

ekstrak

atau

fraksinasi tumbuhan obat dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) dan fast chromatography.

TUJUAN INSTRUKSIONAL Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan mampu melakukan pemisahan metabolit sekunder dari ekstrak tumbuhan obat dengan berbagai metode pemisahan.

TEORI Pada sistem pemisahan selalu berhubungan dengan tiga hal, yaitu sampel dan dua pelarut yang saling tidak bercampur satu sama lain. Sampel akan terpartisi atau terdistribusi ke dalam kedua pelarut dan pemisahan akan berakhir setelah terjadi kesetimbangan. Ada tiga macam penggolongan metode pemisahan yang didasarkan pada jenis kedua pelarut, jenis dari pelarut pertama (initial phase), dan pelarut kedua (second phase). Pada masing-masing metode pemisahan kedua pelarut mempunyai nama yang berlainan. Sebagai contoh nama pelarut-pelarut tersebut diperlihatkan pada Tabel 1. Tabel 1. Nama Pelarut pada Beberapa Metode Pemisahan Metode

Pelarut I

Pelarut II

Kromatografi

Fase diam

Fase gerak

ECC

Rafinat

Ekstraktan

Dialisis

Renetat

Difusat

Pemisahan

MODUL PRAKTIKUM 3



31

Pada pengerjaan pemisahan setelah selesai selalu didiamkan sampai terjadi

pemisahan

sempurna,

perbandingan

konsentrasi

sampel

(komponen) pada kedua pelarut menjadi konstan dan dapat diekspresikan sebagai konstanta kesetimbangan yang dinyatakan dengan koefisien distribusi (KD) atau koefisien partisi (Kp). Jika

terdapat dua macam

sampel (A dan B) dan kedua pelarut (1 dan 2), maka : a. Untuk sampel A :

=

! ! "

....................................(1)

! # ! # " b. Untuk sampel B :

=

! ! "

....................................(2)

! # ! # " Jika sampel (komponen) hanya satu, maka berlaku rumus sebagai berikut.

=

$ % $ %"

....................................(3)

[A] = menunjukkan konsentrasi molar komponen Persamaan di atas merupakan persamaan yang sederhana dan hanya berlaku kalau sampel (komponen) terdapat dalam satu bentuk. Untuk perhitungan koefisien partisi yang akurat, persamaan di atas ditulis sebagai berikut.

"

$ % ɣ %" ɣ

$

"

....................................(4)

di mana γ = koefisien aktivitas Persamaan (4) dapat dituliskan juga sebagai berikut :

$ % $ % "

' ( ' (" . ) )

MODUL PRAKTIKUM 3

."

....................................(5)



32

Dimana : WA MWA V

= berat A dalam gram = BM sampel A = Volume pelarut

Apabila BM A diabaikan, maka : $ % " $ %"

=

....................................(6)

(WA)1/(WA)2 = perbandingan berat A dalam pelarut 1 dan pelarut 2, disebut perbandingan partisi atau faktor kapasitas, diberi simbol k’ dan merupakan perbandingan molekul, maka

′=

, " , "

....................................(7)

Perbandingan volume pelarut disebut β, jadi

-

./

....................................(8)

.0

Kp = k’β ....................................(9) Persamaan (9) ini merupakan persamaan hubungan fundamental teori kesetimbangan pada metode pemisahan.

EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC) Ekstraksi cair-cair merupakan metode pemisahan yang sangat populer, yang menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur satu sama lain, yang disebut raffinate dan extractant. Pada pemisahan sampel Q, maka sampel ini akan terpartisi ke dalam rafinat dan ekstraktan dan persamaan-persamaan yang berlaku adalah sebagai berikut :

′= =

4

12

2

12

.5

2

.5 678 .9

=

MODUL PRAKTIKUM 3

=

"

"

:; 06 <

3

....................................(10)

....................................(11)

0

0

06= >

................................(12)



33

dan untuk sampel yang tidak terekstraksi:

1 @ 4 1 @

.5

.5 678 .9

.5 678 .9 1.5 .5 678 .9

78 .9

.5 678 .9

=>

= > 60

............(13)

Kalau kedua volume pelarut sama, β = 1, persamaan 12 dan 13 menjadi :

4

0

7860

................................(14)

dan 1 @ 4

78

7860

................................(15)

Prosedur : Sebanyak 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan metode maserasi atau soxhlet dilarutkan dalam 100 ml air kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambah n-heksana sama banyak dengan pelarut pertama (100 ml), didiamkan. Kemudian dikocok, sesekali udara di dalam corong pisah dikeluarkan, lalu dikocok lagi dan didiamkan sampai kedua pelarut terpisah sempurna. Pemisahan diulang sampai diperoleh fraksi n-heksana yang hampir tidak berwarna. Fraksi nheksana dan fraksi air dipisahkan. Pada fraksi air kemudian ditambahkan pelarut etil asetat 100 ml dan dikocok seperti prosedur diatas. Fraksi nheksana, etil asetat dan air kemudian diuapkan dan dihitung rendemen masing-masing fraksi.

”FAST CHROMATOGRAPHY” Kromatografi dipercepat atau Fast Chromatography merupakan metode kromatografi kolom yang dimodifikasi dengan cara pengurangan tekanan melalui penghisapan dengan kompresor. tekanan

ini

kecepatan

aliran

pelarut

(eluen)

Akibat pengurangan dalam

kolom

akan

meningkat dengan pesat. Hal ini merupakan solusi untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan pada kromatografi kolom konvensional. Seperti halnya kromatografi konvensional, pemisahan komponen pada kromatografi dipercepat dilakukan atas dasar perbedaan migrasi

MODUL PRAKTIKUM 3



34

diferensial melalui kolom yang berisi fasa diam.

Ekstrak yang akan

dipisahkan ditempatkan di bagian atas penjerap dalam kolom, kemudian dielusi dengan pelarut yang bertindak sebagai fasa gerak.

Di dalam

kolom, komponen-komponen akan terpisah sebagai pita-pita yang pada elusi seterusnya akan keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi komponen yang terpisah.

Larutan fraksi komponen yang keluar kolom

ditampung sebagai fraksi (disebut eluat atau efluen) untuk kemudian dianalisis lebih lanjut. Kecepatan perpindahan masing-masing komponen dalam kolom ditentukan oleh kombinasi beberapa faktor yang mengatur karakterisasi sistem adsorpsi dan partisi. Pemisahan dalam kolom adsorpsi tergantung pada antar aksi antara permukaan penjerap, komponen yang dipisahkan, serta sistem pelarut elusi.

Pemisahan dalam kolom partisi merupakan

proses yang menyangkut partisi komponen dalam fasa gerak dan fasa diam yang berupa lapisan tipis pada zat pendukung hidrofilik. Pemilihan sistem penjerap untuk kolom kromatografi cepat dan pemilihan sistem pelarut elusi dapat dilakukan dengan bantuan metode kromatografi lapis tipis.

Data kromatografi lapis tipis sebagai acuan

dalam pemilihan sistem penjerap dan sistem pelarut elusi. Pengembangan sistem kromatografi lapis tipis sebagai model untuk teknik kromatografi kolom memerlukan perhatian pada nilai Rf atau hRf komponen yang dipisahkan. baik

melalui

metode

Komponen yang dapat dipisahkan dengan

kromatografi

cepat

adalah

komponen

yang

mempunyai nilai hRf 20-30 pada sistem kromatografi lapis tipis. Makin besar nilai hRf pada sistem kromatografi lapis tipis makin buruk hasil pemisahan dengan sistem kromatografi cepat atau kromatografi kolom konvensional. Seperti halnya pada kromatografi lapis tipis, pada kromatogafi kolom, baik kromatografi kolom konvensional maupun kromatografi dipercepat, jenis atau tipe penjerap yang digunakan merupakan faktor penting yang menentukan keberhasilan suatu pemisahan.

Namun dari

berbagai jenis dan tipe penjerap dengan segala perbedaan dan sifat-sifat fisikokimianya, alumina dan silika gel G merupakan penjerap yang umum untuk pengerjaan kromatografi kolom, termasuk kromatografi kolom dipercepat.

MODUL PRAKTIKUM 3



35

Prosedur : Kolom diisi dengan ± 50 gram silika gel,

sehingga ½ dari tinggi

kolom terisi silika gel, kemudian vakum dijalankan dan permukaan silika gel ditekan dengan batang pengaduk yang bersalut hingga menjadi padat dan rapat. Setelah itu dimasukkan pelarut yang kepolarannya paling rendah untuk mencoba apakah kolom telah sempurna. Jika kolom sempurna, pelarut tersebut akan turun secara horizontal. Disamping itu ekstrak ditimbang sebanyak 2 gram dan ditambahkan silika gel dengan berat yang sama dengan ekstrak. Kemudian silika gel yang tersalut ekstrak tersebut digerus hingga homogen dan halus kemudian dianginanginkan beberapa saat agar campuran silika gel dan ekstrak yang akan dimasukkan kedalam kolom dalam keadaan kering. Setelah itu campuran ekstrak dan silika gel dimasukkan dalam kolom dan diratakan kemudian dilapisi dengan kertas saring. Pelarut dimasukkan dan vakum dijalankan hinggga pelarut mengelusi komponen kimia dan kering didalam kolom, setelah kering vakum dimatikan. Selanjutnya dimasukkan pelarut lain yang tingkat kepolarannya lebih tinggi dari pelarut pertama dan vakum dijalankan kembali. Begitu seterusnya hingga pelarut yang digunakan itu memiliki tingkat kepolaran yang tinggi yang dapat mengelusi semua komponen kimia dalam ekstrak. Hasil fraksi ditampung dalam botol 150 mL kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan KLT.

PUSTAKA Miller, J.M. 1975. Separation Methods in Chemical Analysis. John Wiley & Sons : New York. 1-9. Gritter, R.J.,Bobbitt, J.M., Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan ke-2, Terj.: Dr. Kosasih P. Penerbit ITB : Bandung. 1-18, 89-96.

MODUL PRAKTIKUM 3



36

LEMBAR KERJA 3A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 3A

: Metode Pemisahan Ekstrak

NAMA MAHASISWA

: ............................................................

NPM

: ............................................................

KELOMPOK

: ............................................................

NAMA SIMPLISIA

: ............................................................

METODE PEMISAHAN

: EKSTRAKSI CAIR-CAIR

PROSEDUR I.

:

EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC) 1.

Timbang 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan metode maserasia tau soxhlet kemudian dilarutkan dalam 100 mL aquades. Cara melarutkannya adalah kepada ekstrak ditambahkan

sedikit

demi

sedikit

aquades

sampai

ekstrak

tercampur homogen 2.

Masukkan larutan ekstrak ke dalam corong pisah dan tambahkan pelarut kedua (n-heksana) sama banyak dengan pelarut pertama

3.

Kocok larutan dalam corong pisah dengan seksama sambil sesekali udara dalam corong dikeluarkan

4.

Diamkan larutan dalam corong pisah sampai kedua pelarut terpisah sempurna dan pisahkan lapisan n-heksana.

5.

Ulangi proses pengocokan sampai diperoleh fraksi n-heksana yang hampir tidak berwarna (3x)

6.

Lapisan airdalam corong pisah kemudian dikocok kembali dengan pelarut etil asetat dengan cara yang sama seperti dengan pelarut n-heksana.

II. Analisis kromatografi lapis tipis ekstrak dan fraksi-fraksi Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis, penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pengembang pelarut campuran n-heksana dan etil asetat (7 : 3) atau disesuaikan dengan pustaka, penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm

MODUL PRAKTIKUM 3



37

HASIL PERCOBAAN : Pola kromatogram ekstrak dan fraksi-fraksi: Penjerap

: ................................

Pengembang

: ................................

Penampak bercak

: ................................

Ekstrak Etanol

Fraksi n-heksan

Rf

Rf

Warna

Fraksi etil asetat

Warna

Rf


(

MODUL PRAKTIKUM 3

)

Warna

Fraksi Air Rf

Warna


(

)



38

LEMBAR KERJA 3B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 3B

: Metode Pemisahan Ekstrak

NAMA MAHASISWA

: ............................................................

NPM

: ............................................................

KELOMPOK

: ............................................................

NAMA SIMPLISIA

: ............................................................

METODE PEMISAHAN

: FAST CHROMATOGRAPHY

PROSEDUR

:

1. Kolom untuk kromatografi cepat disiapkan. Bagian alasnya dilapisi kertas saring, kemudian ke dalamnya dimasukkan penjerap hinga batas tertentu. Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat dalam kolom, karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses pemisahan. 2. Setelah

kolom

didiamkan

sambil

direndam

dengan

eluen

(pengkondisian kolom), ekstrak yang akan dipisahkan ditempatkan diatas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas seluruh permukaan penjerap. Setelah itu dilakukan proses elusi dengan campuran pelarut berbagai perbandingan. Elusi dipercepat dengan cara penghisapan melalui pompa vakum. 3. Eluen diganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan berbeda dengan volume eluen yang sama dengan volume eluen pada proses pertama. Pengerjaan dilakukan berulang seperti proses pertama. Fraksi yang keluar kolom ditampung dan digunakan untuk analisis lanjutan. Komposisi larutan eluen adalah sebagai berikut: No 1 2 3 4 5 6 7

MODUL PRAKTIKUM 3

n-Heksana (mL) 100 90 80 70 60 50 40

Etil Asetat (mL) 0 10 20 30 40 50 60


PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 8 9 10 11

30 20 10 0

39 70 80 90 100

4. Analisis kromatografi lapis tipis fraksi-fraksi Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis, penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pelarut campuran nheksana dan etil asetat (4:1) atau disesuaikan dengan pustaka, penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm. HASIL PERCOBAAN : I.

DATA FRAKSI : Fraksi

Warna

Fraksi

1

7

2

8

3

9

4

10

5

11

6

12

II. DATA Rf

Warna

:

Penjerap

: .....................................

Pengembang

: .....................................

Penampak bercak

: .....................................

Fraksi

Rf

Fraksi

1

7

2

8

3

9

4

10

5

11

6

12

MODUL PRAKTIKUM 3

Rf



POLA KROMATOGRAM

KESIMPULAN

40

:

:


(

MODUL PRAKTIKUM 3

)


(

)



41

MODUL PRAKTIKUM 4 Metode Pemurnian Fraksi

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan pemurnian fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasipada praktikum 3 sehingga dapat memisahkan suatu senyawa/bercak/isolat dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif atau Kromatografi Kolom.

TUJUAN INSTRUKSIONAL Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu memahami dan mampu melakukan pemurnian fraksi sehingga diperoleh suatu isolat dengan berbagai metode kromatografi.

TEORI Pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memisahkan suatu komponen dari komponen lainnya yang sama-sama terkandung dalam suatu fraksi. Terdapat beberapa metode untuk melakukan pemisahan komponen dan biasanya

dilakukan

kromatografi.

dengan

Teknik

satu

atau

kromatografi

beberapa

yang

biasa

kombinasi

teknik

digunakan

adalah

kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi cair kinerja tinggi dan kromatografi gas cair. KLT (Kromatografi

Lapis

Tipis) merupakan salah satu teknik

kromatografi, yaitu suatu teknik atau metode pemisahan / pemurnian senyawa kimia berdasarkan pada perbedaan koefisien partisi senyawa dalam fasa diam dan fasa gerak, atau berdasarkan daya adsorpsi senyawa pada adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Fasa diam adalah fasa yang terikat pada pendukung, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak melalui fasa diam. Senyawa yang akan dipisahkan ikut bergerak bersama fasa gerak. Selama senyawa bergerak terjadi proses partisi komponen di antara fasa gerak dan fasa diam, atau terjadi proses adsorpsi senyawa oleh adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Akibat adanya perbedaan koefisien

MODUL PRAKTIKUM 4



42

partisi dan / atau afinitas adsorpsi, terjadilah perbedaan kecepatan gerakan senyawa-senyawa yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Berdasarkan jenis fasa gerak dan fasa diam, kromatografi dapat dibedakan atas berbagai tipe sebagai berikut :

Selain

Tipe

FasaGerak

FasaDiam

Cairan

Padatan

Kr. Cair-Padat

Gas

Padatan

Kr. Gas-Padat

Cairan

Cairan

Kr. Cair-Cair

Gas

Cairan

Kr. Gas-Cair

itu,

penggolongan

Kromatografi

kromatografi

juga

dapat

dilakukan

berdasar pada jenis fasa geraknya saja, berdasarkan mekanisme pemisahan, berdasarkan jenis pendukung, atau berdasarkan proses pengembangannya. Penggolonggan berdasarkan fasa gerak memberikan dua tipe kromatografi sebagai berikut : Fasa Gerak Gas

Tipe Kromatografi Kr. Gas

Cairan

Kr. Cair

DasarPemisahan Keatsirian dan kestabilan termal senyawa Proses partisi atau adsorpsi

Penggunaan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan : Mekanisme Pemisahan Adsorpsi

Tipe Kromatografi Kr. Adsorpsi

Partisi

Kr. Partisi

Pertukaran Ion

Kr. Pertukaran Ion

Perbedaan Ukuran

Kr. Saringan Gel

Partikel

Kr. Eksklusi Molekular

MODUL PRAKTIKUM 4



43

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai berikut :

JenisPendukung

Tipe Kromatografi

Kertas

Kr. Kertas

Kaca/Lempeng

Kr. Lapis Tipis (KLT)

logam tipis Kolom

Kr. Kolom Fast Chromatography

Berdasarkan arah pengembangannya kromatografi dapat dibedakan atas beberapa tipe, yaitu : Arah Pengembangan

TipeKromatografi

Horizontal

Kr. Horizontal

Vertikal Menurun

Kr. VertikalMenurun

Vertikal Menaik

Kr. VertikalMenaik

Sirkular

Kr. Sirkular

Dua Arah TegakLurus

Kr. Dua Arah

Pada kromatografi dibedakan istilah pengembangan dan elusi. Istilah pengembangan digunakan untuk kromatografi datar yang fasa geraknya berjalan melalui fasa diam tanpa terjadi pengeluaran senyawa dari fasa diamnya. Istilah ini digunakan pada kromatografi datar seperti kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Istilah elusi digunakan pada kromatografi yang fasa geraknya melalui fasa diam sambil membawa senyawa keluar dari fasa diam. Istilah ini digunakan pada kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis adalah salah satu tipe dari kromatografi datar, dengan fasa diam berupa adsorben yang melekat pada pendukung berupa lempeng kaca atau logam tipis.Penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain, seperti silika gel, alumunium

oksida,celite,

MODUL PRAKTIKUM 4

kalisium

hidroksida,

damar

penukar

ion,



44

magnesium sulfat, poliamida, sephadex, polifenilpirolidon, selulosa atau campuran dua atau lebih bahan diatas. Pemisahan pada KLT dapat berlangsung melalui dua mekanisme, yaitu mekanisme adsorpsi dan mekanisme partisi. Bertitik tolak dari kedua mekanisme tersebut, pada KLT selain polaritas sistem yang merupakan penentu keberhasilan pemisahan, pemilihan sistem adsorpsi, sistem

partisi,

serta

pelarut

merupakan

faktor-faktor

yang

harus

diperhatikan. Selain pemilihan pelarut yang berdasar pada falsafah polar loves polar, adsorben merupakan faktor yang harus diperhatikan untuk keberhasilan pemisahan pada metode KLT. Berbagai adsorben dapat digunakan pada KLT, namun yang paling umum digunakan adalah silika gel, alumina, kieselguhr (tanah diatomae), dan selulosa. Pemisahan adsorben untuk suatu pemisahan KLT selain mempertimbangkan sifat kimia senyawa sifat kimia adsorben juga harus diperhatikan tingkat / derajat aktif adsorbennya. Menurut Brockmann, derajat aktif adsorben ini dapat dilihat dari kandungan air dalam adsorben tersebut. Adsorben dengan

kandungan

air

paling

rendah

merupakan

adsorben

yang

mempunyai derajat aktif tertinggi dan dinyatakan sebagai adsorben dengan derajat aktif I, sedangkan adsorben dengan derajat aktif terendah dinyatakan sebagai adsorben derajataktif V. Adsorben derajat aktif 1 dapat ditingkatkan derajat aktifnya dengan cara memanaskan adsorben tersebut pada suhu 105o C dalam waktu tertentu. Proses tersebut dikenal dengan sebutan pengaktifan adsorben. Proses

pengembangan

pengembangan

satu

kali

pada dan

KLT

umumnya

pengembangan

dibedakan

berulang.

atas

Metode

pengembangan berulang ini merupakan modifikasi dari pengembangan biasa, yaitu kromatogram dikembangkan dengan suatu fasa gerak, kemudian diangkat dan dikeringkan tanpa pemanasan. Setelah itu kromatogram dikembangkan dengan fasa gerak yang sama. Banyaknya pengulangan proses pengembangan yang optimal untuk memperoleh pemisahan yang baik dinyatakan oleh Thomas dengan persamaan :

AB8C

1 ln 1 @ FG

Atau :

MODUL PRAKTIKUM 4



AB8C

45

1 2,303 log 1 @ FG

Nilai Rf merupakan ukuran relatif letak suatu bercak senyawa dalam kromatogram terhadap garis akhir pergerakan fasa gerak. FG

Berbeda

NOPOQ ROAS TUVWXYZ[ \WARO]O NOPOQ ROAS TUVWXYZ[ GO\O SWPOQ

dengan

kromatografi

kertas,

keterulangan

(reproduksibilitas) nilai Rf pada KLT sangat tidak dapat diharapkan karena berbagai faktor penyebab seperti misalnya derajat aktif adsorben, kejenuhan tabung pengembang, kondisi pengembangan, homogenitas adsorben, suhu, dan lain-lain. Selain pengembangan satu arah (menaik atau menurun, tetapi umumnya menaik), KLT juga dapat dikembangkan dalam dua arah yang saling tegak lurus dengan fasa gerak yang sama atau berbeda. Pengembangan seperti itu dikenal dengan sebutan KLT dua arah. Sebagai pendeteksi bercak pada kromatogram dapat dilakukan dengan visual untuk komponen yang berwarna, sinar UV 254 nm dan 366 nm, pereaksi penampak bercak seperti uap iodium,asam sulfat pekat dalam etanol, asam sulfat kromat, ninhidrin dalam butanol, asam difenil borat, vanillin sulfat, dragendorff, dan sebagainya.

KLT PREPARATIF Kromatografi lapis tipis preparatif dimaksudkan untuk memisahkan senyawa dalam jumlah gram. Pelat dapat dipersiapkan lebih tebal (0,5 – 2 mm).

Sampel diteteskan ke pelat dengan alat syringe membentuk

suatu pita (band). Pendeteksian senyawa tidak boleh merusak senyawa. Pita yang akan dipisahkan dapat dikerok dan dilarutkan dalam pelarut untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan.

Cara pembuatan pelat Silika gel pada penyangga kaca : Bersihkan dulu kaca yang sudah diatur di atas alat Desaga dengan aseton, supaya bebas dari lemak. Buat bubur Silika gel 25 g dalam 50 ml air suling dan dikocok kuat dalam labu erlenmeyer. Tuangkan semua

MODUL PRAKTIKUM 4



46

bubur ke dalam tabung desaga lalu cepat-cepat dibalik diatas kaca pertama, kemudian segera diratakan pada kaca berikutnya sampai kaca terakhir. Diamkan lapisan silika pada pelat hingga mengering pada suhu kamar kira-kira 10-20 menit, lalu pelat dikeringkan dalam oven dengan suhu 110-120 ˚C selama 1-2 jam.

KROMATOGRAFI KOLOM Kromatografi

kolom

biasanya

digunakan

komponen dalam jumlah lebih besar (gram).

untuk

memisahkan

Mempersiapkan kolom

harus dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom kemas yang serba sama (homogen).

Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca

masir, maka kita harus menyumbat kolom dengan segumpal kaca wool atau kapas.

Sumbat ini harus terendam dengan pelarut pengelusi

setinggi 10 cm. Selanjutnya penjerap dijadikan bubur dalam gelas piala menggunakan pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam kolom dan tidak terputus-putus, untuk mencegah terbentuknya lapisan. Setelah itu penjerap dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dikeluarkan melalui keran. Pada poliamid dianjurkan kemasan direndam dulu selama satu jam, supaya mengembang.

Langkah pertama pada kromatografi

kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian rupasehingga terbentuk pita yang siap untuk dielusi.

Untuk mencapai

iitu, cuplikan harus dilarutkan dalam pelarut yang volumenya sesedikit mungkin.

Pelarut yang dipakai harus sama dengan pelarut pengelusi,

dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah, walaupun hal ini tidak

selalu

dapat

dilaksanakan

berhubung

dengan

kelarutannya.

Menempatkan larutan pekat pada kolom harus hati-hati supaya kemasan kolom tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan menggunakan pipet. Cuplikan dibiarkan meresap ke dalam kolom, baru proses kromatografi dimulai. Jika

cuplikan

tidak

dapat

melarutdalam

eluen,

maka

dapat

digunakan cara penjerapan. Cuplikan dilarutkan ke dalam sedikit pelarut sembarang yang cocok, dan dicampur dengan sedikit penjerap.

Lalu

penjerap dikeringkan dan ditaburkan di atas kolom semerata mungkin sebagai serbuk.

MODUL PRAKTIKUM 4



47

Gambar. Kromatografi Kolom

PUSTAKA Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting A.E. 1991. Introduction of Chromatography (Pengantar kromatografi), terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung. Hostettmann, K, Hostettman M. 1995. Preparative Chromatography Techniques (Cara Kromatografi Preparatif). terjemahan Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB. Bandung. Moelyono MW. 1996. Pengantar Kromatografi. Farmakognosi Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD.

Laboratorium

Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. GajahMadaUniversity Press. Yogyakarta. Stahl, E. 1973. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : A Practical Supplement to Pharmacopeias. Ann Arbor Science Publ. Michigan.

MODUL PRAKTIKUM 4



48

LEMBAR KERJA 4A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 4

: Metode Pemurnian Fraksi (KLT Preparatif)

NAMA MAHASISWA

: ............................................................

NPM

: ............................................................

KELOMPOK

: ............................................................

NAMA SIMPLISIA

: ............................................................

PROSEDUR KLT PREPARATIF : 1. Pelat kaca dibersihkan dengan aseton dan disusun diatas alat Desaga. 2. Bubur silika gel dibuat dengan cara mencampurkan 25 gram silika gel dengan 50 mL aquades dalam Erlenmeyer, kocok kuat-kuat sampai tercampur homogen 3. Tuangkan semua bubur silika gel ke dalam alat tabung Desaga dan segera dibalik bubur silika gel sehingga berada diatas kaca, kemudian segera diratakan pada kaca berikutnya sampai dengan kaca terakhir 4. Biarkan lapisan silika gel mengering pada suhu kamar selama 10-20 menit lalu dipanaskan di dalam oven dengan suhu 110-120°C selama 1-2 jam 5. Setelah kering pelat dapat digunakan untuk KLT preparatif. Caranya: sejumlah fraksi dilarutkan dalam larutan pengembang yang telah disiapkan dan tutulkan cuplikan secara berderet sehingga membentuk pita sebagai garis awal pengembangan. Keringkan di udara beberapa saat. 6. Pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan larutan pengembang dan lakukan kromatografi sampai tanda batas 7. Amati pita yang terbentuk secara visual atau dengan sinar UV, kerok salah satu pita yang terbentuk dan saring hasil kerokan dengan pelarut pengembang yang digunakan. 8. Lakukan evaluasi terhadap isolat dengan Kromatografi Lapis Tipis. HASIL PERCOBAAN : Data analisis kromatografi lapis tipis preparatif :

MODUL PRAKTIKUM 4



49

Penjerap

: ...................................................

Pengembang

: ...................................................

Penampak bercak

: ...................................................

Jumlah pita yang terbentuk : .................................................. No. pita yang dikerok

: ...................................................

Kromatogram Isolat :

Kesimpulan :


(

MODUL PRAKTIKUM 4

)


(

)



50

LEMBAR KERJA 4B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 4

: Metode Pemurnian Fraksi (Kromatografi Kolom)

NAMA MAHASISWA

: ............................................................

NPM

: ............................................................

KELOMPOK

: ............................................................

NAMA SIMPLISIA

: ............................................................

PROSEDUR KROMATOGRAFI KOLOM : 1. Larutan

pengelusi

disiapkan

dengan

perbandingan

yang

telah

ditentukan 2. Kolom kromatografi dengan diameter 1 cm disiapkan.

Bagian

alasnya dilapisi kapasdan masukkan eluen setinggi kira-kira 10 cm. 3. Penjerap silika gel ditimbang seksama dan dicampurkan dengan eluen secukupnya hingga dihasilkan bubur silika yang homogen 4. Bubur silika dituangkan ke dalam kolom perlahan-lahan dan tidak terputus

sambil

kolom

diketuk-ketuk

agar

penjerap

mampat.

Kelebihan eluen dalam kolom dikeluarkan dengan membuka keran kolom. Perhatikan keserbasamaan penjerap dalam kolom, karena adanya rongga udara atau ketidakserbasamaan penjerap akan berpengaruh buruk pada proses pemisahan. 5. Kolom kemudian dielusi dengan larutan pengelusi hingga diperoleh kolom yang stabil. 6. Cuplikan fraksi yang akan dipisahkan ditimbang sebanyak 1/20 dari berat silika dan dimasukkan dalam kolom dengan cara kering yaitu : Cuplikan

dikeringkan

dengan

sedikit

silika

dan

gerus

hingga

homogen. Sampel dimasukkan hati-hati diatas penjerap membentuk lapisan tipis merata. 7. Lakukan elusi dengan perlahan sehingga terjadi pemisahan yang baik dan terbentuk pita-pita dalam kolom. Eluat ditampung setiap 5 ml ke dalam vial. 8. Lakukan evaluasi isolat dengan kromatografi lapis tipis.

MODUL PRAKTIKUM 4



51

HASIL PERCOBAAN : Data analisis kromatografi Kolom: Penjerap

: ............................................................

Eluen

: ............................................................

Berat Silika

: ............................................................

Berat cuplikan

: ............................................................

Jumlah fraksi

: ............................................................

Kromatogram fraksi :

Kesimpulan :


(

MODUL PRAKTIKUM 4

)


(

)



52

MODUL PRAKTIKUM 5 Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan isolasi minyak atsiri dengan cara destilasi air, destilasi uap dan air, enfleurasi, dan pemerasan, serta melakukan penetapan kadar minyak atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.

TUJUAN INSTRUKSIONAL Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu melakukan isolasi minyak atsiri dari suatu simplisia dengan cara destilasi air, destilasi uap dan air, enfleurasi, dan pengepresan, serta melakukan penetapan kadar minyak atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.

TEORI Minyak atsiri merupakan suatu lipophilic mixtures yang mudah menguap, yang pada umumnya diperoleh dengan cara destilasi uap dari bagian-bagian suatu tumbuhan. Minyak atsiri mempunyai bau yang khas dan tersusun oleh suatu susunan senyawa kimia yang kompleks yang terdiri atas puluhan hingga ratusan komponen. Sifat umum dari minyak atsiri adalah mudah menguap, berbau aromatik, bila masih segar umumnya tidak berwarna atau kekuning-kuningan yang berubah menjadi gelap pada pendiaman, tidak mengeruhkan air, optis aktif, mempunyai indeks bias tinggi. Minyak atsiri yang diperoleh dengan cara destilasi bila diteteskan pada kertas saring, tetesan tersebut tidak akan meninggalkan bekas seperti bintik lemak. Secara kimia umumnya minyak atsiri terdiri atas komponenkomponen terpenoid, umumnya monoterpen dan seskuiterpen sebagai penyusun utama. Selain itu terdapat berbagai komponen lain yang merupakan komponen minor, yang terdiri atas senyawa-senyawa kimia alifatik, aromatik, turunan benzena, dan lain-lain. Pada umumnya komponen minyak atsiri golongan mono dan seskuiterpen merupakan senyawa kimia turunan isopren C5H8. Monoterpen tersusun atas 2 unit

MODUL PRAKTIKUM 5



53

isopren, sedangkan seskuiterpen tersusun atas 3 unit isopren. Kedua golongan tersebut masih terpilah lagi menjadi komponen-komponen lain berdasarkan gugus fungsionalnya ataupun rangka strukturnya, misalnya monoterpen

dan

seskuiterpen

asiklik,

monosiklik,

atau

bisiklik,

monoterpen atau seskuiterpen alkohol (misalnya eugenol), monoterpen atau seskuiterpen aldehid (misalnya sitral), atau monoterpen dan seskuiterpen keton (misalnya karvon). Tergantung pada sifat tumbuhan asal atau minyak atsiri yang terkandung didalamnya, dikenal berbagai cara isolasi minyak atsiri, misalnya : 1.

Destilasi uap Merupakan proses isolasi minyak atsiri dengan bantuan uap air. Air dan uap air akan menembus dinding sel dan dengan adanya panas, minyak atsiri akan terbawa oleh uap air. Pada pendinginan, minyak atsiri akan terkondensasi dan terpisah dari airnya.

2.

Pemerasan Merupakan metode isolasi minyak atsiri yang sangat sederhana. Bahan langsung diperas atau ditekan dengan suatu alat. Sel-sel yang mengandung minyak atsiri akan pecah dan minyak atsirinya keluar. Cara ini digunakan untuk tumbuhan yang mengandung cukup banyak minyak atsiri. Keburukan cara ini adalah terjadinya pengotoran minyak atsiri oleh zat warna yang ikut terperas.

3.

Penyarian Minyak atsiri dalam tumbuhan dapat diisolasi dengan cara penyarian / ekstraksi menggunakan pelarut yang non polar misalnya heksana, atau pelarut yang kurang polar seperti misalnya alkohol. Pelarut penyari kemudian dipisahkan dengan cara destilasi, hingga diperoleh minyak atsiri yang terbebas dari pelarutnya.

4.

Enfleurage Cara ini merupakan cara klasik untuk isolasi minyak atsiri. Simplisia yang mengandung minyak atsiri, misalnya bunga mawar ditempatkan di atas lapisan semacam vaselin di atas papan. Setelah

MODUL PRAKTIKUM 5



54

dibiarkan beberapa lama, minyak atsiri akan terserap di dalam vaselin, kemudian dipisahkan dari vaselinnya dengan cara destilasi.

PENETAPAN KADAR MINYAK ATSIRI Penetapan kadar minyak atsiri yang paling sederhana dan paling banyak

dilakukan

karena

dianggap

mudah,

murah,

tetapi

cukup

terandalkan adalah dengan metode destilasi. Metode ini menggunakan alat destilasi Stahl. Cara penetapan kadar menurut metode destilasi Stahl ini ada dua, yaitu : Cara pertama : Campur bahan yang akan diperiksa dalam labu dengan cairan penyuling (air), pasang alat, isi buret dengan air hingga penuh, panaskan dengan tangas udara hingga penyulingan berlangsung lambat tetapi teratur. Setelah penyulingan selesai, biarkan selama tidak kurang dari 15 menit, catat volume minyak atsiri pada buret. Hitung kadar minyak atsiri dalam % b/v.

Cara kedua : Dilakukan seperti cara pertama tetapi sebelum buret diisi penuh dengan air, lebih dahulu diisi dengan 0,2 mL xilena yang diukur seksama. Volume minyak atsiri dihitung dengan mengurangkan volume yang dibaca dengan volume xilena.

Gambar. Alat destilasi Stahl

MODUL PRAKTIKUM 5



55

Cara penetapan kadar minyak atsiri lain yang lebih canggih, lebih akurat, tetapi memerlukan peralatan yang mahal adalah dengan cara kromatografi gas. Dengan peralatan mutakhir, dalam sekali penetapan, selain kadar minyak atsiri, kadar masing-masing komponen penyusun minyak atsiri tersebut dapat sekaligus langsung diketahui.

PUSTAKA Ditjen POM. 1979. Materia Medika Indonesia. Jilid III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 153-154. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Terjemahan: Kosasih P. Penerbit ITB. Bandung. 123 – 131.

MODUL PRAKTIKUM 5



56

LEMBAR KERJA 5 PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN PRAKTIKUM 5

: Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri

NAMA MAHASISWA : ............................................................. NPM

: .............................................................

KELOMPOK

: .............................................................

NAMA SIMPLISIA

: .............................................................

PROSEDUR

:

I.

Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri menggunakan Metode Destilasi Air, dengan alat destilasi Stahl. 1. Siapkan simplisia yang akan ditetapkan kadar minyak atsirinya. Simplisia yang digunakan adalah bentuk rajangan yang telah dipotong-potong atau diris-iris hingga derajat halus tertentu 2. Timbang sejumlah tertentu simplisia di atas, kemudian masukkan ke dalam labu stahl, campur dengan sejumlah volume tertentu aquades hingga seluruh simplisia dalam labu terendam 3. Pasang alat destilasi Stahl, kemudian isi buret dengan aquades hingga penuh (atau sebelumnya ditambahkan terlebih dahulu 0,2 mL xilene yang diukur seksama untuk penetapan kadar minyak atsiri) 4. Lakukan destilasi dengan alat pemanas atau tangas udara, atur pemanasannya hingga destilasi berjalan lambat tetapi teratur. Destilasi dilakukan sekurang-kurangnya 3 jam 5. Hentikan pemanasan, biarkan dingin, lalu volume minyak atsiri yang terjadi dicatat 6. Hitung kadar minyak atsirinya dengan rumus

II. Isolasi Minyak Atsiri menggunakan Metode Destilasi Uap dan Air. 1. Siapkan simplisia yang akan ditetapkan kadar minyak atsirinya. Simplisia yang digunakan adalah bentuk rajangan yang telah dipotong-potong atau diris-iris hingga derajat halus tertentu

MODUL PRAKTIKUM 5



57

2. Timbang sejumlah tertentu simplisia di atas, kemudian masukkan ke dalam tabung alat destilasi dan ditempatkan di atas saringan yang sudah diisi aquades di bawah saringannya. 3. Pasang alat destilasi, kemudian isi buret dengan aquades hingga penuh . 4. Lakukan destilasi dengan alat pemanas, atur pemanasannya hingga destilasi berjalan lambat tetapi teratur. Destilasi dilakukan sekurang-kurangnya 3 jam 5. Hentikan pemanasan, biarkan dingin, lalu volume minyak atsiri yang terjadi dicatat 6. Hitung kadar minyak atsirinya.

III.

Isolasi Minyak Atsiri menggunakan Metode Enflerasi

1. Mengoleskan lemak sebanyak 120 g secara merata diatas permukaan bingkai kaca atau chassis. 2. Chasis yang digunakan sebanyak 3 buah dengan masing-masing lemak tiap chassis sebanyak 40 g. 3. Permukaan lemak digores untuk memperluas permukaan lemak. 4. Bunga yang telah disortasi diletakkan di atas chassis yang telah dilumuri lemak. 5. Chassis kemudian ditutup dan dibiarkan pada suhu ruang. 6. Chassis dibuka dan bunga melati dikeluarkan dan diganti setiap 24 jam selama 7 hari. 7. Selanjutnya dilakukan pengambilan lemak dari chassis dan ditimbang beratnya. 8. Lemak

hasil

enfleurasi

disebut

dengan

pomade.

Pomade

dilarutkan dalam etanol teknis 96% dengan perbandingan 1 (lemak) : 2 (pelarut). Mendinginkan pomade dan etanol dalam lemari pendingin atau freezer pada suhu -15 °C. 9. Pomade dipisahkan dari etanol menggunakan kertas saring dan hasilnya merupakan ekstrait (mengandung minyak). 10. Ekstrait

kemudian

dievaporasi

dengan

menggunakan rotary

vacuum evaporator pada suhu 45°C dan tekanan 550 mmHg. 11. Minyak

atsiri

yang

dihasilkan

kemudian

dianalisa

meliputi

rendemen dan berat jenisnya.

MODUL PRAKTIKUM 5



58

IV. Isolasi Minyak Atsiri menggunakan Metode Pemerasan dan Ekstraksi Pelarut Menguap 1. Siapkan simplisia kulit jeruk dan lakukan pemerasan hingga keluar cairannya. 2. Masukkan simplisia hasil pemerasan dalam suatu bejana yang terbuat dari plastik dan tertutup rapat. Menambahkan pelarut dengan perbandingan 1 (simplisia) : 2 (pelarut), kemudian diaduk dengan mengunakan pengaduk selama 3 jam. Hasil ekstraksi selanjutnya disaring dengan kain untuk memisahkan ampas kulit jeruk

dengan

filtrat,

kemudian

filtrat

dievaporasi

dengan

menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 45°C untuk pelarut etanol dan 35°C untuk pelarut n-heksan pada tekanan 550

mmHg.

Hasil

evaporasi

kemudian

dianalisa

meliputi

rendemen dan berat jenisnya. Perhitungan kadar minyak atsiri : ` cdeZXW XUAROQ OV\UPU Xf

^OTOP XUAROQ OV\UPU _% b h100% a gWPOV \UXYeU\UO O]Oe S

HASIL PERCOBAAN Berat simplisia

: ………………………… g

Lama destilasi/perendaman : ………………………… jam Volume minyak atsiri

: ………………………… mL

Kadar minyak atsiri

: ………………………… %

Spesifikasi minyak atsiri

:

Warna: ………………………… Bau

: …………………………

Rasa : ……………………….. KESIMPULAN :


(

MODUL PRAKTIKUM 5

)


(

)


Panduan Praktikum Fitokimia

Recommend Documents