MINISTERE DE L¶ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DES SCIENCES DE LA MER ET L¶AMENAGEMENT DE LITTORAL ENSSMAL
Fait par : HAMDI Mohamed Salim Enseignante : Mlle AMROUCH
- 4ème aquaculture - 2009/2010 -
Plan de travail
1- la préparation des milieux de culture pour le contrôle biologique des aliments ; (page 3) 2- recherche et dénombrement de micro-organismes (bactéries et champignons) champignons) ; (page 5) 3- isolement et identification des bactéries pathogènes (coloration de gram, tests doxydase et de catalase, test sur galerie API) ; (page 8) 4- test de toxicité sur souris ; (page 12) 5- dosage des toxines protéiques (méthode de BRADFORD). (page 14)
INTRODUCTION ORIGINE DES Les
MICRO-ORGANIS MES PRESENTS DANS UN ALIMENT :
micro-organismes des aliments ont 3 origines possibles :
-Ils préexistent dans la matière brute ou laliment avant toute manipulation ou transformation ; -ils sont apportés accidentellement lors des manipulations ultérieures de laliment ; -ils sont ajoutés volontairement. EFFET SUR LALI MENT DES Les
MICRO-ORGANISMES NUISIBLES :
micro-organismes nuisibles sont les micro-organismes pathogènes
(salmonelles et shigelles, staphylocoques, vibrio, sulfito-réducteurs), responsables dintoxications alimentaires et les micro-organismes pouvant causer des altérations des aliments. * les altérations provoquées par les micro-organismes nuisibles se résument aux : -altérations de laspect ou de la texture ; -altérations du goût et de lodeur ; -altérations des qualités nutritives. PRINCIPES DE LANALYSE Lanalyse y
MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS :
microbiologique des aliments répond à deux nécessités :
Lexpertise
: Elle permet de déterminer si un aliment est responsable
dune intoxication alimentaire et comment. y
La
prévention : Elle permet de tester un aliment pour savoir sil est
consommable du point de vue microbiologique, c'est -à-dire : - sil ne contient pas ou pas trop de bactéries susceptibles de laltérer, et sil pourra être conservé selon certaines règles ; - sil ne contient pas de micro-organismes toxinogènes ou virulents.
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* un certain nombre de difficultés rendent lanalyse lanalyse microbiologique délicate : - laliment est rarement stérile. Une bactérie considérée comme pathogène ne provoquera pas forcément une infection. Celle-ci dépend de nombreux facteurs, notamment du nombre de ces bactéries ingérées ; - la recherche dun groupe particulier de bactéries parmi dautres peut être très difficile ; - le coût des analyses microbiologiques est fort élevé pour une rentabilité faible. * Que laliment soit responsable présumé dune intoxication alimentaire ou simplement à tester, les recherches sont dabord orientées vers les microorganismes responsables des intoxications alimentaires : toxines ou bactéries pathogènes. Ainsi, plusieurs TP ont été effectués, traitant traita nt globalement de : - la préparation des milieux de culture pour le contrôle biologique des aliments ; - recherche et dénombrement de micro-organismes (bactéries et champignons) ; isolement et identification des bactéries pathogènes (coloration de gram, tests doxydase et de catalase, test sur galerie API) ; - test de toxicité sur souris ; - dosage des toxines protéiques (méthode de BRADFORD). I.
PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE POUR LE CONTROLE BIOLOGIQUE DES ALIMENTS :
La
culture des micro-organismes se fait soit sur milieu solide (gélose) ou sur
milieu liquide (bouillon). Les milieux sont à lorigine sous forme de poudre, quil faut ensuite préparer. Les
milieux de culture sont pour la plupart sélectifs, c'est-à-dire quils apportent
les nutriments essentiels au développement de certains germes, mais contiennent des composés qui inhibent la croissance des autres microorganismes (voir annexe).
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Matériel utilisé : - verrerie selon besoins (béchers, éprouvettes, flacons), thermomètre, balance de précision, agitateur, becs bunsen, boites de pétri, autoclave, plaque chauffante.
Produits : - Milieux de culture sous forme de poudre - Eau distillée - HCl et NaOH (ajustement du pH)
Protocole : · Peser la masse nécessaire de poudre (indiquée sur sa boite). · Dissoudre la poudre dans leau distillée à l'aide de l'agitateur. · Chauffer au bec bunsen ou sur plaque chauffante jusquà lobtention dun liquide homogène . Ajuster le pH au besoin (par ajout de NaOH ou de HCl) . Autoclaver le bouillon, si cela est indiqué sur la boite du produit, ou alors ; · Laisser refroidir la préparation · Lorsque la préparation a atteint une température inférieure à 60°C couler dans des boites de pétri.
1-1- Milieux pour la recherche des germes pathogènes : Les
milieux de culture que nous avons préparé en TP sont (certains sont à titre
indicatif seulement): 1-1-1- Pour les Salmonelles : y
Bouillon denrichissement SFB
y
Milieu gélosé SS-Agar (Salmonelles, shigelles)
1-1-2- Vibrions : y
Bouillon denrichissement (EPA): Eau pepetonée alcaline (10 fois concentrée)
y
Milieu gélosé thiosulfate citraté bilié sucrose (TCBS)
1-1-3- Les sulfito-réducteurs (anaérobies)
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y
Milieu gélosé viande-foie
1-1-4- Les staphylocoques : y
Milieu Chapman
1-2- Milieux pour la recherche des germes indicateurs (de pollution fécale) : 1-2-1- Coliformes (coliformes totaux et fécaux) : y
Milieu solide : Tergitol + additifs (Tergitol + TTC)
y
Gélose
désoxycholate à 1%
1-2-2- Streptocoques fécaux : Milieu Slanetz et Barthely
y
1-3- Recherche de levures et moisissures : y
II.
Milieu Sabouraud
RECHERCHE ET DENO MBREMENT DE MICRO-ORGANIS MES (BACTERIES ET CHAMPIGNONS ) :
2-1- Préparation de la source de contamination (chair de la sardine) : Matériel utilisé : - pipette de 1 ml± m l± 0.01ml - éprouvette de 25 ml± 0.25ml - bécher de 250 ml - tubes à essais - fiole de 500 ml - mixeur - balance de précision - boites de pétri de 5.5cm de diamètre - bec bunsen
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Mode opératoire : A laide dun mixeur stérile on broie 25g de chair de la sardine avec
y
225ml deau physiologique : A / Préparation de la solution mère : 10
-1
1- Lavage du poisson à leau de robinet, enlever les écailles, la peauetc. 2- Peser 25g de chair 3- Mettre 225ml deau physiologique dans le mixeur avec les 25g de chair puis mixer jusquà lobtention dune solution homogène (bouillon). B / Préparation des solutions filles : -2
a- dilution 10 : Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de lasolution mère puis p uis on complète à 10 ml avec de leau physiologique. b-
-3
Dilution 10 : -2
Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de dilution 10 puis on complète à 10 ml avec de leau physiologique.
2-2- Ensemenceme nsemencement nt des colifor coliformes mes en milieu solide : Leur
culture se fait en profondeur : A laide dune pipette pasteur, on met dans
une boite de pétri, 20 gouttes (correspond à ~ 1ml) dune dilution, on coule la gélose désoxycholate à 0.1%, puis on procède à un étalement en faisant des mouvements de huit. Incubation :
-Une série de boites sera incubée à 37°C, pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes totaux, -lautre série sera incubée à 44°C pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes fécaux..
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Que se soit à 37 ou à 44°C, les premières lectures se feront au bout de 24 h et consistent à repérer les petites colonies rouges ayant poussé.
2-3- Ensemenceme nsemencement nt des Streptocoqu treptocoques es fécaux: Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Slanetz. On verse à laide dune pipette pasteur, 100µl de dilution. Lincubation de fait à 37°c.
2-4- Ensemenceme nsemencement nt des Staphyl taphylocoques ocoques : Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu milieu Chapman. On verse à laide dune pipette pasteur, 100µl de dilution. Lincubation de fait à 37°c.
2-5- Ensemenceme nsemencement nt des levures et moisissures : Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Sabouraud. On verse à laide dune pipette pasteur, 100µl de dilution. Lincubation de fait à température ambiante.
2-6- Ensemenceme nsemencement nt des sulfitoréd sulfitoréducteurs ucteurs : Ce sont des organismes anaérobies => lensemencement se fait dans un tube à essai (qui sera fermé ensuite) : 100 µl + milieu gélosé viande-foie. On agite le tube à essai en essayant de ne pas toucher le bouchon avec la gélose liquide. Lincubation
se fait à 37°c.
* Il faut prendre le soin de bien étaler sur toute la surface de la boite. * La lecture se fait 24 à 48 heures après.
2-7- Dénombrement : Il sagit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs de dilutions, de plus : - ne dénombrer dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier le nombre trouvé par linverse de sa dilution, - faire la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions. - On ne doit pas trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux.
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ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES BACTERIES PATHOGENES
III.
(COLORATION DE GRAM, TESTS DOXYDASE ET DE CATALASE , TEST SUR GALERIE API) :
3-1- Isolement de quelques bactéries : Vibrio
sur TCBS
Salmonelles sur le milieu SS
Mode opératoire : On ensemence une boite de pétri en faisant des stries ce qui permet d'obtenir des colonies pures et isolées les unes des autres. A laide dune pipette pasteur stérile on prend une seule colonie après avoir flambé la pipette et on fait des stries dans la boite (moitié) puis flamber la pipette et la refroidir, puis tourner la boite 90° puis faire dautres stries, arrivé au dernier carré, on fait une sorte de S, comme indiqué sur la figure ci-dessus.
Figure 1: technique d'ensemencement
Figure 2: type de résultat o btenu
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3-2- Coloration de gram : La
coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en
bactériologie médicale; elle permet de colorer les bactéries et de les distinguer à l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane ( Gram +) ou la fuschine (couleur rose) (Gram -). Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.
Mode opératoire : y
Réaliser un frottis ou un étalement
y
Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame.
y
Immerger les lames dans la solution de Violet de
Gentiane
pendant
1mm. y
Lavage
à l'eau en transvasant les lames
y
Immerger les lames dans du Lugol en les agitant (2 fois pendant 20 seconde)
y
Laver
à nouveau à l'eau
y
Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte à goutte sur la lame inclinée pendant 45 secondes.
y
Laver
à l'eau.
y
Contre colorer avec la solution de fushine pendant 20 à 30 secondes.
y
Laver
y
Observer à lobjectif X100, en immersion avec de l'huile.
à l'eau et sécher à l'air.
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Figure 3: exemple de bactéries G+ (violet) et de bactéries G- (rose)
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3-3- Test doxydase : Bactérie sur disque oxydase changement de couleur oxydase positive. Principe : Si une bactérie possède l'enzyme respiratoire membranaire, appelée la cytochrome oxydase (dernière enzyme de la chaîne respiratoire), alors elle peut faire la réaction doxydase qui va colorier les pastilles doxydase. Manipulation Manipulation :
Figure 4: pastille
- On prend un disque doxydase (0.8 mm de diamètre)
carrée d'oxydase (ici oxydase +)
- On met dessus une goutte deau stérilisée - avec une pipette pasteur, on prend une colonie bactérienne et on la met sur le disque -> le test est positif si la colonie devient violette et est négatif si rien ne se passe. Résultat : Vibrio oxydase - (en TP les disques oxydase étaient périmés . Le résultat aurait dû être positif pour les vibrio)
3-4- Test de catalase : Bactérie isolée sur lame + gouttes de H 2O2 (eau oxygénée) Absence de bulles dair (réaction) catalase (pas de réaction) Présence de bulles dair catalase + (dégradation de H 2 O2 selon la réaction suivante) : H2O2
H2 O +
½ O2
Résultat :
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3-5- Test sur galerie API 20E: 3-5-1- Présentation de la galerie :
Galerie
de 20 microtubes prêts à lemploi permettant de réaliser 20 tests
biochimiques afin didentifier des bacilles
Gram
appartenant à la famille des
ENTEROBACTERIACEAE. 3-5-2- Manipulation : - On choisit 1 colonie de la souche bactérienne à identifier ; - On la met dans ~5 ml deau distillée (stérilisée) ; - A laide dune pipette pasteur stérile, on remplit les cupules avec la suspension bactérienne ; - pour certains caractères, on ajoute de lhuile de vaseline pour que le produit ne se volatilise pas ; - Remplir deau, les puis du couvercle qui accompagne la galerie, pour éviter lassèchement de leau des galeries, galeries, une fois mise en incubation ;
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- Après ~ 24 h dincubation à 37°c, on peut lire le résultat à laide du
changement de couleur (ou pas) et en se rapportant au catalogue de la galerie 3-5-3- Exemple dun résultat obtenu après incubation :
IV. TEST DE TOXICITE SUR SOURIS *Les tests de toxicité permettent entre autres, de : - quantifier spécifiquement la toxicité dun produit chimique pour un organisme ; - fixer des limites maximales ou tolérables ; - retirer de la circulation des composés toxiques. *Les inconvénients de ces tests peuvent se résumer en ce qui suit : - Ces tests sont des tests dépendants du temps (24 à 96h) ; - Ne reflètent pas les conditions environnementales ;
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- Ces tests sont hautement spécifiques et les résultats ne sont pas forcément extrapolables à dautres espèces.
4-1- Préparation de la dose à injecter: - On prend 10 grammes de chair ou de laliment + 100 ml de TSE (tryptone, sel, eau) ou de leau physiologique 9%, ou à défaut, de leau distillée stérile - broyage - centrifugation (1000 rpm, +4°c) - on obtient deux phases, avec un surnageant et un dépôt au culot. Cest le surnageant qui peu contenir la toxine - Filtrer le surnageant à laide dun filtre seringue 0,45-0,2mm (voir photo cidessus)
- injection du filtrat en une seule seule dose (500µl), en intrapéritonéale , avec une seringue à aiguille fine et sur des souris de 18-22 gr.
4-2- manipul manipulation ation des souris : - Soulever la souris par la queue et la poser pose r sur le toit de la cage, sans lâcher la queue ; - prendre la souris par les oreilles et la retourner (sans lâcher les oreilles); - coincer la queue entre les 2 derniers doigts de la main, tout en maintenant la souris par les oreilles et retournée ; -la souris simmobilise, permettant ainsi de faire linjection intrapéritonéale (voir photo ci-dessus)
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4-3- Résultats : *Une seule souris a reçu une dose de toxine botulique très diluée. Elle a manifesté quelques signes de « début » de paralysie, mais sont état de santé ne semblait pas saggraver dans le temps, même après lajout dautres injections (surement à cause de la forte dilution de la toxine). *Les autres souris ont été injectées avec de leau distillée, seulement pour un but pédagogique ; elles nont donc manifesté aucun signe daggravation de leur état de santé. V. DOSAGE DES TOXINES PROTEIQUES (METHODE DE BRADFORD ) :
5-1- Principe : La
méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, basé sur le changement
d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (comp lexation) avec les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présent dans la ou les protéines. La
forme anionique (liée) du colorant est bleue, et possède un spectre
d'absorption maximal estimé historiquement à 595 nm. Les formes cationiques (libres) du colorant sont rouges et vertes, absorbant à 465-470 nm. Le changement d'absorbance est proportionnel à la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon. Contrairement aux autres méthodes de mesure des protéines, la méthode de Bradford est moins sensible aux interférences par divers agents présents dans les échantillons de protéine. Elle est toutefois affectée par les détergents,
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odifiée par le pH, et donne un résultat positif égale ment aux polyphénols hydrosolubles de haut poids moléculaire (tanins). m
5-2- Préparation du réactif : bleu de coo massie ( R250) (50mg) (50mg) : - Alcool- ethanol absolu : 25 ml - Orthophosphate 80% : 50 ml - qsp deau distillée : Vf: 500 ml * La coloration bleue doit disparaitre après ajout deau. * Le produit final aura une couleur ~ gris-brun, ensuite cest le virage vers le bleu qui indique la présence de protéines * Il faut bien mélanger le produit et le sticker à labri de la lumière à +4°c.
5-3- Préparatio Préparation n de la gamme étalon : Le
réactif utilisé pour la préparation de la gamme étalon est les BSA (Serum
Albumine Bovine) - On pèse 20mg de BSA (poudre) et on o n le dilue dans 1ml, puis il est mit dans un microtubule. - nous avons besoin de seulement 1mg/ml de BSA => on prélève 50µl de la première solution et on ajoute 950µl deau distillé pour atteindre les 1000µl (1ml) * La gamme étalon choisie, ainsi que les absorbances sont reportées dans le tableau suivant :
N° tube
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Ech
BSA (µg)
0
5
10
20
30
40
50
60
70
80
100
x
H2O (µl)
100
95
90
80
70
60
50
40
30
20
0
50
Réactif Bradford (ml)
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Absorbances
0
0.052
0.127
0.137
0.138
0.162
0.231
0.307
0.312
0.34
0.427
0.38
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*Avant la lecture au spectrophotomètre, il faut mélanger les tubes à la main et les incuber à labri de la lumière pendant 5 à 10 minutes * La lecture au spectrophotomètre se fait à la longueur donde de 595 nm. On
présente ci-dessous la courbe détalonnage :
5-4- Calcule de la concentration de l achanti achantillon llon : *Nous obtenons un très bon coefficient de corrélation (0.927 très proche de 1), ce qui démontre que la gamme étalon a été faite correctement, et cela va nous permettre de calculer la concentration de léchantillon avec une bonne précision. *Grâce à la droite de régression nous pouvons calculer la concentration de léchantillon en connaissant son absorbance, ainsi : Equation de la droite de régression : Y= 0.004 X
0.38 = 0.004 [Ech]
[Ech] = 0.38/0.004
[Ech]= 95 µg/µl
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ANNEXE : Présentation de quelques milieux de culture utilisés en TP : 1/ milieu SS : Gélose
Salmonella-Shigella.
Milieu sélectif permettant lisolement d'entérobactéries pathogènes. Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car trop sélectif. Composition : Formule en
g/L d'eau distillée :
Extrait de viande de buf Bio-polytone Sels biliares Lactose Citrate de sodium Thiosulfate de sodium Citrate ferrique Vert brillant Rouge neutre Agar pH = 7,0
Lecture
5 5 8,5 10 8,5 8,5 1 0,330 mg 0,025 13,5
:
Colonies rouges : lactose + Colonies incolores : lactose Colonies à centre noir : H2S +
2/ milieu TCBS :
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La
gélose TCBS est un milieu sélectif, préconisé par l'OMS (Organisation
Mondiale de la Santé) pour la recherche et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly microbiens. La forte concentration en bile et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de nombreuses bactéries. La croissance des Entérobactéries et des Enterococcus n'est cependant que ralentie.
Composition : Formule en
g/L d'eau distillée : Peptone de caséine Peptone de viande Citrate de sodium Citrate de fer III Bile de buf desséchée Thiosulfate de sodium NaCl Saccharose Bleu de bromothymol Bleu de thymol Agar Eau distillée (qsp)
5,0 g 5,0 g 10,0 g 1,0 g 8,0 g 10,0 g 10,0 g 20,0 g 0,04 g 0,04 g 14,0 g 1000 mL
3/ gélose BAIRD PARKER : ococcus aureus. Recherche et dénombrement de Staphyl ococcus
Composition : Le
tellurite et le jaune d'uf sont ajoutés au milieu au moment de
lemploi. Formule en g/L d'eau distillée :
Bio-Trypcase Extrait de viande de buf Extrait de levure Chlorure de lithium Pyruvate de sodium Glycocolle Tellurite de potassium Emulsion de jaune d'uf à 10 % Agar
10 5 2 5 10 12 1 mL 1 mL 15
pH = 7,2
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Lecture
:
S. aureus donne des colonies : -
noires
-
brillantes, convexes
-
de 1 à 2 mm de diamètre
-
entourées d'un halo clair.
La
plupart des autres espèces de staphylocoques sont inhibées ou ne produisent pas de colonies
caractéristiques en 24 heures. Les
microcoques, Bacillus et quelques levures peuvent pousser sur ce milieu.
4/ milieu SABOURAUD : La
gélose de Sabouraud constitue un milieu classique
pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes. Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification. Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol. Composition : En g par litre de milieu : Pe ptone pe psique de viande Glucos e Agar agar
10 35 15
pH du milieu prêt à l'em ploi à 25°C: 5,7 +/- 0,2. 500 g d e poudre permettent d e pré parer 8,3 litres de milieu
5/ gélose lactosée au desoxycholate 0 .1% : Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments). Il sera incubé à 37°C pour la recherche des coliformes totaux et à 44°C pour la recherche des coliformes thermotolérants. Composition : Formule en
g.L-1 d'eau distillée :
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Peptone Lactose Citrate de sodium Rouge neutre Désoxycholate de sodium Chlorure de sodium Hydrogénophosphate de potassium Agar
10 10 1 0.03 1 5 2 13
pH = 7,3
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