ACARA IV IDENTIFIKASI BAKTERI : UJI MORFOLOGI KOLONI DAN MORFOLOGI SEL
A. TUJUAN 1. MORFO ORFOLO LOGI GI KO KOLO LONI NI
Mengidentifikasi bermacam-macam bentuk morfologi koloni bakteri yang tumbuh tumbuh dalam dalam bermac bermacam-m am-maca acam m media media berdas berdasarka arkan n konsis konsisten tensi si media media pertumbuhan pertumbuhannya nya 2. MORFOLOGI SEL
Mengid Mengidenti entifika fikasi si karakter karakter morfolo morfologi gi sel individ individual ual yang yang meliput meliputii : ada tidaknya flagela (sifat motilitas), bentuk dan rangkaian sel, ada tidaknya spora dan reaksi-reaksi sel bakteri terhadap pengecatan (sifat Gram dan acid fast) a. Gera Geraka kan n bak bakteri teri Untuk melihat pergerakan bakteri di bawah mikroskop maupun pada media pertumbuhan b. Pengecatan Pengecatan bakteri bakteri Untuk mempelajari jenis-jenis pengecatan bakteri dan melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif), sifat tahan asam (acid fast dan non acid fast) dan ada tidaknya spora.
B. DASAR TEORI
Bakte Bakteri ri meru merupak pakan an mikr mikrob obia ia unise uniselu luler ler yang yang terma termasu suk k dalam dalam kelas kelas Shizomycetes. Pada umumnya bakteri tersebar luas di alam. Ada yang hidup
bebas, bersifat saprofitik, saprofitik, parasit atau patogen patogen pada manusia, manusia, binatang binatang atau tumbuh tumbuhan. an. Ada bebera beberapa pa jenis jenis bakteri bakteri yang yang bersifat bersifat fotosi fotosintet ntetik. ik. Ada tiga tiga bentuk dasar bakteri yaitu bentuk bulat (coccus), (coccus), batang (bacillus), dan melilit (spiral) (Irianto, 2007). Mikroorganism Mikroorganismee merupakan merupakan jasad berukuran berukuran mikroskopis mikroskopis yang beraneka beraneka ragam bentuk dan jenisnya, punya sejumlah ciri yang perlu dipahami untuk mengad mengadaka akan n klasifik klasifikasi asi dan identif identifikas ikasi. i. Ciri pokok pokok mikroo mikroorga rganis nisme me dapat dapat dibedak dibedakan an dalam dalam bebera beberapa pa katego kategori ri yaitu yaitu ciri morfolo morfologi, gi, kultur kultural, al, susuna susunan n kimi kimia, a,
meta metabo boli lik, k,
anig anigen enik ik,,
pato patoge geni nita tas, s,
dan dan
ciri ciri
ekol ekolog ogis is..
Ciri Ciri-c -cir irii
mikroo mikroorga rganism nismee meliput meliputii banyak banyak hal yaitu, yaitu, ukuran ukuran,, struktu struktur, r, pengat pengatur ur sel, sel, bentuk perkembanga perkembangan, n, reaksi terhadap terhadap cat, motilitas, motilitas, dan susunan susunan flagella. Berbeda dengan ciri determinasi mengenai ciri morfologi ini butuh pemahaman tentang tentang sel-sel sel-sel individ individu u dalam dalam suatu suatu kultur kultur murni. murni. Tubuh Tubuh mikroo mikroorga rganism nismee sang sangat at kecil kecil dan dan ukur ukuran anny nyaa bisa bisa diny dinyata ataka kan n deng dengan an mikro mikrome meter ter.. Suatu Suatu mikrometer sama dengan 0,001 mm atau kira-kira 0,0004 inch (Tarigan, 1988). Pengec Pengecatan atan adalah adalah pewarn pewarnaan aan mikrob mikroba-m a-mikro ikroba ba dengan dengan suatu suatu cat (dye) (dye) yang yang meng mengut utam amak akan an stru strukt ktur ur terten tertentu tu saja, saja, misaln misalnya ya bagi bagian an-ba -bagi gian an sel. sel. Mikr Mikroo oorg rgan anis isme me suli sulitt dili diliha hatt deng dengan an mikro ikrosk skop op caha cahaya ya,, kare karena na tida tidak k mengabsorbsi atau membiaskan cahay (Tarigan, 1988). Dalam mikrobiologi, dikenal beberapa cara pengecatan, yaitu : 1. Pengec Pengecatan atan sederha sederhana na (simp (simple le stain staining ing)) Hanya menggunakan 1 macam zat warna untuk meningkatkan kontras antar mikroorganisme dan sekelilingnya. Zat warna yang biasanya digunakan zat warna basa seperti kristal violet, biru metylen, karbol fuksin basa, safranin atau hijau malakit, kadang digunakan juga zat warna negatiev dan zat warna asa,. asa,. Pewar Pewarnaa naan n ini ini serin sering g digun digunaka akan n untu untuk k melih melihat at bent bentuk uk,, ukur ukuran an,, penataan penataan mikroorganis mikroorganisme. me. 2. Pengec Pengecatan atan differe differensia nsiall (differe (differentia ntiall staining staining))
Pengematana jelas tentang perbedaan antara sel bakteri / bagian sel bakteri. Bertujuan Bertujuan untuk untuk mengetahui mengetahui bagian-bagian bagian-bagian sel bakteri terhadap cat dan mengetahui bagian-bagian sel bakteri yang tidak dapat diamati dengan pengecatan pengecatan sederhana sederhana (Tarigan, (Tarigan, 1988). 1988).
Mikrobia tidak punya ciri anatomi yang jelas, sehingga identifikasi bakteri didasarkan pada morfologi, sifat biakkan, dan sifat biokimia. Mikroorganise yang akan diisolasi dapat berupa biakan murni atau populasi campuran. Bila biakan tercemar, tercemar, dilakukan dilakukan pemurnian pemurnian terlebih dahulu. Setelah didapat biakan murni dapat dilakukan serangkaian uji untuk memperoleh ciri morfologi dan biokimia biokimia isolat. Setiap uji yang dilakukan dilakukan harus menggunaka menggunakan n kontrol kontrol untuk menget mengetahu ahuii apakah apakah media media serta serta reagens reagens yang yang digunak digunakan an benar benar dan tepat. tepat. Rujukan yang dipakai dalam identifikasi adalah Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology yang didasarkan pada morfologi, sifat faali, dan sifat biokimia bakteri (Lay, (Lay, 1994). 1994).
C. PROSEDUR KERJA 1. MORFO ORFOLO LOGI GI KO KOLO LONI NI a. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Cair
Alat dan Bahan − Media nutrien cair (NB) dalam tabung reaksi − Jarum ose − Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja
Siapkan media nutrien cair (NB) yang telah disterilkan. ↓ Inokulasikan secara aseptik biakan murni isolat bakteri tanah sludge tanah sludge dengan menggunakan ose (1-2 ose) pada media NB. ↓ Inkubasikan pada suhu kamar selama 24-48 jam. ↓ Amati pertumbuhan biakan bakteri pada permukaan media, kekeruhan, bau dan dan ada tidaknya tidaknya endapan. endapan. Bandingk Bandingkan an dengan dengan kontrol kontrol (media (media tanpa tanpa inokulasi bakteri). Perhatian : pada pada saat pengamatan, pengamatan, dilarang dilarang melakukan melakukan penggojogan penggojogan tabung! ↓ Tentukan karakter bakteri tersebut berdasarkan kebutuhannya akan O2 (aerob, fakultatif anaerob, anaerob).
b. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Agar Tegak
Alat dan Bahan − Media NA tegak dalam tabung reaksi − Jarum inokulasi − Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja Siapkan medium NA tegak steril. ↓ Inokulasikan secara aseptik biakan murni isolat bakteri tanah sludge tanah sludge dengan menggunakanjarum inokulasi secara tusukan sampai ke dalam tabung. Perhatikan : penanaman secara secara tusukan tidak boleh sampai dasar tabung! ↓ Inkubasikan pada suhu kamar selama 24- 48 jam. ↓ Amati pertumbuhannya, merata atau tidak, pertumbuhannya baik pada bagian bagian permukaan permukaan atau atau bagian bagian dasar, dasar, bagaimana bagaimana bentuk bentuk pertumbu pertumbuhan han pada bekas bekas tusukan tusukan ( filiform, filiform, echinulate, beaded, villous, rhizoid, arborescent ) (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di laboratorium!). Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).
c. Morfologi Koloni Bakteri dalam Media Agar Miring
Alat dan Bahan − Media NA miring dalam tabung reaksi − Jarum ose / Jarum inokulasi − Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja Media NA miring steril diinokulasi secara aseptik dengan dengan biakan murni isolat bakteri tanah sludge tanah sludge menggunakan ose/jarum inokulasi secara goresan lurus. ↓ Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. ↓ Amati pertumbuhan : tipis, sedang, lebat atau tidak ada, bentuk pertumbuhan pertumbuhan pada goresan goresan ( filiform, echinulate, beaded, beaded, spreading, spreading, arborescent, rhizoid, plumose), plumose), elevasi, kilat, topografi, warna, bau, dan konsistensinya (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di laboratorium!). Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).
d. Morfologi Bakteri dalam Media Cawan Agar
Alat dan Bahan − Jarum ose − Media NA dalam petri (cawan agar) − Isolat munri bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja
Inokulasikan secara aseptik 1 ose biakan murni isolat bakteri tanah sludge ke dalam cawan agar secara streak secara streak plate. Perhatikan jalur dan arah goresan! (lihat kembali Acara II.4c). ↓ Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24-48 jam. ↓ Perhatikan dan amati koloni-koloni terpisah yang terbentuk. Amati pertumbuhan pertumbuhan : pertumbuha pertumbuhan n koloni koloni di permuka permukaan an atau di bawah bawah permukaan permukaan media, media, bentuk bentuk koloni, koloni, permuka permukaan an koloni, koloni, elevasi, elevasi, bentuk bentuk tepi dan bentuk struktur dalam (lihat Jutono dkk., 1980 atau lihat alat peraga di di laboratorium!). laboratorium!). Bandingkan Bandingkan dengan dengan kontrol kontrol (media (media tanpa inokulasi bakter inokulasi bakteri). i).
2. MORFO ORFOL LOGI SE SEL L a. Gerakan Bakteri
(1) Gerakan Bakteri Bakteri dengan Metode Metode Tetes Gantung / Hanging Hanging Drop
Alat dan Bahan −
Mikroskop cahaya
− Gelas benda cekung dan gelas penutup − Tusuk gigi − Vaselin − Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja Dengan menggunakan tusuk gigi, tempatkanlah 4 gumpalan vaselin pada ujung-u ujung-ujung jung gelas gelas penutup. penutup. ↓ Letakkan 1 ose isolat murni bakteri tanah sludge tanah sludge pada pada gelas gelas penutup penutup (jika media padat,tambahkan kultur dengan air). Kemudian tempelkan gelas penutup bervaselin pada gelas benda cekung. Pastikan bahwa kultur isolat yang akan diamati tepat berada di bagian yang cekung dari gelas gelas benda. benda. ↓ Balikkan gelas penutup pada gelas benda dengan hati-hati sedemikian sehingga ujung-ujung vaselin pada gelas benda berlekatan berlekatan dengan dengan baik pada gelas gelas penutup. penutup. ↓ Amati dengan perbesaran lemah/kuat ada tidaknya gerakan bakteri (hati-hati dengan adanya gerakan "brownian"
(2) Gerakan Gerakan Bakteri Bakteri dengan dengan Cara Tusukan Tusukan
Alat dan Bahan − Media semisolid dengan kandungan agar 0,2–0,4 % − Jarum inokulasi − Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja Inokulasikan isolat murni bakteri tanah sludge tanah sludge pada pada media media semi semi solid (0,2-0,4% agar) steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. ↓ Inkubasikan pada temperatur kamar selama 24-48 jam. ↓ Amati hasil pertumbuhan dan gambarkan. Amati ada tidaknya gerakan bakteri.
b. Pengec Pengecata atan-P n-Peng engeca ecatan tan Bakte Bakteri ri (1) Pengecatan Gram
Alat dan Bahan −
Mikroskop cahaya
−
Crystal violet (Gram A)
−
Larutan iodine (Gram B)
−
Alkohol 96% (Gram C)
−
Safranin (Gram D)
−
Minyak immersi
−
Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
−
Gelas benda
−
Jarum ose
Skema Kerja Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api (lihat kembali Acara I). ↓ Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30-60 detik. ↓ Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir. ↓ Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit. ↓ Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) peluntur) dengan dengan alkohol alkohol (Gram (Gram C) C) (kira-kira 20 detik, detik, hati-hati hati-hati jangan sampai sampai berlebihan berlebihan yang mengakibatka mengakibatkan n kesalahan kesalahan hasil). hasil). ↓ Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik. ↓ Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop mikroskop dengan dengan perbesaran perbesaran kuat (1000x) (1000x) menggu menggunakan nakan minyak immersi.
↓ Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.
(2) Pengeca Pengecatan tan Acid Fast (Ziehl (Ziehl Neelsen) Neelsen)
Alat dan Bahan −
Gelas objek
−
Mikroskop
−
Cat ziehl Neelsen carbolfuchsin (ZN A)
−
Peluntur (Alkohol 96%) (ZN B)
−
Metylen blue (ZN C)
−
Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
Skema Kerja Buatlan pulasan bakteri, dan fiksasi di atas bunsen. ↓ Tutupkan dengan sepotong kertas filter, tambahkan larutan carbolfuchsin (ZN A), panaskan di atas bunsen dengan nyala kecil (hati-hati!), diamkan selama 5-10 menit. ↓ Dinginkan, cuci dengan air mengalir dan angin-anginkan.
↓ Cuci dengan larutan peluntur alkohol 96% (ZN B) sambil digoyanggoyangkan sampai seluruh pulasan tak nampak. ↓ Cuci dengan air mengalir, keringkan. ↓ Bubuhkan dengan cat penutup metylen biru (ZN C) selama 20-30 detik. ↓ Cuci, keringkan dan amati dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi. ↓ Gambar hasil-hasil pengamatan. Beri keterangan mengenai bentuk sel, warna dan reaksi pengecatan.
(3) Pengecatan Spora
Alat dan Bahan −
Malachitte green 5%
−
Safranin
−
Mikroskop
−
Minyak immersi
−
Isolat murni bakteri tanah sludge (hasil percobaan Acara III)
−
Gelas benda
−
Jarum ose
Skema Kerja Pengecatan Spora metode Schaefler dan Fulton Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi di atas bunsen (Acara I). ↓ Tetesi dengan Malachite green berlebihan dan biarkan selama 1 menit. Panasi dengan cara melalukannya di atas nyala lampu bunsen sampai menguap selama ½ menit. ↓ Cuci dengan air mengalir selama ½ menit dan keringanginkan. ↓ Tambahkan cat safranin selama 5 menit. ↓ Cuci, keringanginkan dan amati dengan mikroskop perbesaran kuat (1000x) dengan minyak imersi. ↓ Gambar hasil-hasil pengamatan : bentuk sel dan letak spora (sentral, terminal atau sub terminal)
Skema Kerja Pengecatan Spora metode Bartholomew dan Mittwer Buatlah pulasan bakteri dan fiksasi di atas bunsen (Acara I).
↓ Tetesi dengan Malachite green selama 10 menit (jangan dipanasi!). ↓ Cuci dengan air mengalir selama 10 detik dan keringanginkan. ↓ Tambahkan cat safranin selama 5-10 detik. ↓ Cuci dan amati dengan mikroskop perbesaran kuat (1000x). ↓ Gambar hasil-hasil pengamatan : bentuk sel dan letak spora (sentral, terminal atau sub terminal)
