P Mikrobiologi Acara 5 Identifikasi Dan Determinasi Bakteri - Uji Biokimiawi

ACARA V

IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI : UJI BIOKIMIAWI

A. TUJUAN

Meng Mengid iden enti tifi fika kasi si

dan dan

mend mendet eter ermi mias asii

bakt bakter erii

berd berdas asar arka kan n

sifa sifatt-si sifa fatt

biokimiawinya biokimiawinya..

B. DASAR TEORI

Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni berarti hasil isolasi perlu ditentukan morfologi morfologi individual, sifat-sifat pengecatan, pengecatan, morfologi koloni, sifat-si sifat-sifat fat biokim biokimia ia (fisiolo (fisiologi)m gi)m patoen patoenitas itas dan serolog serologiny inya. a. Untuk Untuk bakter bakterii bakteri tertentu, tertentu, kadang-kadang kadang-kadang tidak diperlukan diperlukan pengujian pengujian selengkap selengkap di atas (Bibiana, 1994). Identif Identifikas ikasii bakteri bakteri adalah adalah suatu suatu tugas tugas yang yang dilakuk dilakukan an di Laborat Laboratoriu orium. m. Setelah Setelah melaku melakukan kan identifi identifikas kasii kita dapat dapat menentu menentukan kan pengob pengobata atan n ataupun ataupun pencegahan pencegahan secara tepat dan sedini mungkin mungkin terhadap terhadap bakteri tersebut tersebut (Hadioetomo, 1985) Mikroorganisme yang akan diisolasi dapat berupa biakan murni maupun populasi populasi campuran. campuran. Bila biakan tercemar, tercemar, maka perlu pemurnian pemurnian dengan dengan cara menggoreskan suspensi mikroba yang akan diisolasi pada agar lempengan dan dipe diperol roleh eh kolo koloni ni terpi terpisa sah. h. Lalu Lalu dibu dibuat at pewa pewarna rnaan an gram gram untu untuk k melih melihat at kemurnian biakan. Setelah diperoleh biakan murni dapat dilakukan serangkaian uji untuk memperoleh mirfologi dan biokimia (Bibianan, 1994). Pada Pada peng penguj ujian ian yang yang leng lengka kap p untu untuk k dete determi rminas nasii bakt bakter eri, i, hasi hasil-h l-has asil il pengujian pengujian dimasukkan dimasukkan dalam dalam daftar pengamatan pengamatan yang yang disebut disebut Discrip Discriptive tive chart . Untuk Untuk determ determinas inasii bakteri bakteri diguna digunakan kan buku buku pedoma pedoman n Bergey’s Manual Manual of Determinative Determinative Bacteriology Bacteriology.. Buku Buku terseb tersebut ut memuat memuat semua semua sifat-s sifat-sifat ifat bakteri bakteri yang telah dikenal.

Trusted by over 1 million members

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial Cancel Anytime.







Uji identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan : 1. Test Kat Katalase lase Uji ini dapat menunjukkan adanya respirasi aerob. Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan hid hidrogen

pero perok ksida

yang ang

bersifat ifat

meng mengin inak akti tifk fkan an enzi enzim m dala dalam m

sel. el.

toksik

dala alam

Uji katal atalas asee

sel

kare arena

berg bergu una unt untuk

mengidentifikasi kelompok bakteri tertentu. Pada bakteri bentuk coccus uji uji kata katalas lasee digu digunak nakan an untu untuk k memb membed edak akan an staphylococcus staphylococcus dan streptococcus. streptococcus. Kelompok staphylococcus staphylococcus bers bersifa ifatt katal katalase ase posit positif if sedangkan streptococcus streptococcus bersifat bersifat katalas katalasee negatif. negatif. Penent Penentuan uan adanya adanya katalase diuji dengan larutan 3% H 2O2 pada koloni terpisah (Bibiana, 1994). 2. Peng engecat ecatan an gra gram m Termasuk pengecatan differensial karena zat warna yang digunakan adala adalah h pewa pewarna rna diffe differe rens nsial ial,, kare karena na dapa dapatt memb membag agii bakt bakter erii sejat sejatii menjadi 2 kelompok fisiologi yang memudahkan identifikasi jenisnya. 3. Ferm Fermen entas tasii karb karboh ohid idrat rat Kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi identifikasi bakteri. Hasil akhir fermentasi fermentasi karbohidrat karbohidrat ditentukan ditentukan oleh sifat mikr mikrob oba, a, media media yang yang digun digunak akan an,, serta serta fakto faktorr lingk lingkun unga gan. n. Untu Untuk k







ke dalam media. Kaldu karbohidrat digunakan untuk uji pembentukan asam (Bibiana, 1994). 4. Uji oksida idase Uji ini berguna untuk identifikasi mikroorganisme pathogen. Bakteri yang yang bersi bersifat fat oksi oksida dase se posit positif if dibe diberi ri reag reagen en oksi oksidas dasee (dime (dimetil til-p-pfenilen fenilendria driamin min oksala oksalat), t), maka maka warna warna koloni koloni beruba berubah h menjad menjadii hitam hitam dalam dalam wakt waktu u 30 menit menit.. Perub Perubaha ahan n warn warnaa ini ini diseb disebab abka kan n oksid oksidas asee sitokro sitokrom m mengok mengoksida sidasik sikan an larutan larutan reagens reagens.. Reage Reagen n yang dioksi dioksidas dasii bewarna bewarna hitam namun bila terjadi terjadi reduksi tidak terjadi perubahan perubahan warna warna (Bibiana, 1994). 5. Uji indol Penump Penumpuka ukan n indol indol dalam dalam media media biakan biakan dapat dapat diketah diketahui ui dengan dengan penambahan penambahan berbagai berbagai reagen seperti seperti : Kovacs, Kovacs, Ehrlich, dan Ehrlich bihme.

Semua

reagen

tersebut tersebut

mengandung mengandung

para-dimetilpara-dimetil-

aminobe aminobenzal nzaldeh dehida. ida. Reage Reagen n akan akan bereaks bereaksii dengan dengan indol indol dan akan akan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan permukaan medium. medium. Untuk uji ini digunakan digunakan media semi padat yang kaya akan triptofan. Penggunaan media semi padat ini sekaligus untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan pertumbuhan di di sekotar sekotar tusukan tusukan dan permukaan permukaan media media (Bibiana, (Bibiana, 1994). 1994). 6. Uji VP (Vog (Voges es-Po -Posk skau auler ler)) Uji ini digunakan digunakan untuk mengidentifikas mengidentifikasikan ikan mikroorganism mikroorganismee yang melaksanakan

fermentasi

2,3

butanadiol.

Bila

bakteri

mengidentifikasikan karbohidrat menjadi 2,3 butadional sebagai produk utam utamaa

akan akan terj terjad adii

penu penum mpuka pukan n

baha bahan n ters terseb ebut ut dala dalam m

med media

pertumbuhan. pertumbuhan. Penambahan Penambahan 40% KOH dan 5 % larutan alfanaphtol alfanaphtol







penambahan penambahan KOH adanya asetoin asetoin oleh perubahan warna kaldu menjadi merah merah muda. muda. Yang kemud kemudian ian diperjel diperjelas as dengan dengan penamb penambahan ahan larutan larutan alfanaphtol (Bibiana, 1994). 7. Uji Uji Hid Hidro roge gen n sul sulfi fide de Pembent Pembentuka ukan n asam asam sulfida sulfida oleh oleh mikroo mikroorga rganism nismee menunju menunjukka kkan n adan adany ya

pen penguraia aian

asam

amin amino o

yang

mengand andung

sulfur. fur.

Mikroo Mikroorga rganis nisme me yang yang mengh menghasil asilkan kan desulfu desulfurase rase sewaktu sewaktu dibiakk dibiakkan an dalam media yang kaya akan asam amino yang mengandung sulfur akan menghasilkan H2S dan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air. Pembentukan H2S dapat terlihat dengan menggunakan media yang mengandung polipeptida dan kaya akan asam amino yang mengandung sulfur dan ion Fe2+. Jika digunakan lead acetate agar, maka H2S beraksi dengan PG dan PG5 yang berwarna hitam (Bibiana, 1994). 8. Uji deka dekarb rbok oksil silas asee lisi lisin n Proses dekarboksilase lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan mikroo mikroorga rganis nisme me dalam dalam biakan biakan yang yang mengan mengandun dung g lisin. lisin. Karbohi Karbohidrat drat yang dapat difermentasikan (glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan perubahan pH (lazimnya (lazimnya BCP). BCP). Uji ini digunakan digunakan dalam pencirian mikroorganisme terutama yang menempati saluran pencernaan (Bibiana, 1994). 9. Uji sitrat Digun igunak akan an

untu ntuk

meng menguj ujii

kema kemam mpuan puan

mikr mikroo oorg rgan anis isme me

menggunakan menggunakan sitrat sebagai sebagai satu-satunya satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk menguji ini dpaat digunakan medium sitrat korer yang berupa cairan dan tidak mengandung indikator pH bromthymol blue (Bibiana,







Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang menguraikan urea menjadi ammonium dan CO 2. Aktifitas enzim urease ini dapat diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang mengandung mengandung urea dan indikator indikator pH. Bila urea dihidrolisis dihidrolisis NH4+ terakumulasi dalam media biakan dan menyebabkan pH menjadi basa. Perubahan Perubahan warna dari merah jingga menjadi menjadi merah ungu menunjukkan terjadi hidrolisis. Urea bersifat labil sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan autoklaf tetapi dengan filtrasi (Bibiana, 1994).

C. PROS PROSED EDUR UR KERJ KERJA A

1. Alat lat dan Baha Bahan n a. Isolat Isolat murni murni bakteri bakteri tanah tanah (hasil (hasil percoba percobaan an Acara Acara III) dalam dalam NA miring miring dan NB (nutrien cair). b. Reagen Reagen untuk test oksidase oksidase : tetramethy tetramethyl-paraph l-paraphenyldia enyldiamine mine c. Regen Regen untuk untuk test test katalas katalasee : 10% 10% atau atau 30% 30% H2O2 H2O2 d. Baha ahan untu ntuk tes test O-F : media O-F yang mengandu ndung 0,5-1 ,5-1 % karbohidrat, parafin cair e. Baha Bahan n untu untuk k test test sitr sitrat at : Simm Simmon onss Citr Citrat atee Agar Agar yang yang meng mengan andu dung ng indikator Brom Thymol Blue-BTB f. Baha Bahan n untu untuk k test dekarb dekarbok oksil silas asee lisin lisin : medi mediaa Lysi Lysin n Iron Iron Agar (LIA) (LIA) yang mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple-BCP, media







g. Media Media Nutri Nutrien en Agar Agar (NA) (NA) h. Gelatin i.

Media Media TSIA TSIA (Tr (Trip iple le Sug Sugar ar Iro Iron n Aga Agar) r)

j.

Bahan untuk test pembentukan pembentukan indol : media Tryptone Tryptone Water, reagen Kovacs

k. Bahan Bahan untuk untuk test test MR-VP MR-VP : media MR-VP MR-VP,, larutan larutan 40% KOH, KOH, larutan larutan 5% alphanaphtol l.

Bahan Bahan utnuk utnuk test test Ureas Ureasee : media media Urea Urea Broth, Broth, idika idikator tor Phen Phenol ol Red Red

m.

Buku panduan panduan determinasi determinasi bakteri : Bergey’s Manual Manual of Determinative Bacteriology Bacteriology (Holt et al., 2000)

n. Jarum os ose o. Pipe Pipett vol volum umee ste steri rill

2. Cara Kerja a. Test ok oksidas idasee Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras saring. ↓ Ambillah suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair dan inokulasikan pada kertas saring yng telah ditetesi reagen. ↓









Kadangkala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 10-30 menit. ↓ Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

b. Test katalase katalase Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri. ↓ Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika. ↓ Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

c. Test Test O-F O-F (Oks (Oksida idasi si Fer Ferme menta ntasi si)) Inokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri ke dalam 4 tabung berisi media media O-F O-F yang mengandung mengandung 0,5-1% 0,5-1% karbohidrat karbohidrat (glukosa, (glukosa, laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa) secara tusukan.







↓ Bandingkan perlakuan dengan kontrol. Oksidasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada mikroba aerobik dan fermentasi (terbentuk warna kuning pada media OF yang ditutup paraffin) terjadi pada mikroba anaerob. ↓ Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan warna media yang terjadi dan indikator yang terkandung dalam media O-F

d. Test Test pen peng gunaa unaan n sitr sitrat at Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. ↓ Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru. ↓







↓ Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning dan kembali ke ungu, sementara pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi perubahan perubahan warna warna dari dari ungu menjadi kuning

f. Test Test hidr hidrol olis isis is gela gelati tin n Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yang mengandung gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan. ↓ Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. ↓ Pada saat pengamatan, masukkan tabung perlakuan dan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri) dalam almari es selama 30 menit. Positif berarti terjadi pencairan







Inkubasikan selama 24 jam ↓ Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam. Perubahan warna media TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah apakah terbentuk terbentuk gas yang yang ditandai ditandai dengan dengan pecahnya pecahnya media atau atau terangkatnya media ke atas. ↓ Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri)

h. Test in indol Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolat murni bakteri dan 1 tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri). ↓

Inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam.







Bandingkan dengan kontrol

i.

Test Test MR (Met (Methy hy Red) ed) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media Methyl Red-Voges Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. ↓ Tambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke dalam tabung berisi media MR-VP. ↓ Kocoklah hati-hati, Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen. ↓ Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

j.

Test VP VP (Voges (Voges Proskauer) Proskauer) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP dan inkubasikan









Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit. Hasil tes positif jika terjadi terjadi warna merah merah dalam dalam waktu waktu 30 menit menit setelah setelah penambaha penambahan n reagen. ↓ Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

k. Test urease Inokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes kultur murni bakteri. ↓ Amatilah perubahan warna menjadi merah (phenol red) setelah 24 jam pada suhu suhu kamar. kamar.

P Mikrobiologi Acara 5 Identifikasi Dan Determinasi Bakteri - Uji Biokimiawi

Recommend Documents