NTC 1232 Metodo de Analisis de as de Ocurrencia Natural

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 1232 1996-10-23

MÉTODO DE ANÁLISIS DE AFLATOXINAS DE OCURRENCIA NATURAL (B1, B2, G1 Y G2)

E:

ANALYSIS METHOD FOR AFLATOXINS OF NATURAL OCURRENCE

CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES:

cereal en grano; granos; producto vegetal.

I.C.S.: 67.060.00; 65.120.00 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435 Prohibida su reproducción

Primera actualización Editada 2001-09-11

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. El ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo desarrollo al productor y protección al consumidor. consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 1232 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo el 96-10-23. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico. AGREVO - SEMILLAS TROPICALES BASF DE COLOMBIA BOLSA NACIONAL AGROPECUARIA CONCENTRADOS RAZA CONTEGRAL FINCA INSTITUTO DE MERCADEO AGROPECUARIO

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO MEJÍA Y CÍA NESTLÉ NULAB NUTRIANÁLISIS SOLLA S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL

Además de las anteriores, en consulta pública el proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ANDI BAYER FEDERACIÓN NACIONAL CULTIVADORES DE PALMA GRASAS S.A. LUCTA GRAN COLOMBIANA ASOHUEVO

DE

FEDERACIÓN NACIONAL DE MOLINEROS DE TRIGO INDUSTRIAS DEL MAÍZ MINISTERIO DE AGRICULTURA BAVARIA S.A. FEDERACIÓN NACIONAL DE CULTIVADORES DE CEREALES LLOREDA GRASAS

El ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA COLOMBIANA

NTC 1232 (Primera actualización)

MÉTODO DE ANÁLISIS DE AFLATOXINAS DE OCURRENCIA NATURAL (B1, B2 G1 Y G2)

1.

OBJETO

La presente norma establece un método de análisis de aflatoxinas de ocurrencia natural (B1, B2, G1 y G2) en granos, cereales y alimentos balanceados de consumo animal utilizando la técnica analítica conocida como cromatografía líquida de alta eficiencia o HPLC (Highperformance liquid chromatography). Alternativamente se ofrece un método por cromatografía en capa delgada o TLC (Thin-layer chromatography). 2.

PRINCIPIO

Las aflatoxinas (AF) se extraen con una mezcla de acetonitrilo: agua (84 + 16) y se purifican con una columna multifuncional de limpieza. Luego de evaporar el extracto bajo una corriente de nitrógeno, las AFB1 y AFG1 se derivatizan a sus correspondientes hemiacetales (AFB2a y AFBG2a) con ácido trifluoroacético. La separación de las cuatro Aflatoxinas [B1 (B2a), B2, G1 (B2a) y G2] se hace en una columna cromatográfica de fase reversa (RP - 18). Las Aflatoxinas se detectan finalmente y se cuantifican mediante un espectrofotómetro de fluorescencia acoplado a un integrador-graficador, utilizando un método de cuantificación por estándar externo. 3.

APLICACIONES DEL MÉTODO

El método se ha utilizado en los siguientes substratos: maíz, sorgo, arroz, torta de algodón, torta de soya, harina de yuca, subproductos de trigo, alimentos concentrados, gluten de maíz, maní, almendras, pistachos y pasta de breva. Si se requiere analizar un substrato diferente a los anteriores se sugiere hacer una revalidación del método, con el fin de determinar si se precisa hacer modificaciones al método.

1



4.

MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

4.1

APARATOS Y MATERIALES

4.1.1 Columna de limpieza El material de empaque de la columna debe tener sitios activos lipofílicos y un intercambiador iónico. El material se coloca en un tubo plástico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde de caucho en su extremo inferior y un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro poroso debe ir una válvula que permite el flujo de líquido en una sola dirección (Columna Mycosep 224 MFC o equivalente). equivalente). 4.1.2 Cromatógrafo de líquidos a)

Inyector con capacidad de introducir 50 µl al sistema

b)

Bomba cromatográfica con capacidad de bombear la fase móvil a razón de 1 ml/min ml/ min

c)

Columna cromatográfica de fase reversa (C 18) (Supelcosil RP-18 de 25 cm x 4,6 mm o equivalente)

d)

Detector de fluorescencia de longitudes de onda variables. Condiciones de operación: excitación 360 nm, emisión 440 nm. (Perkin Elmer 650-15 o equivalente)

e)

Horno cromatográfico con capacidad para regular una temperatura constante de la columna en 50 °C

f)

Integrador-graficador.

4.1.3 Agitador de vaivén 4.1.4 Baño termostatado con capacidad de regular una temperatura de 65 °C. 4.1.5 Evaporador de nitrógeno (ReactiVap Pierce o equivalente). 4.1.6 Papel de filtro cualitativo de 25 cm de diámetro (Whatman No. 4 o equivalente). 4.1.7 Pipetas de 5 ml de capacidad. 4.1.8 Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm. 4.1.9 Micropipeta de volumen variable con capacidad de medir volúmenes de 10 µl a 100 µl. 4.1.10 Viales para derivatización de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de teflón. 4.2

REACTIVOS

4.2.1 Solvente de extracción Se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analítico con 160 ml de agua destilada. 2



4.2.2 Solución de derivatización Se mezclan 10 ml de ácido trifluoroacético (grado reactivo analítico) con 5 ml de ácido acético glacial (grado (grado reactivo analítico) y 35 ml de agua destilada. Este Este volumen es suficiente suficiente para realizar 70 derivatizaciones. derivatizaciones. 4.1.3 Fase móvil Se mezclan 600 ml de agua grado HPLC con 400 ml de metanol grado HPLC. Se filtran a través de membrana de 0,45 µm de diámetro de poro y se desgasifica antes de usar. 4.1.4 Soluciones estándar de aflatoxinas Sigma A-1022, la cual contiene las siguientes cantidades de aflatoxinas en forma de película desecada: AFB1:25 µg; AFG1:25 µg; AFB2: 7,5 µg de AFB2; AFG2: 7,5 µg. Preparación de la solución madre: se disuelve el contenido del vial con 5,0 ml de benceno: CH3CN (98 + 2) para obtener las siguientes concentraciones de aflatoxinas: 5 µg/ml de AFB1; 1,5 µg/ml de AFB2; 5 µg/ml de AFG1; 1,5 µg/ml de AFG2. Preparación de la solución de trabajo: se toman 400 µl de la solución madre y se llevan a un vial ámbar silanizado de 40 ml. Se evaporan a sequedad el solvente en corriente de nitrógeno y redisolver con 40 ml de acetonitrilo grado HPLC. La concentración final de aflatoxinas: 50 ng/ml de AFB1; 50 ng/ml de AFG1; 15 ng/ml de AFG2 y 15 ng/ml de AFB2. Preparación del estándar de calibración (estándar externo de cuantificación):

4.3

a)

Se colocan 200 µl de solución estándar de trabajo en un vial ámbar de automuestrador (preferiblemente silanizado)

b)

Se añaden 700 µl de reactivo de derivatización.

c)

Se calienta a 65 °C durante 10 min en baño termostatado. termost atado. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se inyectan 50 µl en el cromatógrafo de líquidos.

PROCEDIMIENTO GENERAL

4.3.1 Extracción 1)

En un erlenmeyer de 250 ml con tapón esmerilado o tapa rosca, se mezclan 50 g de muestra adecuadamente molida (Molino Romer Serie II o equivalente) con 100 ml de solvente de extracción (CH 3CN: agua 84 + 16) 16) durante 1 h en agitador de vaivén (alternativamente, se homogeneiza la muestra y el solvente durante 3 min en una licuadora empleando un vaso de vidrio de 250 ml de capacidad). Nota. Se recomienda pesar la mitad de la muestra (25 g) cuando se realicen análisis de harina de arroz, harina de yuca, torta de algodón, torta de soya y subproductos de trigo.

3

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA COLOMBIANA 2)


Se filtra a través de papel cualitativo y se recogen cerca de 5 ml de filtrado en un tubo de ensayo de 10 ml.

4.3.2 Purificación del extracto 3)

Se inserta lentamente el extremo con el reborde de caucho de la columna de limpieza (Columna Mycosep 224 MFC o equivalente) en el tubo de ensayo y se presiona hasta obtener cerca de 0,5 ml de extracto purificado en el interior de la columna.

4)

Se transfieren cuantitativamente 0,5 ml del extracto purificado a un vial de fondo cónico de 2 ml de capacidad (preferiblemente silanizado) y se evapora a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno (ReactiVap Pierce o equivalente).

5)

Se redisuelve el residuo seco con 200 µl de acetonitrilo.

4.3.3 Derivatización

4.4

6)

Se añaden 700 µl de reactivo de derivatización.

7)

Se calienta a 65 °C durante 10 min en baño termostatado. termost atado. Se deja enfriar a temperatura ambiente.

HPLC 8)

Se filtra a través de membrana de 0,45 µm (Millipore HVLP 1300 o equivalente) y se inyectan 50 µl en el cromatógrafo de líquidos.

Nota. Las AFB2A y AFBG2a son inestables (especialmente en metanol). Los extractos derivatizados se deben inyectar rápidamente para evitar la degradación de las aflatoxinas.

Cálculos ng/g de aflatoxina en la muestra = C/W

Donde: C

=

ng de aflatoxina inyectada en la columna cromatográfica (en los 50 0,5555 ng)

W

=

equivalente en peso de la muestra inyectada (50 µl), lo cual se calcula con la siguiente fórmula: W = 50 g x (0,5 ml/100 ml) x (0,05 ml/0,90 ml) = 0,01385 g

Límite de detección de la técnica: 1 ng/g de cada aflatoxina 4

µl

=



5.

TÉCNICA POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (TLC)

5.1

APARATOS Y MATERIALES

5.2

1)

Columna de limpieza: el material de empaque de la columna debe tener sitios activos lipofílicos y un intercambiador intercambiador iónico. iónico. El material material se coloca coloca en un tubo plástico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde de caucho en su extremo inferior y un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro poroso debe ir una válvula que permite el flujo de líquido en una sola dirección (columna (columna Mycosep 224 MFC o equivalente)

2)

Bomba de vacío

3)

Balanza con sensibilidad 0,1 g

4)

Cabina con lámpara de luz ultravioleta (254 y 366 nm)

5)

Cabina de extracción de vapores y gases

6)

Cámaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 20 x 20 cm

7)

Cámaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 10 x 10 cm

8)

Densitómetro con detector U.V y fluorescencia

9)

Estufa de circulación forzada (graduación con temperatura hasta 180

10)

Jeringa cromatográfica graduada de 50 µl.

11)

Agitador de vaivén

12)

Baño termostatado con capacidad para regular una temperatura de 65

13)

Evaporador de nitrógeno (reactiVap Pierce o equivalente)

14)

Papel de filtro cualitativo de 25 cm de diámetro (Whatman No. 4 o equivalente)

15)

Pipetas de 5 ml de capacidad

16)

Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm

17)

Micropipeta Micropipet a de volumen variable con capacidad para medir de 10 µl a 100 µl

18)

Viales para derivatización derivatización de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de teflón.

C).

°C

REACTIVOS -

Solvente de extracción: se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analítico con 160 ml de agua destilada.

5



-

Fase móvil: se preparan 50 ml por cámara de una mezcla cloroformo y acetona (9:1).

-

Solución estándar de trabajo: 200 ng/ml AFB1 = AFB2 en benceno acetonitrilo 98:2 60 ng/ml AFB2 = AFG2

5.3

PROCEDIMIENTO

5.3.1 Activación de las placas cromatográficas Se colocan las placas de silica gel 60 (con o sin zona de concentración) en estufa a 105 durante 1 h. Se deja secar y enfriar las placas en un desecador.

°C

5.3.2 Extracción En un erlenmeyer de 250 ml con tapón esmerilado o tapa rosca, se mezclan 50 g de muestra adecuadamente molida (molino Romer serie II o equivalente) con 100 ml de solvente de extracción (CH3CN: agua 84 + 16) durante 1 h en agitador de vaivén (alternativamente se homogeneiza la muestra y el solvente durante 3 min en una licuadora empleando un vaso de vidrio de 250 ml de capacidad). Se filtra a través de papel cualitativo y se recogen cerca de 5 ml de filtrado en un tubo de ensayo de 10 ml. 5.3.3 Purificación del extracto Se inserta lentamente el extremo con el reborde de caucho de la columna de limpieza (columna Mycosep 224 MFC o equivalente) en el tubo de ensayo y se presiona hasta obtener cerca de 2,0 ml de extracto purificado en el interior de la columna. Se transfieren cuantitativamente 2,0 ml de extracto purificado a un vial de fondo cónico de 2 ml de capacidad (preferiblemente silanizado) silanizado) y se evaporan a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno (reactiVap Pierce o equivalente). Se redisuelve el residuo seco con 100 µl de benceno/acetonitrilo benceno/acetonitrilo (98:2) Aplicación de muestras: a una una distancia de 1,5 cm del borde inferior de la placa se aplican 5 µl, 10 µl, 15 µl de estándar con una separación de 1,5 cm entre aplicación igualmente se aplican 10 µl de extracto de la muestra. 5.3.4 Desarrollo de la placa Se satura la cámara con 50 ml de cloroformo acetona (9:1). Se coloca la placa ajustando las condiciones para que Rf sea (04 - 07).

6



5.3.5 Interpretación de los resultados Semicuantitativos Se colocan las placas en la cámara de luz UV. Se compara los valores Rf del estándar y la muestra. Se busca el estándar aplicado de fluorescencia f luorescencia similar a la fluorescencia de muestra. Se reportan los resultados como 4g/kg.

ng / g =

µl de estándar equivalent e muestra × concentración × volumen final extracto µl ext . aplic. × peso muestra

Cuantitativo Utilizando un densitómetro se realiza la curva de calibración aplicando cuatro estándares 2 10 µl, 15 µl de la muestra y se reportan los µg/kg de la muestra.

µl,

5 µl,

Calibración de los estándares Cálculo de absortividad molar ∈ y factor de corrección (CF) En espectrofotómetro se determina la absorbancia de tres soluciones de K 2Cr2O7 en H2SO4 Solución 1: 0,25 mM Solución 2: 0,125 mM solución 3: 0,0625 nM Se determina la absorbancia (A) a 350 nm utilizando como blanco una solución de 0,0018 N de H2SO4 en agua. Se calcula ?

mediante la ecuación: ∈=

(A X 1 000)/concentración en mM

Para determinar el factor de corrección corrección CF, se reemplaza en la ecuación ecuación CF = 3160/ ∈ Cálculo de la concentración de estándares de aflatoxinas en benceno:acetonitrilo (98:2) (aplicable a estándares independientes independientes a AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2). Se realiza para el espectro espectro para establecer establecer la máxima absorbancia absorbancia entre 330 nm - 370 nm se calcula: µ g aflatoxina

mL

= ( A × MW x 1 000 × CF ) ∈

7



Donde: A

=

lectura del espectrofotómetro

MW y ∈

=

tomados según la siguiente tabla

Aflatoxina

MW

∈

B1 B2 G1 G2

312 314 328 330

19,800 20,900 17,100 18,200

También se pueden adquirir estándares preparados.

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Anexo A (Informativo) Bibliografía DÍAZ, G.J. 1995. Análisis de aflatoxinas por cromatografía líquida de alta eficiencia. Métodos de análisis del Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. HOLCOLB, M., WILSON, D.M., TRUCKSESS, M.W. 6 THOMPSON, H.C. 1992 Determination of Aflatoxins in Food Products by Chromatography. Journal of Chromatography, 624:341-352. PARK, D.L., S. NESHEIM, S., TRUCKSESS, M.W., STACK & R.F. NEWELL. 1990. Liquid Chromatographic Method for Determination of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in corn and Peanut Products: Collaborative Study. J Assoc. Off. Anal. Chem., 73:260-266. TRUCKSESS, M.W., STACK, M.E., M.E., NESHEIM, S., ALBERT, R.H. & ROMER, T.R. 1994. Multifunctional Column Coupled with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxins B1, B2, G1, and G2 in corn Almonds, Brazil nuts, Peanuts, and Pistachic Nuts: Collaborative Study J. of AOAC Int., 77: 1512-1521 WILSON, T.J. & ROMER, T.R. 1991. Use of Mycosep Multifunctional Cleanup Column for Liquid Chromatographic Determination of Aflatoxins in Agricultural Produts. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74:951-956.

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NTC 1232 Metodo de Analisis de as de Ocurrencia Natural

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