LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA PRODUK ALAM SKRINING FITOKIMIA
Disusun Oleh :
1. Anissa Primadani
(13/346141/FA/09618) (13/346141/FA/09618)
2. Villa Noorlita M.
(13/346143/FA/09620) (13/346143/FA/09620)
3. Zulfi Azizah
(13/346144/FA/09621) (13/346144/FA/09621)
Kelas/Golongan
:
B/I
Kelompok
: 5
Tanggal Praktikum
: 11 Mei 2015
Dosen Jaga
: Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si, Apt.
Asisten Jaga
:
Asri, Purwita
LABORATORIUM KIMIA PRODUK ALAM BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2015
Percobaan V Skrining Fitokimia
I.
Tujuan
Mahasiswa mampu menggunakan metode – metode yang pernah dipelajari sejak Praktikum Farmakognosi (uji pendahuluan dengan organoleptis, uji tetes, uji tabung) hingga KLT yang dipelajari di praktikum I – IV untuk mengambil data, interpretasi, dan identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dalam sampel.
II. Skema Kerja 1. Uji Pendahuluan Jalur mevalonat Uji terpenoid Dicampur 20 tetes larutan dari ekstrak dalam tabung reaksi dengan 10 tetes kloroform
Dialiri bertetes – tetes H2SO4 pekat secara hati – hati melalui dinding tabung membentuk suatu lapisan 2 fase Jika terbentuk warna merah tua dipertemuan kedua lapisan berarti positif ada terpenoid Uji steroid Dicampurkan 10 tetes larutan ekstrak etanol dengan 20 tetes asam asetat anhidrat
Ditambahkan secara hati – hati bertetes – tetes H2SO4 pekat melalui dinding tabung membentuk suatu lapisan 2 fase Perubahan warna dari ungu ke biru atau biru kehijauan menunjukkan adanya steroid Jalur Poliketida Uji antrakuinon Ditambah 10 tetes larutan amonia 10% ke dalam 10 tetes ekstrak lalu digojog
Adanya merah jambu di fase air menujukkan adanya antrakuinon bebas
Jalur Sikimat Uji kumarin Ditambahkan 5 tetes NH4OH 10% ke dalam 10 tetes ekstrak
Diteteskan ke kertas saring dan diamati di bawah UV 366 Fluoresensi kuat kuning menunjukkan adanya kumarin Uji flavonoid Potongan magnesium ditambahkan pada 10 tetes ekstrak
Ditambahkan tetes demi tetes HCl pekat Warna merah jambu atau pink scarlet menunjukkan adanya flavonoid Uji alkaloid Ditambah 10 tetes HCl 1% ke dalam 10 tetes larutan ekstrak
Dipanaskan dengan hati – hati di penangas air Ditambahkan 1 – 2 tetes reagen Mayer dan Wagner ke dalam campuran Endapan yang terbentuk menunjukkan adanya alkaloid
2. Uji KLT
Disiapkan tiga buah lempeng KLT ukuran kecil Diberi tanda titik dengan jarak 0,8 cm untuk penotolan senyawa sampel dan senyawa pembanding Ditandai batas elusi 5 cm dari titik penotolan dengan pensil lemah pada lempeng KLT kecil Ditotolkan pembanding pada masing-masing plat KLT sebanyak ± 2 totolan Pada KLT 1 digunakan pembanding kumarin, pada KLT 2 digunakan pembanding rutin, KLT 3 digunakan pembanding kuersetin Ditotolkan senyawa sampel pada ketiga lempeng KLT masing-masing sebanyak ± 4 totolan, dibiarkan lempeng mengering pada setiap kali penotolan, dielusi masing-masing KLT pada wadah yang berisi fase gerak yang sesuai dan te lah dijenuhkan.
(KLT 1 dengan fase gerak eter: toluen: asam asetat 10% (55:45:0,8); KLT 2 dan 3 dengan fase gerak asam asetat 30%) Elusi dilakukan sampai jarak rambat yang telah ditentukan Dikeluarkan lempeng KLT dan dikeringkan pada suhu ruangan Diamati lempeng hasil KLT di bawah sinar tampak, UV 254 nm dan 366 nm Diukur harga Rf (Retention Factor) masing-masing sampel Dilakukan penyemprotan untuk ketiga KLT (KLT 1 dengan KOH etanolik, KLT 2 dan 3 dengan sitroborat) Diamati lempeng hasil KLT di bawah sinar tampak dan diukur harga Rf Diamati lempeng hasil KLT di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm dan diukur harga Rf
III. Hasil
Hasil reaksi tabung uji flavonoid
Hasil reaksi tabung senyawa kumarin Pengamatan dengan sinar UV 366 nm
Hasil pengamatan kumarin dengan sinar tampak sebelum disemprot dengan pereaksi KOH etanolik
Hasil pengamatan kumarin dengan sinar UV 254 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi KOH etanolik
Hasil pengamatan kumarin dengan sinar UV 366 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi KOH etanolik
Hasil pengamatan kumarin dengan sinar tampak Setelah disemprot dengan pereaksi KOH etanolik
Hasil pengamatan kumarin dengan sinar UV 366 Setelah disemprot dengan pereaksi KOH etanolik
Hasil pengamatan rutin dengan sinar tampak Sebelum disemprot dengan pereaksi sitroborat
Hasil pengamatan Rutin dengan sinar UV 254 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan Rutin dengan sinar UV 366 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan Rutin dengan sinar tampak Setelah disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan Rutin dengan sinar UV 366 nm Setelah disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan Kuersetin dengan sinar tampak Sebelum disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan Kuersetin dengan sinar UV 254 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan kuersetin dengan sinar UV 366 nm Sebelum disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan kuersetin dengan sinar tampak Setelah disemprot dengan pereaksi Sitroborat
Hasil pengamatan kuersetin dengan sinar UV 366 nm Setelah disemprot dengan pereaksi Sitroborat
IV. Analisis Data
Tabel Rf KLT 1 (pembanding kumarin) Sebelum disemprot No
1.
Sinar Tampak
Sinar UV 254
Setelah disemprot KOH Etanolik Sinar UV 366
Sinar Tampak
Sinar UV 366
P
S
P
S
P
S
P
S
P
S
-
0,4
0,64
0,4
-
0,4
-
0,4
0,64
0,4
0,82
0,74
Tabel KLT 2 (pembanding rutin) Sebelum Disemprot No
1.
Sinar Tampak
Sinar UV 254
Setelah Disemprot Sitroborat Sinar UV 366
Sinar Tampak
Sinar UV 366
P
S
P
S
P
S
P
S
P
S
-
0,36
-
0,3
-
0,34
-
0,36
-
0,34
Tabel KLT 3 (pembanding kuersetin) Sebelum Disemprot No
1.
Sinar Tampak
Sinar UV 254
Setelah Disemprot Sitroborat Sinar UV 366
Sinar Tampak
Sinar UV 366
P
S
P
S
P
S
P
S
P
S
-
0,36
-
0,3
-
0,34
-
0,36
-
0,34
V. Pembahasan
Praktikum ini bertujuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan komponen dalam suatu sampel dimana komponen tersebut didistribusikan di antara dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak adalah fasa yang membawa cuplikan, sedangkan fasa diam adalah fasa yang menahan cuplikan secara efektif (Sastrohamidjojo, 1991). Ditinjau secara fisik, kromatografi lapis tipis merupakan salah satu jenis kromatografi planar. Pada KLT pemisahan yang terjadi secara adsorbsi yaitu berdasarkan kompetisi terjadinya ikatan hidrogen antara analit dengan fase gerak dan f ase diam. Pada praktikum kali ini, praktikan diberi sampel yang belum diketahui kandungannya, sehingga perlu dilakukan uji pendahuluan pasa sampel untuk penentuan golongan kimia suatu produk alam. Uji pendahuluan yang dilakukaan yaitu uji
kumarin, uji flavonoid, uji
terpenoid, uji steroid, uji antrakuinon, dan uji alkaloid. Setelah diketahui kemungkinan golongan senyawa pada sampel, selanjutnya senyawa tersebut ditetapkan kandungannya menggunakan kromatografi lapis tipis. Pada pengujian dengan KLT digunakan fase diam yaitu silika gel. Pada uji kumarin, sebanyak 10 tetes sampel ditambah dengan 5 tetes NH 4OH 10%, selanjutnya campuran tersebut di teteskan pada kertas saring dan diamati pada UV 366 nm. Setelah diteteskan pada kertas saring nampak warna kuning pada pengamatan dengan sinar tampak dan saat diamati dibawah sinar UV 366 nampak fluoresensi kuat berwarna kuning. Hasil tersebut menunjukkan adanya kemungkinan kandungan senyawa kumarin. Pada uji flavonoid, sebanyak 10 tetes sampel dicampur dengan bubuk magnesium secukupnya, selanjutnya direaksikan dengan HCl pekat tetes demi tetes. Saat penambahan dengan HCL muncul adanya buih, dan warna larutan menjadi sedikit merah jambu (pink). Hasil tersebut menunjukkan adanya dugaan kandungan flavonoid pada s enyawa sampel. Setelah dilakukan uji pendahuluan, senyawa sampel diduga mengandung senyawa kumarin dan flavonoid, sehingga dilakukan pengujian dengan KLT untuk mengetahui adanya kandungan kumarin dan flavonoid dalam sampel tersebut. Langkah pertama yang dilakukan pada pengujian dengan KLT yaitu disiapkan tiga lempeng KLT. Lempeng pertama digunakan untuk deteksi senyawa kumarin sedangkan lempeng kedua dan ketiga digunkaan untuk deteksi senyawa flavonoid. Selanjutnya dilakukan penotolan pembanding masing-masing sebanyak 2 totolan. Untuk deteksi senyawa kumarin digunakan senyawa pembanding kumarin, sedangkan untuk deteksi flavonoid digunakan senyawa pembanding rutin pada lempeng kedua dan senyawa pembanding
kuersetin pada lempeng ketiga. Kemudian masing-masing lempeng dimasukkan ke dalam bejana yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak yang sesuai. Tujuan penjenuhan agar memberikan kondisi yang sama saat elusi berlangsung. Fase gerak yang digunakan adalah campuran eter: toluen: asam asetat 10% dengan perbandingan 55:45:0,8 untuk lempeng pertama dan fase gerak asam asetat 30% untuk lempeng kedua dan ketiga. Setelah elusi selesai, lempeng diambil dan dikeringkan pada suhu ruangan agar saat diamati hasil pengamatan tidak terganggu oleh fase gerak. Lalu lempeng diamati pada sinar tampak, UV 254 nm, dan UV 366 nm. Kemudian dihitung Rf (Retention faktor) dari masing – masing sampel. Pada deteksi kumarin, diperoleh nilai Rf untuk senyawa sampel sebesar 0,4 dengan warna bercak kuning, sedangkan untuk sanyawa pembanding tidak diperoleh nilai Rf. Pada pengamatan dengan sinar UV 254 nm diperoleh harga Rf sebesar 0,4 dengan warna kuning untuk senyawa sampel dan harga Rf sebesar 0,64 dengan warna biru muda untuk senyawa pembanding yang sesuai dengan literatur (Sabine, 2009). Pada pengamatan dengan sinar UV 366 nm hanya diperoleh harga Rf untuk senyawa sampel yaitu sebesar 0,4 dan 0,82 dengan warna kuning dan merah. Selanjutnya, lempeng disemprot dengan pereaksi KOH etanolik. Hasil penyemprotan diamati pada sinar tampak dan UV 366 nm. Pada sinar tampak hanya diperoleh harga Rf untuk senyawa sampel yaitu sebesar 0,4 dengan warna kuning. Sedangkan pada sinar UV 366 nm diperoleh harga Rf senyawa pembanding yaitu 0,64 dengan warna biru dan pada senyawa sampel diperoleh harga Rf sebesar 0,4 dan 0,74 dengan warna bercak yaitu kuning dan merah. Dari hasil pengujian tersebut dapat disimpulkan adanya berbedaan antara nilai Rf bercak sampel dan bercak pembanding, sehingga dapat disimpulkan bahwa pada sampel tidak terdapat kandungan senyawa kumarin. Terjadinya hasil positif pada uji pendahuluan dapat dikarenakan uji tersebut kurang spesifik untuk suatu senyawa atau adanya sedikit kandungan kumarin pada sampel tersebut . Pada uji pendahuluan tabung, hasil uji flavonoid dihasilkan uji positif. Uji KLT untuk flavonoid yang menggunakan pembanding rutin pada pengamatan sinar tampak hanya terlihat bercak sampel dengan nilai Rf 0,36 berwarna kuning. Pada pengamatan UV 254 nm terdapat bercak sampel dengan nilai Rf 0,3 yang berwarna kuning dan pengamatan di bawah UV 366 nm juga hanya terdapat bercak sampel berwarna kuning kehijauan dengan nilai Rf 0,34. Karena tidak terlihat adamya bercak pembanding, belum dapat dipastikan kandungan yang terdapat dalam sampel. Untuk memvisualisasi hasil elusi, dilakukan penyemprotan dengan pereaksi sitroborat. Pada pengamatan sinar tampak, pembanding tetap tidak terlihat bercaknya, hanya terlihat bercak sampel dengan nilai Rf 0,36 berwarna kuning. Saat diamati
di bawah sinar UV 366 nm juga tidak nampak bercak pembanding dan hanya terlihat bercak sampel berwarna cokelat muda dengan nilai Rf 0,34. Dari hasil percobaan, tidak didapatkan data yang lengkap sehinga tidak dapat dipastikan apakah senyawa flavonoid terdapat dalam sampel. Pada deteksi flavonoid menggunakan pembanding kuersetin, pengamatan dengan sinar tampak sebelum disemprot terdapat bercak sampel dengan Rf 0,36 yang berwarna kuning. Saat diamati dengan sinar UV 254 nm terdapat bercak sampel dengan Rf 0,3 yang berwarna kuning. Saat diamati dengan sinar UV 366 nm terdapat bercak sampel dengan Rf 0,34 yang berwarna kuning kehijauan. Setelah lempeng KLT disemprot dengan pereaksi sitroborat, pada pengamatan dengan sinar tampak terdapat bercak sampel dengan Rf 0,36 yang berwarna kuning. Saat diamati dengan sinar UV 366 nm terdapat bercak sampel dengan Rf 0,34 yang berwarna kuning kecoklatan. Namun bercak pembanding tidak terlihat baik pada pengamatan dengan sinar tampak, UV 254 nm, dan UV 366 nm sebelum disemprot maupun pada pengamatan dengan sinar tampak dan UV 366 nm sesudah disemprot. Sehingga tidak bisa dibandingkan nilai Rf antara sampel dan pembanding. Serta tidak dapat dipastikan kandungan senyawa yang ada pada sampel. Sampel dalam larutan ekstrak ternyata merupakan campuran dari kurkumin dan daun teh hijau. Kesalahan hasil percobaan uji kumarin dapat disebabkan oleh kurang spesifiknya uji yang dilakukan saat uji tabung, sehingga hasil uji bisa membuat hasil positif untuk lebih dari satu senyawa. Kandungan senyawa dalam daun teh hijau diantaranya adalah polifenol (katekin), kafein, tannin (flavonoid) (V.T., 2014). Sehingga hasil percobaan uji pendahuluan (uji tabung) sesuai dengan teori. Namun untuk uji KLT belum dapat dibuktikan karena bercak pembanding tidak terlihat. Hal ini disebabkan karena kurangnya penotolan pembanding.
VI. Kesimpulan
1. Senyawa sampel tidak mengandung senyawa kumarin 2. Senyawa sampel mengandung senyawa flavonoid.
VII. Daftar Pustaka
Sabine Bladt and Veronika Rickl, 2009, Plant Drug Analysis. Thin Layer Chromatography Atlas, Springer, New York.
Sastrohamidjojo, 1991, Kromatografi, Penerbit Liberty, Yogyakarta. V.T., 2014,Green Tea and Weight Loss, V.T., North Clarendon.
Yogyakarta, 17 Mei 2015 praktikan Anissa Primadani (09618) Villa Noorlita M (09620) Zulfi Azizah
(09621)
