Microbiologie-generala-Curs.pdf

Microbiologie Generală - Curs

Gheorghe PUCHIANU

MICROBIOLOGIE GENERALĂ

2013 1


Şef Lucr. Univ. Dr.

Gheorghe PUCHIANU

Medic Primar Veterinar Doctor în Ştiinţe Medicale Veterinare

Microbiologie Generală

2013

2


Curs 1. 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 3. 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.3.6. 3.3.7. 3.3.8. 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. 5. 5.1. 5.1.1.

CUPRINS Denumire Cuprins Obiectul şi istoricul nicrobiologiei, clasificarea generală a microorganismelor, microorganisme cu importanţă în contaminarea alimentelor. Obiectul microbiologiei Istoricul microbiologiei Clasificarea generală a microorganismelor Microorganisme cu importanţă în conataminarea alimentelor Bacterii - principii de taxonomie bacteriană, caractere generale ale bacteriilor, morfologia bacteriilor (dimensiunile, forma şi gruparea bacteriilor). Principii de taxonomie bacteriană Criterii taxonomice Categorii de taxoni Caractere generale ale bacteriilor Morfologia bacteriilor Dimensiunile bacteriilor Forma bacteriilor Gruparea bacteriilor Structura celulei bacteriene - constituenţi intraparietali (peretele celular, membrana citoplasmatică, citoplasma, ribozomii, incluziile şi granulele citoplasmatice, materialul nuclear, plasmidele şi mezozomii) Structura celulei bacteriene Constituenţi intraparietali Peretele celular Membrana citoplasmatică Citoplasma Ribozomii Incluziile şi granulaţiile citoplasmatice Materialul nuclear Plasmidele Mezozomii Structura celulei bacteriene - constituenţi extraparietali (capsula şi stratul mucos, cilii sau flagelii, pilii şi fimbriile, spinii, glicocalixul, sporul bacterian). Constituenţi extraparietali Capsula şi stratul mucos Cilii sau flagelii Pilii şi fimbriile Spinii Glicocalixul Sporul bacterian Fiziologie bacteriană (metabolismul bacterian, nutriţia bacteriilor), Creşterea şi reproducţia bacteriană. Fiziologie bacteriană Metabolismul bacterian

3

Pag. 7

12

20

27

33


5.1.1.1. 5.1.1.1.1. 5.1.4. 5.1.2. 5.1.3. 6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6. 8. 8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.4.1. 8.4.2. 8.4.3. 8.4.4. 8.4.4.1. 8.4.4.2. 8.4.4.3. 8.4.4.4. 8.4.4.5. 8.4.4.6. 8.4.4.7. 8.5. 8.6. 8.6.1. 8.6.2. 9. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4.

Nutriţia bacteriilor Surse de nutriţie preferate de microorganismele organotrofe Modalităţi de transport ale nutrienţilor în celula microbiană Respiraţia bacteriană Creşterea şi reproducţia bacteriană Principalele specii de bacterii patogene implicate în contaminarea alimentelor – Bacterii Gram negative Salmonella spp. Campylobacter jejuni Yersinia enterocolitica Shigella spp. Vibrio parahaemoliyticus Brucella spp. Escherichia coli Principalele specii de bacterii patogene implicate în contaminarea alimentelor – Bacterii Gram pozitive Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus spp. Clostridium perfringens şi C. botulinum Bacillus spp. Mycobacterium Drojdii (Levuri) Importanţă şi rol Răspândire în natură şi rezistenţă Caractere morfologice generale Structura celulei de drojdie Peretele celular Plasmalema (membrana citoplasmatică) Citoplasma Organitele celulare Nucleul Mitocondriile Reticulul endoplasmatic Aparatul Golgi Ribozomii Lizozomii Peroxizomii Caractere fiziologice generale ale drojdiilor Reproducerea drojdiilor Reproducerea prin înmugurire Reproducerea prin sporulare Clasificarea generală a drojdiilor şi principalele specii implicate în contaminarea alimentelor Genul Saccharomyces Genul Candida Genul Rhodotorula Genul Kloeckera

4

40

50

58

67


9.5. 9.6. 9.7. 9.8. 9.9. 9.10. 9.11. 9.12. 9.13. 9.14. 10. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.5. 10.6. 10.7. 11. 11.1. 11.1.2. 11.1.2. 11.1.3. 11.2. 11.2.1. 11.2.2. 11.2.3. 11.2.4. 11.3. 11.3.1. 11.3.2. 11.4. 11.4.1. 11.4.2. 11.5. 11.5.1. 11.5.2. 11.5.3. 11.5.4. 11.5.5. 11.5.6. 11.5.7. 11.5.8. 11.5.9. 12.

Genul Brettanomyces Genul Debaryomyces Genul Hanseniaspora Genul Pichia Genul Saccharomycodes Genul Saccharomycopsis Genul Schizosaccharomyces Genul Torulopsis Genul Torrula Genul Zygosaccharomyces Mucegaiuri – răspândire şi rol, rolul mucegaiurilor, caractere morfologice, structura mucegaiurilor, reproducerea, clasificarea mucegaiurilor Răspândire şi rol Rolul mucegaiurilor în industrie Caractere morfologice Structura mucegaiurilor Caracteristici fiziologice generale Reproducerea mucegaiurilor Clasificarea generală a mucegaiurilor Clasificarea generală a mucegaiurilor şi principalele specii implicate în contaminarea alimentelor Mastygomycotina Genul Peronospora Genul Phytium Genul Phytophtora Zygomycotina Genul Mucor Genul Rhizopus Genul Thamnidium Genul Absidia Ascomycotina Genul Byssochlamys Genul Monascus Basidiomycotina Genul Puccinia Genul Ustilago Deuteromycotina Genul Aspergillus Genul Penicillium Genul Botrytis Genul Fusarium Genul Cladosporium Genul Alternaria Genul Geotrichum Genul Trichoderma Genul Trichothecium Alte microorganisme care pot contamina alimentele

5

72

76

86


12.1. 12.1.1. 12.1.2. 12.1.2.1. 12.1.2.1.1. 12.1.2.1.2. 12.1.2.1.3. 12.1.2.1.4. 12.1.2.2. 12.2. 12.3. 12.4. 12.5. 12.6. 13 13.1. 13.2. 13.3. 13.4. 14. 14.1. 14.1.1. 14.1.2. 14.1.3. 14.1.4. 14.1.5. 14.1.6. 14.1.7. 14.2. 14.2.1. 14.2.2. 14.2.3. 14.2.4. 14.2.5. 14.2.6.

Virusuri Consideraţii generale Virusuri care pot fi implicate în contaminarea alimentelor Alimente de origine animală Enterovirusuri Virusul febrei aftoase Virusul hepatitei infecţioase Virusul encefalitei transmisibile prin artropode Alimente de origine vegetală Microvirusurile Viroizii Bacteriofagii Cianofagii Prioni Paraziţi implicaţi în contaminarea alimentelor cu implicaţii în producerea de îmbolnăviri la consumatori. Trichinella spp. Sarcocystis spp. Anisakis spp. Alţi paraziţi care pot contamina alimentele Influenţa factorilor de mediu asupra bacteriilor Influenţa factorilor extrinseci asupra microorganismelor Temperatura Umiditatea Concentraţia de oxigen Energia radiantă Factorii mecanici Factori chimici Factori dependenţi de mediu Influenţa factorilor intrinseci asupra microorganismelor Compoziţia chimică a alimentelor Structura anatomică Valoarea pH -lui Valoarea rH-lui Indicele de activitate al apei (aw) Substanţe naturale cu efect antimicrobian Bibliografie

6

91

97

107


CURS nr. 1 NOŢIUNI GENERALE În accepţiunea Regulamentului 2073/2005 microorganismele sunt reprezentate de bacterii, virusuri, drojdii, mucegaiuri, alge, protozoare parazitice, helminţi paraziţi microscopici şi toxinele şi metaboliţii acestora, sisteme cu organizare complexă, monocelulare sau pluricelulare, cu metabolism propriu şi continuitate genetică, cu o infinită diversitate a caracterelor morfologice şi fiziologice. (Reg. 2073). 1.1. Obiectul microbiologiei Microbiologia (micros = mic; bios = viaţă; logos = ştiinţă) este o ştiinţă fundamentală care studiază morfologia, fiziologia şi sistematica microorganismelor, originea şi evoluţia lor, fenomenele de ereditate şi variabilitate microbiană. O componentă importantă a microbiologiei este microbiologia produselor alimentare care are drept obiect de studiu microorganismele care pot contamina alimentele pe parcursul întregului lanţ alimentar, de la materiile prime la produsele finite, în scopul prevenirii alterării lor şi scăderii valorii alimentare sau a îmbolnăvirii prin consum de alimente, contaminate cu microorganisme care pot genera episoade de toxiinfecţii alimentare. Ramurile microbiologiei cu caracter aplicativ pentru alimente sunt: · microbiologia produselor alimentare - are drept obiect de studiu cunoaşterea naturii şi activităţii metabolice a microorganismelor care pot contamina întregul lanţ alimentar, de la materiile prime la produsele finite, în scopul prevenirii alterării lor şi pierderea valorii alimentare sau a îmbolnăvirii prin consum de alimente, contaminate cu microorganisme patogene-toxicogene; · microbiologia a apei; · microbiologia industrială (tehnică) - reprezintă ştiinţa de investigare şi control al fermentaţiilor, respectiv de folosire a microorganismelor în calitate de reactivi, în scopul obţinerii industriale a unor produse cu valoare economică. Prin dezvoltarea microbiologiei industriale, cu ajutorul microorganismelor se obţin avantajos aproximativ 200 de produse, printre care: alcoolul etilic şi butanolul, acetona, acidul citric, acidul lactic, aminoacizi, enzime, proteine, vitamine, insecticide biologice, produse de biosinteză ce se obţin pe plan mondial în cantităţi mari (milioane tone per an) sau vaccinuri, vitamine şi enzime purificate, hormoni de creştere, interferonul, antibiotice, în cantităţi mici. Primul patent înregistrat pentru un produs de biosinteză microbiană datează din 1882 pentru enzime proteolitice folosite la tăbăcirea pieilor. 1.2. Istoricul microbiologiei Cele mai vechi celule se pare că au apărut acum 4 miliarde de ani, acestea fiind reprezentate de bacteriile metanogene. O vechime considerabilă o au şi cele aparţinând genului Clostridium descoperite în lave vulcanice pietrificate care au existat cu cel puţin 2 miliarde de ani în urmă. Celulele eucariote s-au transformat de aproximativ 1500 milioane şi diversificarea ulterioară a acestora, a condus la apariţia într-o lungă 7


perioadă de timp a strămoşilor plantelor de astăzi. În contrast cu dimensiunile atât de mici ale acestora, importanţa microorganismelor în natură este extrem de importantă, ele având un rol decisiv în menţinerea ecosistemelor şi în asigurarea circuitului principalelor elemente care intră în structura organismelor vii. Încă din antichitate, oamenii de știință credeau că există niște făpturi mici, ce puteau cauza maladiile. De aceea, în multe regiuni mai dezvoltate (Roma, Grecia, semiții), existau norme igienice foarte stricte. Însă existența lor a fost demonstrată abia câteva milenii mai târziu, odată cu inventarea microscopului. Astfel, Robert Hooke a fost primul, ce a susținut existența microorganismelor în 1660 în lucrarea sa Micrografia. Microbiologia apare ca ştiinţă în a doua jumătate a secolului XVII, când explicaţia ştiinţifică a proceselor microbiene a cauzelor care le determină, a fost posibilă odată cu descoperirea microscopului, utilizat pentru prima dată pentru studiul microorganismelor de către Anthonie van Leeuwenhoek (1676), motiv pentru care el este considerat părintele microbiologiei. În 1835, Agostino Bassi de Lodi a arătat că o boală a viermelui-de-mătase este provocată de un microorganism. Aceasta a fost prima oară în istoria biologiei, când s-a demonstrat că un microorganism poate provoca îmbolnăvirea altui organism. 12 ani mai târziu, fizicianul maghiar Ignaz Semmelweis a fost primul care a observat că doctorii spitalelor din Viena răspândeau infecții puerperale și i-a obligat să-și spele mâinile înainte de naștere. Urmează o a doua perioadă în dezvoltarea microbiologiei inaugurată de marele savant, chimist şi medic, Louis Pasteur, considerat părintele microbiologiei industriale, care are meritul de a fi reușit, în 1862, să dovedească printr-o serie de teste riguroase că fermentația nu apare spontan, ci este produsă de microorganismele care se dezvoltă în mediile bogate în nutrienți, în urma expunerii acestora la aer. Pasteur a arătat că fermentația poate fi prevenită dacă aerul care ajunge la mediul de cultură este trecut printr-un filtru sau printr-un tub lung ținut în flacără. Prin aceste experimente, Pasteur nu numai că a infirmat definitiv teoria generație spontane, dar a și pus bazele tehnicilor moderne de sterilizare. El a studiat condiţiile de distrugere ale microorganismelor, stabilind procedee de sterilizare, bolile microbiene ale vinului şi berii produse de microorganisme – agenţi ai fermentaţiei lactice şi butirice, a stabilit modalitatea de tratare a vinului prin încălzire la 60°C, operaţiune îi asigură conservabilitatea, operaţie denumită în prezent pasteurizare. Visul lui Pasteur era să descopere microorganismele care provocau îmbolnăviri ale omului şi animalelor. A studiat boli ca holera găinilor, infecţia cărbunoasă, rabia etc. şi a realizat vaccinurile antiholeric şi antirabic, dovedind că unul şi acelaşi microb este cel care poate produce moartea, în schimb după un tratament adecvat poate da doar forme uşoare de boală şi concomitent o imunitate organismului vaccinat. Până în ultima clipă a vieţii a muncit neobosit pentru binele omenirii. Impresionant este crezul vieţii lui, exprimat simplu în cuvintele: „ Voinţa, munca şi succesul sunt cuprinsul vieţii omeneşti. Voinţa deschide porţile, munca te trece prin ele, iar la sfârşitul drumului vine succesul ca o încoronare a tuturor eforturilor”. 8


Robert Koch, considerat părintele şcolii germane de microbiologie stabileşte că microorganismele sunt cauzele bolilor infecţioase. El a descoperit vibrionul holerei, agentul tuberculozei etc., studii ce-i aduc în 1905 premiul Nobel pentru fiziologie şi medicină. Koch introduce în practica de laborator mediile de cultură solidificate ceea ce a permis izolarea în culturi pure a microorganismelor din natură. Folosirea culturilor pure sa extins odată cu realizarea de aparatură destinată sterilizării mediilor necesare pentru cultivare. În 1884, medicul german Robert Koch publică lucrarea sa, Postulatele lui Koch, o lucrare foarte importantă pentru microbiologie. Un rol important în introducerea culturilor pure în industrie aparţine savantului german E.H. Hansen care a utilizat microorganismele drept inoculi ai fermentaţiilor, fapt ce a condus la microbiologia industrială modernă. Descoperirea primului antibiotic, penicilina de către A. Fleming şi stabilirea tehnologiei de producere şi purificare a acestui antibiotic de către Florey şi Chain reprezintă una dintre cele mai importante realizări ale începutului de secol XX. Omenirea devine astfel posesoarea unei noi arme împotriva microorganismelor patogene şi sunt intens stimulate cercetările de descoperire şi aplicare în terapeutică a noi antibiotice cu spectru specific de acţiune. Fondatorul microbiologiei româneşti este Victor Babeş, care a condus prima catedră de învăţământ medical de anatomie patologică şi bacteriologică. Împreună cu francezul V. Cornil este autorul primului tratat de bacteriologie apărut în lume: „Les bactéries”, în anul 1885. Victor Babeş a studiat boli ca turbarea, morva, lepra, holera, tuberculoza, parazitoze şi a introdus pentru prima dată în ţara noastră tratamentul prin seroterapie – imunizare cu serul provenit de la animale în prealabil vaccinate. Este considerat unul dintre cei mai mari savanţi, a rămas în microbiologie prin numeroasele sale descoperiri. Ioan Cantacuzino a creat o şcoală de microbiologie având ca centru institutul care îi poartă numele, organizând şi dezvoltând activitatea de producţie a serurilor şi vaccinurilor folosite în combaterea bolilor infecţioase. În domeniul imunologiei, virusologiei şi microbiologiei generale, se remarcă savanţii: C. Lavaditi, D. Combiescu, M. Ciucă, Şt. Nicolau etc. care şi-au consacrat activitatea ştiinţifică, combaterii şi eradicării unor boli, pentru formarea şi dezvoltarea şcolii contemporane de microbiologie. 1.3. Clasificarea generala a microorganismelor Variabilitatea extraordinară a microorganismelor şi capacitatea lor de adaptare la cele mai diferite condiţii ale mediului ambiant, fac ca lumea microbiană la nivel planetar să fie deosebit de numeroasă şi greu de clasificat. Clasificarea biologică a lumii vii propusă de Whittaker (1969), acceptată de numeroşi taxonomişti cuprinde un sistem de cinci regnuri în funcţie de modul de organizare celulară şi modalităţi de nutriţie, având următoarea structură: · regnul Monera include organisme monocelulare de tip procariot cu nutriţie de tip absorbtiv, cu metabolism fotosintetic sau chimiosintetic şi reproducere prin diviziune asexuată;

9


regnul Protista include organisme monocelulare de tip eucariot (inclusiv drojdii). Modul de nutriţie este diferit de la un grup la altul, prin absorbţie sau ingestie şi reproducere sexuată/asexuată; · regnul Fungi cuprinde organisme multinucleate de tip eucariot (mucegaiuri) cu nuclei dispersaţi în citosolul hifelor adesea septate, lipsite de plastide şi pigmenţi fotosintetici, cu nutriţie de tip absorbtiv şi reproducere pe cale sexuată şi asexuată; · regnul Plantae , cu organisme multicelulare de tip eucariot, cu perete celulozic, vacuole în citoplasmă şi pigmenţi fotosintetici în plasmide. Modul principal de nutriţie este cel fotosintetic şi reproducerea predominant sexuată; · regnul Animalia , cu organisme multinucleate de tip eucariot fără perete celular, cu nutriţie predominant prin ingestie şi reproducere sexuată. Celula de tip procariot ce aparţine primelor forme de viaţă pe Pământ, prezintă un nucleoid nediferenţiat, lipsit de membrană nucleară. Molecula de ADN conţine întreaga informaţie genetică; celula procariotă nu conţine în citozol organite libere (cu membrană) şi ribozomii au dimensiuni mici. Sunt puţin diferenţiate din punct de vedere morfologic. Celula de tip eucariot, mai evoluată, prezintă un nucleu bine diferenţiat în care este inclusă partea predominantă a genomului alcătuit dintr-un set de cromozomi, care în timpul procesului de înmulţire se divizează şi se repartizează între celulele rezultate. În cromozomi, ADN-ul este cuplat cu proteine de tipul histonelor. În celula eucariotă există organe simple prevăzute cu membrană, iar ribozomii au dimensiuni mai mari decât la procariote. Pentru sistematizarea microorganismelor, se studiază întotdeauna caracterele morfologice, fiziologice, biochimice etc. ale culturii pure, cultură ce rezultă prin înmulţire dintr-o singură celulă (sau unitate formatoare de colonie), în mediu nutritiv steril şi deci cuprinde celule aparţinând unei singure specii. În clasificări, pe bază de criterii morfologice şi fiziologice riguroase, stabilite de la general la particular, principalele grupe de microorganisme componente ale regnurilor citate sunt clasate în diviziuni, clase şi subclase, ordine, familii, triburi, genuri şi specii. La baza tuturor clasificărilor este situată specia, produs al evoluţiei materiei vii, ca rezultat al adaptării la condiţiile existente ale mediului ambiant. Specia corespunde populaţiei de indivizi cu numeroase proprietăţi comune, denumite caractere cu specificitate de specie, care le disting de alte specii. Microorganismele aparţinând unei specii au aceeaşi origine, sunt adaptate la un anumit mediu de viaţă, au metabolism asemănător şi sunt apropiate între ele prin caractere genetice. La microorganisme, specia este denumită din două cuvinte, primul fiind numele genului, care include mai multe specii. Cel de al doilea cuvânt scris întotdeauna cu literă mică, de obicei defineşte un caracter specific. În cadrul speciei se diferenţiază prin caractere distinctive limitate, subspecii, tulpini, varietăţi. Genul - cuprinde una sau mai multe specii pe baza unor caractere comune, specifice de gen. Denumirea genului este în limba latină. Tribul - reprezintă un grup de genuri înrudite. ·

10


Familia - este un grup de triburi sau genuri înrudite. Ordinul - reprezintă un grup de familii înrudite. Clasa - reprezintă gruparea ordinelor înrudite.

11


CURS nr. 2 BACTERII – PRINCIPII DE TAXONOMIE ŞI MORFOLOGIE 2.1. Principii de taxonomie bacteriană Taxonomia (limba greacă taxis = ordine, aranjare), este ştiinţa care se ocupă cu clasificarea microorganismelor Taxonomia (taxon – grup) sau sistematică biologică, este disciplina în a cărei sferă de preocupări intră următoarele: 1. Stabilirea criteriilor taxonomice şi a conduitei de identificare a categoriilor taxonomice cunoscute şi a metodologiei de identificare şi omologare a unităţilor necunoscute; 2. Clasificarea organismelor vii în grupe şi unităţi taxonomice pe baza asemănărilor şi interrelaţiilor lor naturale; 3. Nomenclatura internaţională a categoriilor taxonomice care intră în competenţa unor organisme internaţionale pe plan mondial. Prin convenţie şi tradiţie, nomenclatura este în limba latină. Principiile taxonomiei au fost puse de Linné în monumentala sa lucrare „Systema naturae” (1735). Încadarea bacteriilor în grupări taxonomice pe criterii filogenetice prezintă însă numeroase dificultăţi, datorită absenţei unor dovezi convingătoare, capabile să ateste determinismul filogenetic al bacteriilor. 2.1.1. Criterii taxonomice Majoritatea sistematicienilor acceptă astăzi încadrarea bacteriilor într-un regn aparte numit Protista sau Procaryotae. · Taxonomia sau taxinomia (taxis – ordine, aranjare), este ştiinţa care permite clasarea organismelor în grupuri de afinitate sau taxoni; · Taxonul – reprezintă unitatea de clasificare a organismelor; · Nomenclatura – constituie ansamblu de reguli în alegerea şi fixarea numelui pentru organisme, obiecte, substanţe, concepte, etc. Toate bacteriile / microorganismele oficializate trebuie să fie publicate în revista „International Journal of Systematic Bacteriology”. Fiecare bacterie trebuie denumită cu respectarea regulilor înscrise în „Codul Internaţional de denumire a bacteriilor”. Principalele criterii taxonomice luate astăzi în considerare pentru clasificarea bacteriilor sunt: · Criteriul filogenetic – pentru stabilirea unei filaţii de tipul arborelui filogenetic; · Criteriul omologiei materialului genetic; · Criteriul posibilităţii de recombinare genetică – transferul de material genetic – prin transformare, transducţie, conjugare, este posibil între indivizii din aceeaşi specie sau cei aparţinând unor specii apropiate; 12


· Criteriul antigenic – prezintă importanţă având în vedere omogenitatea antigenică care caracterizează indivizii aceleaşi specii şi distincţia antigenică între specii; · Criteriul biochimic – semnificaţie taxonomică având de exemplu compoziţia peretelui celular, mai ales prezenţa, proporţia şi tipul peptidoglicanului; conţinutul în lipide şi calitatea acestora; secvenţa aminoacizilor din diferite proteine; echipamentul enzimatic; prezenţa şi tipul citocromilor; · Criteriul similitudinii caracterelor – cel mai frecvent folosit, printr-o conduită bazată pe un număr limitat de caractere dar care nu sunt egale pentru toate bacteriile, nici numeric nici calitativ. 2.1.2. Categorii de taxoni Luând ca bază specia bacteriană se descriu taxoni de rang superior şi taxoni de rang inferior. Taxoni de rang superior: · Regnul – procariota; · Diviziunea – care ţine seama de comportamentul faţă de lumină: photobacteria care grupează procariotele fototrope şi scotobacteria care grupează procariotele indiferente la lumină; · Clasa – care ţine seama de particularităţile morfologice: clasa Bacteria, Rickettsia, clasa Molicutes; · Familia – grupează bacteriile ce au anumite caractere generale şi se formează prin adăugarea sufixului „aceae”: ex. Enterobacteriaceae, Streptococaceae, Micrococcaceae; · Tribul – este un taxon utilizat mai rar şi se formează prin adăugarea „eae”. Ex: Escherichiae, Protaeae; · Genul – este un taxon frecvent utilizat şi include bacterii cu caractere asemănătoare morfologic, dar cu diferenţe biochimice şi se formează fără o anumită specificare. Ex. Salmonella, Brucella, Campylobacter; · Specia – este unitatea taxonomică de bază constituită dintr-un grup sau populaţii de tulpini care care au un set sau un anumit patern de proprietăţi comune stabile ce caracterizează grupul respectiv şi îl deosebesc de alte grupe de bacterii. Ea defineşte o anumită bacterie şi se denumeşte binar, în corelaţie cu numele genului (ex. Leptospira diflexa, Streptococcus aureus, Clostridium perfringens, etc.). Numele genului se scrie cu literă mare iar ale speciei cu literă mică. Taxoni de rang inferior: · Subspecia include grupuri de bacterii din cadrul speciei implicând diferenţe ale unor caractere, dar fără a depăşi limitele admise pentru specie (ex. Campylobacter fetus, subsp. fetus); · Varianta – sau tip se abate de la genotipul speciei pe baza unui singur caracter diferenţial sau a unui număr restrâns de caractere. În funcţie de caracterul modificat se deosebesc: 13


o Biovar – diferenţe de ordin biochimic; o Serovar – diferenţe de ordin antigenic; o Pathovar – diferenţe de ordin patogenic; o Morfovar – diferenţe de morfologie. Tulpina – reprezintă populaţia bacteriană izolată dintr-un aliment, având originea într-o singură populaţie. Tulpina bacteriană se notează fie cu numere, fie cu simboluri; Ea reprezintă de fapt populaţia microbiană manipulată de către microbiologi ce include un grup de indivizi cu unul sau mai multe caractere comune care le diferenţiază de alte populaţii din aceiaşi specie (caractere cu specificitate de tulpină. (Idomir) Tulpinile de referinţă sunt tulpinile bacteriene de interes cultivate în condiţii de standard cu caractere biologice studiate cu multă rigoare ştiinţifică, păstrate în colecţii, menţionate în cataloage şi publicaţii de specialitate şi livrate de institute recunoscute, cu rol important în special în verificarea selectivităţii şi specificităţii mediilor de cultură. Utilizarea periodică de materiale de referinţă certificate permit verificarea calităţii rezultatelor analizelor de laborator prin compararea caracterelor culturale ale tulpinilor de referinţă cu ale celor de cercetat. (să fotografiez nişte tulpini de refrinţă şi să iau din procedură) · Clasa – reprezintă populaţia descendentă dintr-un individ bacterian; · Izolat – cultură pură bacteriană neâncadrată taxonomic. Denumirea ştiinţifică este formată dintr-un substantiv din limba greacă sau latină ce denumeşte cel mai evident caracter al microorganismului, latinizat printr-un sufix care este – „ales” pentru ordin (ex. Enterobacteriales), „aceae” pentru familie (ex. Enterobaceriaceae) şi „um”, „a” sau „as” pentru gen (ex. Clostridium, Streptococcus, Leptospira, Pseudomonas). Denumirea speciei este formată din două cuvinte. Primul început cu o majusculă, reprezintă genul din care face parte bacteria, iar al doi-lea cuvânt scris cu litere mici denumeşte un caracter reprezentativ (ex. Staphylococcus aureus), indică boala pe care o determină (Micobacterium tuberculosis), regiunea din organism (Campylobacter jejuni) sau geografică unde a fost găsită (Lactobacillus bulgaricus, L.helveti). Când sunt descoperite specii microbiene noi, intervine un grup internaţional de specialişti care verifică dacă procedura standard de stabilire a denumirii a fost respectată şi dacă aceasta nu a mai fost utilizată anterior. În literatura de specialitate, după ce numele ştiinţific al speciei a fost scris odată complet, sunt admise prescurtări ale primului cuvânt care denumeşte genul (ex. C. perfringens). Dacă în practica diagnosticului de laborator nu se poate realiza identificarea până la nivel de specie, alături de numele genului se adaugă prescurtarea „sp” care înseamnă „specie neidentificată” (ex. Salmonella sp.)(Idomir) 2.2.

Caracterele

generale

ale bacteriilor 14


Bacteriile sunt microorganisme unicelulare asexuate de tip procariot (pro = înainte, karion=nucleu) ceea ce înseamnă că o singură celulă prezintă toate atributele speciei, neavând nevoie în realizarea funcţiilor vitale de concursul altor celule. Din punct de vedere morfologic, bacteriile au o structură de tip procariot, fiind alcătuite din perete celular, citoplasmă şi materie nucleară, caracterizate prin absenţa structurilor intracelulare delimitate prin membrane. La o celulă bacteriană se disting structuri esenţiale fiecărei celule: nucleu (materialul nuclear este reprezentat de acizi nucleici ADN şi ARN, concentrat într-un cromozom unic şi formaţiuni dispersate în citoplasmă numite plasmide), citoplasmă, membrană citoplasmatică, ceea ce formează protoplastul şi structuri neesenţiale pentru existenţa bacteriilor şi prezente numai la unele specii: capsula sau cel de-al treilea înveliş, cilii sau flagelii şi fimbriile sau pilii. (Fiţ) Bacteriile sunt lipsite de mitocondrii, aparat Golgi şi reticul endoplasmatic. Funcţiile acestor structuri caracteristice pentru celula eucariotă sunt suplinite în special de membrana citoplasmatică. (Turcu) Nutriţia este de tip absorbativ din punct de vedere al accesului substanţelor nutritive în celulă şi de tip fototrof şi chimioorganotrof sub aspectul asigurării energiei necesare proceselor nutritive. Bacteriile posedă echipament enzimatic propriu cu rol metabolizant, ce le permite să efectueze reacţii de degradare şi biosinteză, având astfel capacitatea de a se multiplica în medii inerte. Respiraţia se realizează prin reacţii de oxido – reducere şi poate fi aerobă (ce se desfăşoară în prezenţa O2), anaerobă (ce se desfăşoară în absenţa CO2) şi fermentativă. Multiplicarea se realizeză obişnuit asexuat, prin diviziune simplă sau sciziparitate. În anumite condiţii pot interveni unele procese sexuate prin schimb de material genetic. În natură bacteriile pot exista sub două forme biologice: · forma vegetativă – întâlnită la toate bacteriile şi care defineşte însuşirile unei bacterii; · forma sporulată – sporul este o a doua formă de existenţă întâlnită numai la unele specii şi este forma de rezistenţă care apare atunci când bacteria întâlneşte condiţii nefavorabile multiplicării. Sporul este întâlnit numai la unele bacterii, având rol de conservare a bacteriilor respective. Bacteriile au o răspândire ubicvitară; în contact cu organismele pot avea un efect benefic sau din contră un efect nefavorabil, fiind capabile să declanşeze boli uneori grave sau toxiinfecţii alimentare. 2.3. Morfologia bacteriilor 2.3.1. Dimensiunile bacteriilor Sunt variabile în raport cu genul sau specia, condiţiile de dezvoltare şi vârsta culturii. Ele se situează sub limita vizibilităţii cu ochiul liber (100µm) , şi din acest motiv 15


observarea lor se poate realiza numai cu ajutorul microscoapelor. Pentru a aprecia dimensiunile unei bacterii, se utilizează o diviziune a milimetrului şi anume micronul (µ) sau micrometrul (µm). 1µm =10-3mm. Dimensiunile bacteriilor se stabilesc cu ajutorul micrometrelor (ocular şi obiectiv) sau prin comparare cu elemente ce au dimensiuni cunoscute. Sub raportul dimensiunilor, bacteriile prezintă o mare variabilitate. În medie, bacteriile au dimensiuni cuprinse între 36µm lungime şi 0,5 - 1µm grosime. Faţă de aceste valori medii, există abateri destul de pronunţate mai ales în privinţa lungimii. Cele mai mici bacterii sunt micoplasmele şi ricketsiile. În general există o corelaţie directă între lungime şi grosime. Astfel speciile din genurile Bacillus şi Clostridium sunt cele mai lungi şi cele mai groase. Privite în ansamblul lor, putem observa o foarte largă varietate dimensională, dimensiuni care variază între cateva zecimi de micron și până la 10-15 microni (0.01 0.015 mm). Sub raportul dimensiunilor, bacteriile pot fi clasificate în 3 categorii: · bacterii de dimensiuni mici, sub 1 µm (ex. Streptococii, franciselele, micoplasmele, etc.); · bacterii de dimensiuni mijlocii de 1-3 µm, în care se încadrează cele mai multe bacterii (ex. Colibacilii, salmonelele, proteus, piocianeul, etc.); · bacterii de dimensiuni mari, peste 3 µm. Aceste bacterii sunt destul de numeroase, unele fiind chiar filamente de zeci de µm (ex. Clostridiile, leptospirele, spirochetele, etc.). Corespunzător dimensiunilor, volumul bacteriilor este foarte mare. Aceasta implică o mare suprafaţă de contact între celula bacteriană şi mediul exterior. Exemplu la Bacillus anthracis, care este o bacterie mare, volumul este de 1,5 µm iar la Francisella tularensis este de 0,004 µm. 2.3.2. Forma bacteriilor Bacteriile prezintă forme diverse, caracteristice genului sau speciei din care face parte. Acestea se datorează peretelui celular, o structură rigidă care rezistă la acţiunea forţelor de suprafaţă. (Idomir) Din această cauză bacteriile la care peretele celular lipeşte, prezintă un polimorfism accentuat, polimorfism care este relativ limitat şi caracterizat de cele mai multe ori prin predominenţa formei tipice pentru specia dată. Forma bacteriilor reprezintă criteriul taxonomic important, fiind recomandat ca aprecierea acestui caracter să se facă pe culturi tinere în faza de creştere activă, pe medii de cultură corespunzătoare şi în condiţii optime de temperatură, tensiune de oxigen, pH, etc. În culturi vechi apar celule cu forme aberante, cu polimorfism accentuat, ramificate, filamentoase, bombate care se observă şi în condiţiile cultivării pe medii improprii. Pe lângă modificările morfologice se modifică şi afinitatea tinctorială. Din punct de vedere morfologic, bacteriile pot avea următoarele forme:principale (ex. coci, bacili, etc), intermediare (ex. cocobacili ); asimetrice , deosebindu-se 6 mari categorii: sferice, cilindrice, cocobacilare, spiralate, filamentoase, pătrate. Forma este un criteriu foarte important de clasificare și identificare a bacteriilor, acesta variind în funcție de vârstă, factori ereditari specifici și mediul de cultură. 16


Principalele forme de observație a bacteriilor sunt: · bacteriile sferice (coci – de la grecescul kokkos = boabă) formă specifică cocilor, în cadrul careia se pot deosebi și mai multe varietăți: sferică, ovoidală, lanceolată, reniformă. Sunt apreciate ca bacterii izodiametrice, însă în rare cazuri ele sunt perfect rotunde. În funcţie de sfericitate se deosebesc următoarele aspecte: forma rotundă (ex. Staphilococcus aureus); forma ovoidală (ex. Streptococcus piogenes); forma lanceolată (ex. Streptococcus lanceolatum); forma renală sau reniformă (ex. Neisseria); · bacterii cilindrice sau alungite (bacili sau bastonaşe). La aceste bacterii raportul dintre cele două axe (longitudinal şi transversal) variază destul de mult, unele având un aspect cilindric bine defenit. După aspectul capetelor se disting bacterii cu capete drepte (ex. Bacillus anthracis) cu capete rotunjite (ex. B. Cereus, Escherichia coli) şi cu capetele ascuţite (Fusobacterium necrophorum, Fusiobacterium fusiforme). Marginile laterale ale celulei sunt de obicei paralele, dar pot fi apropriate la capete dând aspect de suveică sau se îndepărtează spre capete imprimând un aspect de pişcot sau măciucă (ex. Corynebacterium); · bacterii spiralate sau helicoidale - cu aspect de virgulă (vibrio - virgo), în forma literei S, sau de resort, cu spire neregulate sau regulate, au o formă alungită, dar prezintă diferite curburi, distigându-se următoarele forme: forma de virgulă, cu încurbare într-un singur plan (ex. Vibro spp.); formă de „S” cu o încurbare în două planuri (ex. Campylobacter, Acrobacter); formă spiralată rigidă cu spire strânse şi capete ascuţite (ex. Spirilium spp.); formă spiralată flexibilă (ex. Leptospira spp.); · bacteriile filamentoase – care ajung la zeci de microni lungime, fără prezența unor diviziuni transversale, sunt bacterii alungite având ca prototip actinomicetele care formează filamente lungi şi ramificate asemănătoare unor miceţi. Aspect filamentos apar şi la unele bacterii cilindrice, îndeosebi în condiţii de cultivare necorespunzătoare sau în infecţii cronice. În aceste cazuri bacteriile cresc în lungime, ajungând la câţiva zeci sau sute de microni, fără a se mai diviza transversal (ex. bacteriile din genul Actynomyces); · bacterii cocobacilare (cocobacili) - sunt bacterii uşor alungite, intermediare ca formă între coci şi bacili, numeroase bacterii se pot prezenta sub această formă (ex. Brucella.); · bacterii pătrate – este o formă mai recent semnalată. Au forma unor pătrate cu latura de 1,5 – 11 µm şi o grosime inegală. Ele au fost încadrate în genul Quadra aparţinând probabil grupului Archebacteria. (Internet) Există deasemenea pe lângă aceste forme principale de observație și forme specifice și anume: · pedunculate · filamentoase neramificate 17


· ·

filamentoase pseudoramificate filamentoase ramificate Average_prokaryote_cell_ro.jpg

2.3.3.Gruparea bacteriilor Gruparea bacteriană Există unele specii de bacterii care au în mod constant un anumit mod de grupare care uneori reprezintă un criteriu foarte util pentru identificarea lor. Modul de grupare este determinat de regulă, de nedeslipirea celulelor după multiplicarea lor prin diviziune directă. După multiplicarea bacteriilor, cele mai multe dintre ele se separă complet rezultând indivizi izolaţi. La alte specii după diviziune, celulele fie rămân ataşate una de alta formând grupări caracteristice ce au o mare valoare taxonomică. Rareori toate celulele speciei sunt grupate însă tipic, caracteristic fiind modul de grupare dominant. Principalele moduri de grupare întâlnite la bacterii sunt: Moduri de grupare la bacteriile rotunde În funcţie de poziţia celulelor fiice după diviziune, cocii prezintă următoarele 6 tipuri de grupare: · Coc simplu sau izolat - la care celulele fiice rezultate din diviziune rămân independente; · Diplococi – în care celulele sunt aşezate câte două: diplococ (2 coci); diplobacili (2 bacili), la care celulele fiice rezultate rămân grupate câte două (ex. Diplococcus pneumoniae); este întâlnită atat la coci cât și la bacili, în care grupa este formată din două elemente (ex. Diplococcus pneumoniae, Neiseria gonorhoeae); · Streptococi – formațiune rezultată din gruparea în lanț a cocilor și bacililor: streptococ (lanţ format din coci), streptobacil (lanţ format din bacili), este gruparea în lanţ a celulelor cu aspect de şirag de mărgele (ex. S. pyogenes, S. agalactiae, S. lactis, S. temaris, S. citravorus, S. paracetivorus, S. pzogenes – patogen); · Tetracocul sau tetrada – 4 coci aşezaţi sub forma a doi diplococi alăturaţi, ce se formează ca urmare a unor diviziuni perpendiculare unele pe altele, rezultând formaţiuni a câte 4 elemente (ex. Micrococcus tetragenes, Gafkia tetragena); · Sarcina – la care planurile de diviziune sunt orientate în 3 direcţii diferite, perpendiculare unul pe altul (al doi-lea pe primul şi al trei-lea pe primele două), rezultând o grupare cu aspect de cub sau pachete de 4-8-16 elemente sau mai multe (ex. Sarcina flava, S. Aurantica, S. lutea); · Stfilococii – la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse în câteva direcţii, iar celulele rezultate se aranjează în grupări neregulate, ca boabele unui ciorchine de strugure.Este caracteristică cocilor, în care bacteriile sunt grămezi neregulate sub forma unui ciorchine de strugure (ex. Staphylococccus aureus, Staphylococcus albus, Staphylococcus citrinus, St. hycus) După Prévat, la bacteriile sferice, gruparea s-ar datora unei substanţe vâscoase gumoase, sintetizată de celule bacteriană şi dispusă pericelular, fie difuz pe toată suprafaţa celulei, fie localizat în anumite regiuni determinând diferite tipuri de 18


polarizare a celulelor care imprimă modul de grupare: ü Radiară simplă la diplocococ; ü Diametrală simplă la streptococ; ü Biradiară la tetracoc; ü Bidiametrală la sarcina; ü Circumferenţială la stafilococ. Moduri de grupare la bacteriile bacilare cilindrice Bacilii după diviziune pot să se prezinte sub următoarele aspecte: ü Bacili izolaţi – aspect observat la numeroase specii cilindrice (ex. E. Coli, Salmonella, Proteus, etc.); ü Diplobacili – grupare formată din două elemnete cap la cap sau V (ex. Listeria monocytogenes); ü Streptobacilii – grupare formată din mai multe elemente aşezate cap la cap, alcătuind un lanţ de lungimi variabile (ex. Bacillus anthracis, etc.); ü Palisada – grupare dată de aşezarea celulelor în paralel, una lângă alta în sensul axului lor lung, asemănător scândurilor dintr-un gard sau dinţilor unui pieptene. (ex. Corynebacterium pyogenes); ü Litere chinezeşti – grupare neregulată a bacililor. Alte moduri de grupare ü Gruparea în stea sau rozetă întâlnită la actinomicete (ex. Actynomices lignieresi); ü Gruparea cu aspect de mărci poştale – întâlnită la bacteriile pătrate care uneori formază placarde de 8 – 16 pătrate, fiind asemănătoare cu mărcile poştale; ü Trihomul – este o grupare de celule sub forma unui filament multicelular, rezultat din diviziune în care celulele adiacente sunt menţinute într-un înveliş parietal comun.

19


CURS nr. 3 STRUCTURA CELULEI BACTERIENE – CONSTITUENŢI INTRAPARIETALI 3.1.

Structura celulei bacteriene

Constituenţii celulei bacteriene pot fi grupaţi în două categorii: A. Constituenţi intraparietali: peretele celular; membrana citoplasmatică; nucleoidul şi plasmidele; mezozomii; incluziile; vacuolele B. Constituenţi extraparietali: capsula; stratul mucos; glicocalixul; spinii; flagelii (cilii); imbriile (pilii) (Foto nr.....Average_prokaryote_cell_ro.jpg)

3.2. Constituenţi intraparietali 3.2.1. Peretele celular Compoziţia peretelui celular diferă de la o celulă la alta, constituind un factor important în analiza şi diferenţierea celulelor bacteriene. Astfel, în 1884, Hans Christian Gram, un fizician danez, a realizat o metodă de a diferenţia structurile peretelui celular. Peretele celular gram pozitiv se colorează in violet prin tehnica Gram. Este gros, dar 20


simplu structurat, unitatea de bază fiind peptidoglicanul, format din unităţi repetitive. Mureina este structura rezultată din unităţile de peptidoglicani cu ajutorul unei enzime: transpeptida. Are rolul de a menţine forma bacteriei (la presiuni de 2-2,5 atmosfere) în cazul în care bacteria îşi pierde peretele sub acţiunea penicilinei. Sferoplastul (cu urme de perete celular) şi protoplastul (fără perete celular) sunt fragili, uşor de atacat de fagocite sau sub acţiunea variaţiei presiunii osmotice. Delimitează celula bacteriană, fiind bine definit structural şi cu o consistenţă rigidă. Peretele celular bacterian de asemenea menţine integritatea celulară. Acesta este atât de puternic, încât împiedică celula bacteriană să explodeze, atunci când presiunea osmotică dintre citoplasmă şi mediu este prea mare. El a fost pus în evidenţă încă din anul 1872 de către Conn. Evidenţierea lui este posibilă numai la microscopul electronic. La celulele tinere, peretele celular aderă intim la membrana citoplasmatică, pe când la celulele bătrâne el este depărtat de citoplasmă. Examinat la microscopul electronic are aspectul unei sac gol care conservă forma bacteriei, având o constituţie asemănătoare cu a unei plase formată din fascicule de fibre paralele cu dispunere în planuri diferite care se încrucişează. Grosimea peretelui celular este variabilă fiind în general cuprinsă între 10 – 35 nm, rareori ajungând la 80 nm (ex. Lactobacillus acidophylus). În funcţie de structură şi compoziţia chimică, pereţii celulari ai bacteriilor se colorează diferenţiat şi se clasifică în 3 grupe principale: Gram pozitive; Gram negative şi acidorezistente. Constituentul comun al peretelui celular la toate tipurile de bacterii este peptidoglicanul sau mureina. Are rolul de a menţine forma bacteriei (la presiuni de 2-2,5 atmosfere) in cazul in care bacteria işi pierde peretele sub acţiunea penicilinei. Există diferenţe privind cantitatea şi aranjamentul structural al proteinelor, polizaharidelor şi glucidelor. Compoziţia peretelui celular diferă de la o celulă la alta, alcătuind un factor important în analiza şi diferenţierea celulelor bacteriene. Astfel, în 1884, Hans Christian Gram, un fizician danez, a realizat o metodă de a diferenţia structurile peretelui celular. Structura peretelui celular determină afinitatea faţă de coloranţi, ceeace a permis clasificarea bacteriilor în Gram pozitive şi Gram negative, prin utilizarea coloraţiei diferenţiale Gram (Idomir) Peretele celular la bacteriile Gram pozitive are ca componentă majoră peptidoglicanul (80 – 90% din greutatea uscată). El mai conţine proteine şi polizaharide care includ acizi tecoici, teichuronici, acizi neteichoici şi polizaharide neutre. Peptidoglicanul (mureina, glicopeptid, mucopeptid, glucozamino –peptid, mucocomplex) este un heteropolimer compus dintr-o proteină glicanică şi o componentă peptidică. El poate fi atacat de lizozim şi de penicilină. Porţiunea glicanică are structura unor lanţuri lineare formate din Nacetilhexozamine diferite şi anume N – acetillgluczamina şi acidul N – acetil muramic legate între ele prin legături glicozidice. Componenta peptidică conţine ca unitate de construcţie un tetrapeptid. Unităţile tetrapeptidice aparţinând lanţurilor de glican adiacente sunt la rândul lor legate prin intermediul unor „punţi” specializate interpeptidice. 21


Acizii teichoici (teichos – zid, perete) sunt prezenţi numai la bacteriile Gram pozitive, fiind nişte molecule polimere lungi şi flexibile formate din ribitol – fosfat, localizate exclusiv în peretele celular, membrana plasmatică şi structurile capsulare ale bacteriilor. Ei conferă bacteriilor Gram pozitive o serie de proprietăţi importante: au rol esenţial în menţinerea unei concentraţii de ioni metalici, îndeosebi Mg2+; au rol arhitectural contribuind la menţinerea structurii tridimensionale a peptidoglicanului; joacă rol important în patogenitatea unor bacterii contribuind la inhibarea fagocitozei. Peretele celular la bacteriile Gram negative – este mai subţire, are o structură mai complexă şi este distinct stratificat. De la exterior spre interior peretele celular este alcătuit din următoarele componente: · Membrana externă – pe secţiune apare triplu stratificată. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi lipopolizaharide. Are proprietăţi antigenice şi activitate endotoxică; · Stratul de peptidoglican – este electronodens şi are grosimea de 1,5 – 3 nm. Din punct de vedere chimic conţine acid A – acetilmuramic, N – acetilglucozamină, diaminopimelat, alanină şi acid glutamic; · Stratul periplasmatic – constituie sediul de depozitare a unui număr mare de enzime şi pigmenţi. Pe secţiuni fine apare ca o zonă cu densitate electronooptică redusă, cu o lărgime variabilă depinzând de starea fiziologică a celulei şi condiţiile de cultivare. Peretele celular la bacteriile acido – rezistente – etse prezent la micobacterii care au un conţinut ridicat de lipide (20 – 45%) din greutatea uscată a celulei. Conţinutul în lipide este direct proporţional cu gradul de patogenitate al micobacteriilor, fiind cel mai ridicat la M. Tuberculosis, M bovis şi cel mai scăzut la micobacteriile cu creştere rapidă (M. phley). Lipidele micobacteriene explică proprietăţile tinctoriale (acido – alcoolo – rezistenţa) cât şi rezistenţa în mediul exterior. Cele mai importante componente lipidice sunt: fosfolipidele, acizii micolinici, micozidele şi ceara D. Rolul peretelui celular · reprezintă sistemul de susţinere mecanică al întregii arhitecturi celulare. · datorită rigidităţii sale determină forma caracteristică celulelor; · participă la procesul de creştere şi diviziune urmând membrana citoplasmatică în formarea straturilor de diviziune; · asigură protecţia faţă de şocul osmic. Presiunea osmotică internă este de aproximativ 5-6 atm la E.coli şi 20 . 30 atm la Staphylococcus aureus. Fără prezenţa peretelui celular membrana plasmatică nu ar rezista acestei presiuni; · unii constituenţi parietali joacă rol de receptori pentru bacteriofagi; · are rol în reglarea traficului molecular, acţionând ca o sită moleculară şi asigurând trecerea substanţelor nutritive, împiedicând în acelaşi timp pătrunderea unor substanţe nocive sau pierderea unor metaboliţi necesari; 22


· etc. 3.2.2. Membrana citoplasmatică Acoperă de jur împrejur citoplasma bacteriană, separând-o de peretele celular. Membrana citoplasmatică este strâns lipită de peretele celular, datorită diferenţei de presiune osmotică între conţinutul celular şi mediul extern. La microscopul electronic, membrana citoplasmatică apare ca o formaţiune triplu stratificată cu o grosime de 7,5 – 10 nm, alcătuită din două straturi întunecate între care se află un strat clar. Membrana citoplasmatică este o membrană semipermeabilă cu rol de barieră enzimatică care reglează schimburile care au loc între celula bacteriană şi mediul extern, interacţionând selectiv cu mediul înconjurător. Schimbul cu mediul se realizează atât prin procese active specifice, cât şi prin procese de difuziune pasivă. Este sediul enzimelor implicate în metabolismul respirator şi biosinteza tuturor componentelor majore ale peretelui celular. Participă direct la creşterea şi diviziunea celulei, la formarea septului de diviziune şi la formarea sporului. 3.3.3. Citoplasma Reprezintă un sistem coloidal alcătuit din aproximativ 80% apă în care se găsesc o cantitate mare de molecule organice mici, ioni anorganici, enzime ARN. Aspectul citoplasmei este variabil în funcţie de vârsta culturii şi de condiţiile de mediu. La celulele tinere şi în condiţii normale de dezvoltare, citoplasma aderă la peretele celular şi se prezintă ca o masă densă, omogenă şi intens colorabilă. La celulele bătrâne, citoplasma îşi pierde treptat afinitatea tinctorială, se retractă centripet, îndepărtându-se de perete şi capătă o structură granulară. În masa citoplasmei se găsesc dispersate o serie de formaţiuni: ribozomii, vacuolele gazoase, granule, incluziile şi plasmidele. 3.3.4. Ribozomii – constituie principalele elemente ale citoplasmei şi reprezintă 40% din greutatea uscată a celulei, conferindu-i un aspect granular fin, omogen. Ribozomii sunt structuri relativ sferice cu diametrul de aproximativ 1,80 nm şi o constatntă de sedimentare de 70S. Din punct de vedere chimic sunt constituiţi din 6570% acizi ribonucleici (ARNr) şi 30 – 50% proteine. La nivelul ribozomilor se realizează biosinteza proteinelor de structură şi a proteinelor enzimatice. 3.3.5. Incluziile şi granulaţiile citoplasmatice – sunt formaţiuni structurale de dimensiuni şi forme diferite care variază cantitativ în funcţie de condiţiile de mediu. În funcţie de compoziţia lor chimică se deosebesc: · incluzii de glicogen şi amidon, se colorează cu iod în galben – brun (glicogenul) şi în albastru (amidonul). Apar fie dispersate în citoplasmă, fie sub formă de depozite electronooptice dense; · incluzii de polifosfaţi anorganici numite şi granule de volutină sau corpusculi Babeş – Ernst. Apar sub forma unor depozite sferice, elecronooptic dense de dimensiuni variabile; · granulaţiile de sulf, apar sub forma unor structuri globulare cu membrană de înveliş. Sunt prezente la bacteriile sulfuroase crescute într-un mediu bogat în H2S; · cristale şi structuri paracristaline, apar la unele 23


specii sporulate din genurile Bacillus şi Clostridium. Se evidenţiază sub forma unor cristale parasporale cu structură ordonată şi reprezintă un surplus de proteine al învelişului sporal; · vacuole gazoase, apar la mai multe bacterii acvatice cum ar fi cianobacterii, bacterii fotosintetizante, bacterii sulfuroase. Funcţia lor nu este bine cunoscută, dar se pare că au un rol în capacitatea de plutire, în protejarea faţă de lumina puternică. Unii cercetători apreciază că vacuolele ar îndeplini rolul de regulatori ai presiunii osmotice în raport cu mediul extern. 3.3.6. Materialul nuclear Numit şi corp nuclear sau nucleoid, materialul nuclear la bacterii are o organizare primitivă în sensul că nu este delimitat printr-o membrană nucleară şi nu prezintă nucleoli, organizare care reprezintă principala caracteristică structurală a celulelor procariote. Corpul nuclear al bacteriilor apare localizat în mod obişnuit în partea centrală a celulei, constituind o zonă de dimensiuni şi forme variabile, cu densitate electronooptică mai scăzută decât citoplasma. El poate fi într-o legătură cu membrana citoplasmatică prin intermediul a 1 – 2 mezozomi. Deşi materialul nuclear nu este mărginit de membrană nucleară, el este destul de compact, fiind bine delimitat de citoplasmă. Mărimea şi forma nucleului bacterian variază foarte mult în funcţie de natura mediului de cultură şi a condiţiilor de mediu. Cromozomul bacterian este o moleculă de ADN dublu catenară, circulară închisă cu dimensiuni variabile de la o specie la alta. Din punct de vedere chimic, nucleoidul bacterian este un complex ADN – ARN – proteine, în care ADN –ul reprezintă aproximativ 80% iar componenta proteică aproximativ 10%. ARN –ul care reprezintă de asemenea aproximativ 10% este format din ARNr şi ARNm în curs de formare. În celulă cromozomul bacterian este împachetat probabil sub forma unor bucle super înfăşurate. Nu se cunoaşte mecanismul molecular prin care cromozomul bacterian mai lung de 400 – 1000 de ori decât dimensiunea lineară a celulei bacteriene este împachetat într-un volum atât de mic. Din punct de vedere chimic, ADN –ul bacterian este constituit din: · baze azotate purinice A şi G; · baze azotate pirimidinice C şi T · dezoxiriboză (zahăr); · acid fosforic. Baza azotată purinică + pirimidinică + dezoxiriboză + radicalul fosforic, alcătuiesc o nucleotidă. Din înlănţuirea acestora rezultă un lanţ polinucleotidic sau o catenă. Structura dublu helicoidală a ADN –ului se realizează prin înfăşurarea a două lanţuri polinucleotidice orientate cu bazele spre interiorul structurii, astfel încât faţă în faţă se găsesc întotdeauna A cu T, fie G cu C. Legătura între baze se realizează prin legături de H care sunt duble între A = T şi între C=C. Rolul nucleoidului bacterian - în cromozomul bacterian se găseşte informaţia genetică necesară autoreplicării, precum şi pentru organizarea structurală şi 24


funcţională a celulei bacteriene. Înregistrarea informaţiei genetice în cromozomul bacterian se realizează sub forma unor lanţuri de nucleotide dispuse într-o anumită secvenţă. Constituirea unor formaţiuni structurale (capsula, cili, spori) ca şi elementele de patogenitate sunt determinate genetic, prin acţionarea asupra materialului nuclear cu diferiţi factori mutageni se pot obţine mutante apatogene folosite la prepararea vacinurilor. 3.3.7. Plasmidele Sunt elemente genetice separate de cromozomul bacterian, capabile de replicare independentă. Ele conţin informaţie genetică cu rol esenţial pentru creşterea bacteriilor. Până în prezent au fost izolate şi identificate peste 1000 tipuri diferite de plasmide, cele mai numeroase la bacteriile Gram negative. Numai la E. coli au fost identificate 269 de plasmide diferite. În funcţie de relaţia lor cu cromozomul bacterian se clasifică în două categorii: · Plasmide integrate în cromozomul bacterian care sunt supuse controlului riguros exercitat de cromozom, ele repicându-se odată cu acesta; · Plasmide neintegrate (libere) care sunt fizic independente de cromozom, această categorie se subdivide la rândul lor în două subgrupe: plasmide mari a căror replicare este cuplată cu cromozomul bacterian, fiind supuse unui control riguros, ele sunt menţinute într-un număr limitat de copii de 13/cromozom şi au rol în procesele de conjugare; plasmide mici, care se găsesc în număr mare, nefiind supuse unui control riguros al replicării şi nu intervin în procesele de conjugare. Se apreciază că prezenţa plasmidelor este benefică pentru bacteriile purtătoare, impunând acestora unele avantaje biologice şi metabolice, o mai bună capacitate de adaptare şi de rezistenţă la condiţiile diverse de mediu. Importanţa lor este amplificată şi de capacitatea unora dintre ele de a fi transmise de la o celulă la alta putând duce la pierderea sau câştigarea unor caractere. Plasmidele contribuie la conferirea rezistenţei multiple la acţiunea antibioticelor, fie mărindu-le virulenţa şi patogenitatea prin introducerea unor determinanţi genetici de virulenţă sau toxinogeneză (ex. plasmida Ent pentru eneterotoxină şi Hly pentru hemolizină la E. coli), la mărirea rezistenţei la radiaţiile UV, la formarea vacuolelor gazoase, etc. Plasmidele pot păstra informaţia genetică adiţională. Informaţia păstrată de acestea nu este vitală, însă poate oferi avantaje selective în anumite circumstanţe. De ex: unele plasmide pot codifica anumite toxine, iar alte plasmide pot păstra informaţie genetică împotriva antibioticelor. 3.3.8. Mezozomii Sunt structuri membranoase care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice; Ei sunt prezenţi la bacteriile Gram pozitive şi numai ocazional la bacteriile Gram negative. Aparent par a fi formaţiuni citoplasmatice dar în realitate prin modul de formare şi legătura continuă cu spaţiul periplasmatic, ei pot fi consideraţi ca formaţiuni extracitoplasmatice. După formă au fost descrise 3 tipuri: 25


· lamelari; · veziculari; · tubulari. După localizare se clasifică în: · septali; · periferici; · nucleari. Rolul mezozomilor – fiind legaţi atât de membrana citoplasmatică, cât şi de materialul nuclear, au un rol important în controlul replicării cromozomului şi plasmidelor prin transmiterea semnalului biochimic care ia naştere la suprafaţa celulei. Ei participă la reacţiile de fosforilare, oxidoreducere şi transport de electroni, cu o pondere mai redusă decât în membrana citoplasmatică. Au rol de asemenea în unele procese secretorii de ex. în producerea şi eliberarea unoe exoenzime ca penicilinaza.

26


CURS nr. 4 STRUCTURA CELULEI BACTERIENE – CONSTITUENŢI EXTRAPARIETALI 4.1. Constituenţi extraparietali Din această categorie fac parte o serie de formaţiuni care se constituie la exteriorul peretelui celular. Unele sunt prezente la toate bacteriile, pe când altele sunt prezenmte numai la anumite bacterii. 4.1.1. Capsula şi stratul mucos Capsula este o formaţiune prezentă numai la anumite bacterii, (uneori la cele care au o virulenţă mai mare – ex. unele tulpini de streptococi şi stafilococi) şi de cele mai multe ori constituită dintr-un material macromolecular, cu caracter vâscos – gelatinos. În funcţie de consistenţa şi capacitatea de includere a unor particule fine, capsula poate fi: rigidă – capsulă compactă care nu include particule fine ca tuşul de China; felexibilă – capsula mucoidă, deformabilă, capabilă să includă astfel de particule. În funcţie de grosime şi raporturile sale cu celula baceriană se descriu următoarele tipuri de capsulă sau material capsular: · microcapsula – cu o grosime de sub 0,2 µm, la care substanţa mucoidă alcătuieşte un strat foarte fin în jurul celulei bacteriene. Microcapsula se găseşte la unele bacterii Gram negative (ex. Pasteurella multocida); · macrocapsula – sau capsula propriu – zisă se prezintă ca o formaţiune morfologic distinctă care înveleşte de jur împrejur fiecare celulă sau perechi de celule. Are o grosime mai mare de 0,2 µm, şi se poate evidenţia prin diferite tipuri de colorare devenind vizibilă la microscopul fotonic (ex. Bacillus antrhacis, Klebsiella pneumoniae, Diplococcus pneumoniae, etc.). Stratul mucos apare ca o masă amorfă neorganizată ale cărei componente vâscoase se dispun fără o anumită ordine în jurul celulei bacteriene sau difuzează în mediu, imprâmând mediilor un anumit grad de vâscozitate (ex. Francisella tularensis, Pseudomonas aeuginosa, Mixobacteriile, etc.). Zoogleea sau masa zoogleică defineşte formaţiunea capsulară în care stratul mucos include mai multe celule alcătuind adevărate colonii mucilaginoase. În mediile lichide se formează flacoane microscopice care plutesc libere sau se fixează de pereţii tuburilor (la bacteriile saprofite). Din punct de vedere chimic, capsula este constituită din apă în procent de 99%, iar restul de substanţe de altă natură (ex. polizaharide, polipeptide, etc.). Evidenţierea capsulei se poate face prin tehnici de colorare ex. Coloraţia Giemsa, colorare indirectă cu tuş de China 27


Prezenţa stratului mucos şi a capsulei dă culturilor pe medii lichide un caracter vâscos, siropos datorită difuzării în mediu a unora dintre substanţele capsulare. Coloniile de pe medii solide au un aspect umed, lucios, mucoid şi au o consistenţă mucoasă. Rolul capsulei – este esenţială în supravieţuirea bacteriilor, reuşind să anihilize factorii umorali şi celulari de rezistenţă a organismului. Bacteriile care se încapsulează sunt protejate faţă de acţiunea fagocitelor, fie indirect împiedicând adeziunea la suprafaţa leucocitului, fie împiedicând afluirea fagocitelor. Datorită acestui fapt, bacteriile patogene se pot multiplica nestingherit, fiind capabile să producă starea de boală. 4.1.2. Cilii sau flagelii Sunt structuri filamentoase, flexibile, fragile, subţiri 0,01 – 0,02µm cu o lungime variabilă ce poate ajunge la 80 µm. Numărul şi dispoziţia cililor pe suprafaţa bacteriei sunt caractere de specie reglate genetic. În funcţie de acste caractere, bacteriile se clasifică în: · atriche – lipsite de cili; · monotriche – care au un singur cil dispus polar (ex. Vibrio); · amfitriche – care au câte un cil la fiecare pol; · lopotriche – care au un smoc de cili la unul sau ambele capete ale bacteriei; · peritriche – care au cilii dispuşi pe toată suprafaţa celulei (ex. Cl. Tetani, Proteus vulgaris). Cercetarea structurii cililor la microscopul electronic a evidenţiat alcătuirea lor în trei componente morfologic distincte şi anume: · Corpusculul bazal – reprezintă componenta prin care acesta se ataşează la corpul celulei bacteriene. Corpusculul este format din patru discurin dispuse paralel notate M (membrana citoplasmatică), S (spaţiul periplasmatic supramembranos), P (strat de peptidoglican), L (strat lipopolizaharidic din membrana externă), în acord cu presupusa lor ataşare de unul din componentele peretelui celular. În acest fel corpusculul bazal reprezintă o componentă structurală complexă, montată în întregime în peretele celular şi membrana citoplasmatică. · Cârligul – reprezintă o structură care este situată în afara corpului celulei bacteriene şi are o formă mai mult sau mai puţin îndoită. Structural este format din subunităţi de 30 – 40 Å, dispuse într-un aranjament helical. Această formaţiune se observă uşor la Bacillus brevis, Bcillus. Circulans. · Filamentul flagelar – reprezintă partea flexibilă care se leagă de cpătul distal al cârligului. Filamentul, în mediile lichide este bine dezvoltat depăşind de câteva ori lungimea corpului bacteriei şi de regulă sunt răsuciţi. Este destul de fragil şi se rupe cu uşurinţă. Evidenţierea cililor se poate face prin tehnici speciale de colorare, de mordansare cu tanin sau impregnare cu azotat de argint cu scopul de ale mări grosimea şi de a deveni astfel vizibili la microscopul optic obişnuit. În mod indirect, prezenţa cililor se deduce examinând mobilitatea bacteriilor. O evidenţiere bună se face la microscopul electronic. 28


Din punct de vedere chimic toate componentele cililor sunt de natură proteică cu importante proprietăţi antigenice, aşa numitele antigene flagelare notate cu H, numite şi flageline. Atât filamentul flagelar cât şi cârligul sunt alcătuite fiecare în parte din câte un singur fel de molecule proteice care sunt capabile de autoasamblare. Corpusculul bazal este alcătuit din mai multe tipuri de molecule proteice. Proteinele care constituie cilii bacterieni prezintă un mare polimorfism, greutăţile moleculare variind între 33.000 şi 66.000. Polimorfismul flagelinei poate apare chiar la aceeaşi celulă bacteriană. Moleculele de flagelină care alcătuiesc filamentul flagelar se autoasamblează formând structuri tubulare cu simetrie pronunţată. Studiile de microscopie electronică au evidenţiat că aranjarea subunităţilor proteice în cadrul structurilor tubulare se realizează în formă de spirală de-a lungul filamentelor. Iniţierea procesului de autoasamblare are loc la capătul distalal cârligului, acesta sevind ca nucleu pentru polimerizarea monomerilor de flagelină. Creşterea în lungime a filamentului se realizează în continuare prin adiţionări şi polimerizări a monomerilor de flagelină. Rolul cililor – cilii au rol de organite locomotoare, aceasta realizându-se printr-o mişcare de rotaţie a filamentului flagelar. Această mişcare de rotaţie este asemănătoare unei înşurubări în mediu. Motorul rotaţiei cililor este reprezentat de corpusculul bazal, iar energia necesară este furnizată de ATP. La bacteriile peritriche, rotaţia se poate face în sens orar (în sensul acelor de ceasornic) asigurând rostogolirea şi schimbarea de sens sau se poate face antiorar când se asigură deplasarea în linie dreaptă. În cazul bacteriilr monotriche, deplasările în linie dreaptă sunt întretăiate de scurte mişcări de recul. Cilii pot fi separaţi de bcterii. Inoculaţi la animale, acestea vor sintetiza anticorpi specifici, cu aplicaţii de o importanţă deosebită în identificarea serologică a bacteriilor. 4.1.3. Pilii şi fimbriile Sunt apendici filamentoşi, neflagelari prezenţi în număr mare pe suprafaţa multor bacterii. Ei au fost descrişi mai mult la bacteriile Gram negative: E. coli, Pseudomonas, etc, şi mai rar la bacteriile Gram pozitive. Corynebcaterium, Streptococcus. Pilii sunt prea subţiri pentru a putea fi observaţi direct la microscoapele optice, dar ei pot fi văzuţi la microscopul electronic. Pilii au o structură mai rigidă comparativ cu cilii, sunt drepţi, mult mai scurţi şi mai numeroşi. Ei au o dispunere peritrichă. Dimensiunile pililor sunt variabile de la 0,2 - 20 µm. Originea lor este la nivelul membranei citoplasmatice, dar spre deosebire de cili nu posedă un aparat corespunzător corpusculului bazal. În funcţie de caracterele morfologice, de numărul şi funcţia biologică pe care o îndeplinesc, se deosebesc 6 tipuri de pili, notate I, II, III, IV, comuni şi F. În ultimii ani există tendinţa de a departaja din punct de vedere semantic termenul de fimbii de cel de pili. Tipurile I – IV grupează fimbriile iar tipul F grupează pilii. Pilii de conjugare F (de sex) sunt codificaţi de plasmide transmisibile şi sunt implicaţi în conjugarea bacteriilor, ei reprezintă calea efectivă de transfer a cromozomului bacterian în conjugare, funcţionând în acelaşi timp şi ca receptori specifici sau 29


fag. Ei se află în număr de 1 – 10 pe suprafaţa celulei bacteriene. Pilii comuni sunt determinaţi de gene cromozomale, sunt în număr mare ajungând la ordinul sutelor pentru o bacterie, au rol îndeosebi în aderarea bacteriilor la suprafaţa celulelor. Din punct de vedere chimic, pilii / fimbriile au o structură proteică. Pilii de tip I –IV (fimbriile) sunt constituiţi din subunităţi proteice (molecule de fimbrilină) cu masa moleculară de 16.000 daltoni, cu aranjare helicoidală, delimitând la interior o formaţiune tubulară. Pilii sexuali F sunt alcătuiţi dintr-o fosfoglicoproteină numită pilină cu masa moleculară de 11.800 de daltoni. Natura proteică a pililor şi fimbriilor le conferă proprietăţi antigenice diferite de cele flagelare. Pilii dacă sunt îndepărtaţi mecanic, se refac cu uşurinţă. Funcţiile pililor · Atât pilii de conjugare cât şi fimbriile comune conţin receptori pentru bacteriofagi; · Pilii de conjugare acţionează ca nişte cârlige retractile care aduc bacteriile ce se conjugă (donatoare şi receptoare) în contact celular fiind implicaţi în transferul propriu – zis de material genetic; · Fimbriile mediază aderenţa bacteriilor la suprafaţa celulelor epiteliale favorizând colonizarea; · Pilii se întrepătrund unii cu alţii ducând la formarea unor pelicule la suprafaţa mediilor lichide, favorizând în natură creşterea bacteriilor saprofite în apele stagnante, slab oxigenizate în profunzime; · Au activitate aglutinantă în contact cu globulele roşii de la anumite specii de animale. Pe această bază tulpinile de E. coli se împart în mai multe grupe. 4.1.4. Spinii Sau spiculele bacteriene sunt apendici pericelulari, rigizi, tubulari, prezenţi la anumite bacterii Gram negative. Numărul este variabil de la 1 – 15 pe celulă, distribuiţi aparent la întâmplare. La microscopul electronic în preparate apar de formă dreaptă perpendiculari pe supafaţa bacteriilor. Spinii sunt alcătuiţi dintr-un filament cu structură tubulară cu diametrul de 65 nm şi o lungime de 1 - 3µm. Spinii sunt legaţi de suprafaţa membranei externe a peretelui celular cu aspect conic la locul de legare. Ei pot fi uşor deteşaţi prin tratare cu proteaze sau prin agitare. Semnificaţia biologică a spinilor nu se cunoaşte. 4.1.5. Glicocalixul Este alcătuit dintr-o masă de filamente polizaharidice ataşate de lipopolizaharide de suprafaţa celulelor, formând în ansamblu o structură ca o pâslă pe suprafaţa celulei şi asigurând fixarea fermă şi adesea specifică a acesteia de alte celule sau suporturi neanimate. Glicocalixul este absent în culturile pure de laborator. Se formează numai la celulele aflate în condiţii naturale care apar la microscopul electronic înconjurate de o reţea de fibre ce aderă unele de altele şi de alte celule sau suprafeţe inerte. 30


Funcţiile glicocalixului - prezenţa lui la bacteriile patogene le conferă acestora o serie de proprietăţi cum ar fi: · Capabilitate de aderare la celule; · Menţinere în mediile naturale; · Rezistenţă mărită la îndepărtare sub acţiunea cauzelor mecanice; · Rezistenţă mărită în concurenţă cu bacteriile antagonice; · Rezistenţă la atacul bacteriofagilor · Împiedică fagocitoza · Rezistenţă la acţiunea factorilor protectori di organismul afectat 4.1.6. Sporul bacterian Reprezintă o formă primitivă de diferenţiere celulară care constă în formarea în celula vegetativă a unui nou tip de celulă, diferenţiată ultrastructural, chimic şi enzimatic de celula formatoare. Sporul tipic bacterian numit şi endospor, este o formaţiune sferică sau ovalară refringentă, cu dimensiuni variabile după specie, iar în cadrul aceleaşi specii, în funcţie de vârsta culturii şi condiţiile de mediu. În medie are dimensiuni de 0,5/ 0,9 -1,5µm. Sporul bacterian este în marea majoritate a cazurilor unic într-o bacterie. Excepţional s-au descris 2 sau mai mulţi spori. Sporulează mai frecvent bacteriile Gram pozitive (ex. genul Bacillus şi Clostridium) şi unele bacterii din genul Sarcina. Morfogeneza sporului – în procesul de formare se disting trei stadii: · Stadiul preparativ – caracterizat prin detaşarea unui segment din cromozomul bacterian şi condensarea citoplasmei în jurul său; · Stadiul de prespor – caracterizat prin formarea septului de separare constituit pe seama membranei citoplasmatice şi delimitarea consecutivă a învelişului sporal; · Stadiul de spor matur – caracterizat prin reducerea dimensiunilor sporale şi prin maturarea sporului. Sporul odată format rămâne în stare de repaos relativ, numită şi stare dormantă sau criptoliză cu activitate metabolică redusă. Forma, dimensiunile şi localizarea sporului în forma vegetativă (sporangiu) este variabilă de la specie la specie. Luând în considerare diametrul sporului, acesta poate fi mai mic ca al formei vegetative şi deci nu produce deformarea acesteia sau este mai mare ca al formei vegetative provocând deformarea acesteia. Luând în considerare amplasarea sporului în forma vegetativă, sporul poate fi aşezat central (es. B. Antrhacis, subterminal (Cl. Perfringens - aspect de suveică), terminal (Cl. Tetani - aspect de băţ de chibrit sau rachetă de tenis) şi lateral. Structura sporului – pornind de la exterior la interior, structura sporului este următoarea: · Exosporium – cu o structură membranoasă, neesenţial pentru supravieţuirea sporului; · Peretele sporal – are o structură lamelară;

31


· Citoplasma sporală – sau sporoplasma este în cantitate redusă şi este delimitată de o membrană citoplasmatică. In interiorul citoplasmei se află particule de cca 10,0 nm corespunzătoare probabil ribozomilor; · Componenta centrală sau sâmburele – este constituit din ADN în care este înmagazinată informaţia genetică sporală. El se găseşte într-un stadiu înalt de deshidratare şi nu conţine ARN –m. Sâmburele conţine o substanţă specifică numită acid dipicolinic sub formă de sare de calciu. Această sare are rol important în rezistenţa sporului la căldură, în menţinerea stării de criptoliză şi în procesul germinării. Proteinele învelişurilor sporale se deosebesc de cele ale celulelor vegetative prin proporţia în aminoacizi şi prin reactivitatea imunologică. Enzimele sporale au o greutate moleculară mai mică decât cele ale formei vegetative, dar sunt mult mai rezistente la căldură. Sporul are un conţinut mai bogat în ioni de Ca şi Mg, comparativ cu forma vegetativă. De asemenea are un procent mai scăzut de apă. Săruri de fosfor şi potasiu. Sunt absente incluziile de ßhidroxibutirat, enzimele ciclului Krebbs. Germinaea este procesul de transformare a sporului în forma vegetativă. Acest lucru se realizează în condiţiile în care sporii ajung în condiţii prielnice de hrană, umiditate, pH şi temperatură. Transformarea se realizeză într-o succesiune de faze care se derulează într-un interval de cca 90 de minute: · Faza de activare; · Faza de germinare propriu – zisă; · Faza de degradare. Metode de evidenţiere – datorită slabei permeabilităţi a învelişului lor extrern, a densităţii mari a conţinutului şi unei slabe afinităţi pentru coloranţi, sporii nu se colorează cu metode uzuale sau se colorează numai conturul. Sporul poate fi colorat cu ajutorul unor coloranţi concentraţi, după permebilizarea la cald a pereţilor săi. În celulele vii examinate în preparate umede între lamă şi lamelă, sporul se observă ca o formaţiune refringentă net distinctă de citoplasma celulară. Rolul sporilor · prin sporulare fondul genetic al speciilor respective poate fi conservat o lungă perioadă de timp, asigurându-se astfel perpetuarea speciilor bacteriene; · Sporii au o rezistenţă remarcabilă la condiţiile de mediu (radiaţii, uscăciune, căldură), conservându-se ani de zile, asigurând astfel persistenţa surselor de infecţie; · Sporii au o rezistenţă mare la căldură, tolerând uneori expuneri de câteva ore la 120°C şi suportă contactul îndelungat cu unele substanţe antibacteriene, rămânând şi o săptămână în formol 5% şi mai multe săptămâni în alcool.

32


CURS nr. 5 FIZIOLOGIE BACTERIANĂ 5.1. Fiziologie bacteriană Microorganismele, având o mare diversitate metabolică, reușesc să își asigure materialul nutritiv necesar aproape din orice; începând de la utilizarea celor mai simple substanțe chimice, chiar anorganice și până la utilizarea celor mai complexe substanțe organice, acestea dovedesc o diversitate sporită și o adaptabilitate fără precedent. 5.1.1. Metabolism bacterian Metabolismul baterian reprezintă totalitatea transformărilor biochimice enzimatice implicate în activitatea lor biologică, prin care substanțele nutritive din mediu sunt transformate în constituenți proprii, energie și produși de matabolism. Căile metabolice sunt: · catabolice (de dezasimilație) - constă în degradarea compușilor nutritivi din mediu și eliberarea energiei rezultate în celulă (sunt reacții metabolice exoterme) · anabolice (de asimilație) - constă în reacții de sinteză a componenților celulari (reacții metabolice endoterme) · amfibolice (donare) - constă în reacții metabolice cito-centrale, cu funcție de eliberare de energie și de furnizare de precursori pentru biosinteze · anaplerotice (auxiliare) - introduc diverși metaboliți în diverse cicluri metabolice esențiale Principalele caracteristici ale metabolismului bacterian: · este un metabolism flexibil, ceea ce permite adaptabilitate crescută la mediu a bacteriilor · este un metabolism reglat genetic, caracterizat prin diversitatea mecanismelor enzimatice și a produșilor metabolici · este un metabolism intens, ceea ce permite o multiplicare extrem de rapidă în doar 20-30 de minute · este un metabolism cu o eficiență maximă, cu mecanisme silmilare, sau mai complexe decât cele ale organismelor superioare (Average_prokaryote_cell_ro.jpg) 5.1.1. Nutriția bacteriilor Nutriţia este un proces fiziologic complex prin care microorganismele îşi procură elementele necesare şi energia pentru biosinteza compuşilor celulari, pentru creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale. Prin substrat nutritiv se înţelege acel mediu care conţine apă, surse de energie (de natură glucidică), surse asimilabile de 33


azot, săruri minerale şi facultativ factori de creştere. Aceste substanțe nutritive trebuie să conțină: · macrobioelemente - C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca, Fe · microbioelemente - Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W Procesul de nutriţie se desfăşoară în cadrul metabolismului celular prin reacţii de degradare a compuşilor macromoleculari în compuşi cu masă moleculară redusă ce pot fi transportaţi în interiorul celulei. Concomitent cu reacţiile de catabolism, folosind compuşi simpli şi energie, celula vie sintetizează compuşi celulari esenţiali pentru creştere, în cadrul anabolismului. Viaţa celulei microbiene este posibilă atât timp cât cele două procese se desfăşoară concomitent. Celula bacteriană poate utiliza între 300-600 tipuri de molecule diferite din care aproximativ 50% sunt reprezentate de molecula de apă şi ioni. Microorganismele întâlnite în industria alimentară sunt microorganisme chimiosintetizante şi îşi obţin energia prin degradarea compuşilor organici cu eliberarea energiei potenţiale a substratului nutritiv pe care aceasta se dezvoltă dând de cele mai multe ori alterarea specifică a acestuia. Creșterea, dezvoltarea și multiplicarea bacteriilor sunt condiționate de pătrundearea nutrienților esențiali prin învelișurile celulare și eliminarea unor substanțe uzate rezultate din catabolism. Nutriția se realizează prin mecanisme de tip absorbtiv. După sursele de hrană, bacteriile pot aparţine la 4 tipuri nutriţionale: · chemoorganotrofe heterotrofe - îşi obţin energia pe cale chimică, prin procese de oxidare a compuşilor organici şi procură oxigenul şi hidrogenul din compuşi organici şi anorganici (fungi şi bacterii); pe lângă substanțele anorganice au absolută nevoie pentru acoperirea necesitaților de carbon și azot - de substanțe organice sintetizate de către alte organisme. În această grupă se încadrează toate bacteriile patogene. În cadrul acestui tip nutriţional al microorganismelor se disting următoarele subgrupe: - microorganisme saproorganotrofe (saprofite) - se dezvoltă folosind ca sursă de carbon şi energie, materia organică nevie. În această categorie intră majoritatea microorganismelor cu aplicaţii industriale, dar şi bacteriile de putrefacţie, microorganismele care se dezvoltă pe alimente; - microorganisme comensale se dezvoltă la suprafaţa sau interiorul organismelor vii (plante sau animale) beneficiind de această asociere şi hrănindu-se cu substanţe ce rezultă în mod natural din activitatea metabolică a acestora. Se pot exemplifica microorganisme din microbiota epifită a plantelor, a pielii, din microbiota intestinală; - microorganismele patogene sau parazite pot fi strict patogene fiind specializate să se hrănească şi să trăiască parazitând celula vie; - microorganismele potenţial patogene pot să crească pe produse alimentare bogate în nutrienţi şi pot în anumite condiţii să elaboreze toxine, însă prin îngerarea alimentului contaminat se produc stări de toxiinfecţii alimentare sau toxicoze. 34


fotolitotrofe autrotrofe (alge, bacterii din ape) - folosesc energia luminoase în procese de biosinteză. Își asigură nevoile plastice și energetice exclusiv din substanțe anorganice, folosind dioxidul de carbon ca sursă de carbon, iar ca sursă de azot utilizând sărurile amoniacale, nitriții și nitrații. Bacteriile autotrofe nu sunt patogene, unele dintre ele fiind de mare folos agriculturii, prin contribuția adusă îmbogățirii solului în azot. Folosesc energia luminoase în procese de biosinteză şi folosesc sursa de carbon, hidrogen şi oxigen din compuşi anorganici; · fotolitotrofe heterotrofe - folosesc energia luminoasă iar ca sursă majoră de carbon, CO2 din aer (bacterii sulfuroase); · chimiolitotrofe autotrofe (sulfobacterii, ferobacterii) - îşi obţin energia pe cale chimică, iar ca sursă de carbon şi hidrogen servesc compuşii anorganici. · mixotrofe - sunt capabile să folosească ca sursă de carbon fie substanțe organice, fie substanțe anorganice, în special dioxidul de carbon. Bacteriile de acest tip sunt foarte răspândite în natură dar nu sunt patogene pentru organismele animale și umane. Microorganismele cu rol în îndustria alimentară (drojdii, mucegaiuri, şi bacterii aparţin primului tip nutriţional. Fiind adaptate să se dezvolte prin asimilarea carbonului din materie organică sunt cunoscute ca agenţi selecţionaţi pentru dirijarea proceselor fermentative industriale, ca agenţi de alterare sau patogeni . ·

5.1.1.1.1. Surse de nutriţie preferate de microorganismele organotrofe Surse de carbon Nu există nici o sursă de carbon care să nu fie utilizată pe cale microbiană. Există microorganisme care pot utiliza foarte mult sursa de carbon, exemplu Pseudomonas cepacia care pot utiliza peste 100 surse diferite de carbon, alte bacterii, de exemplu din genul Letospira folosesc ca sursă principală de C şi energie numai acizii graşi cu număr mare de C în moleculă. Dintre sursele de C naturale întâlnite în materii prime alimentare sau utilizate în compoziţia mediilor de cultură sunt preferate următoarele: - poliglucide: amidon, celuloză, substanţe pectice, care pot fi folosite în special de către bacterii şi microorganisme producătoare de enzime specifice extracelulare; - monoglucide (hexoze, pentoze), diglucide, reprezintă atât sursa de carbon cât şi de energie pentru toate microorganismele şi sursa de bază în nutriţia drojdiilor; - acizi organici (acid lactic, malic, acetic) pot fi o sursă de C pentru microorganisme şi unele drojdii; - alcoolii sunt utilizaţi de către drojdii oxidative (g. Candida, g. Pichia) şi de bacterii (g. Acetobacter). Deoarece carbonul reprezintă max. 50% din substanţa uscată a celulei la alcătuirea mediilor de cultură se calculează cantitatea de nutrient ce trebuie adăugată (în funcţie de masa moleculară şi de conţinutul în carbon) pentru obţinerea unei cantităţi corespunzătoare de biomasă. 35


Nutrienţi cu N,P,S Pentru creştere, microorganismele necesită cantităţi mari de azot, fosfor şi sulf, iar organotrofele le pot procura fie din sursele organice cu carbon, fie din compuşii anorganici. Se ştie că azotul (10-14% din substanţa uscată a celulei) este necesar pentru sinteza de aminoacizi, purine, puridine, unele lipide, coenzime. Multe microorganisme pot folosi azotul din aminoacizi şi amoniac prin încorporarea directă, cu ajutorul unor enzime. Unele bacterii pot reduce şi asimila azotul atmosferic folosind un sistem de nitrogenaze şi au un rol vital în asigurarea circuitului natural al azotului. Proteinele pot fi folosite în nutriţie numai de către microorganismele ce produc proteaze extracelulare, respectiv bacterii - agenţi cu putrefacţie şi mucegaiuri - agenţi de putrezire. Se mai pot folosi în mediile de cultură a drojdiilor - sulfatul de amoniu şi ureea. Alţi compuşi cum ar fi nitraţii sunt asimilaţi de către mucegaiuri şi bacterii, nitriţii numai de către bacterii (g. Nitrosomonas) şi cu efect toxic pentru drojdii (înmulţirea este oprită la concentraţii de 200 mg nitraţi /dm3). Nutriţia minerală Pentru procurarea elementelor minerale, sunt preferate de către microorganisme sărurile acestora în următoarea succesiune: fosfaţi, sulfaţi, azotaţi, carbonaţi. Efectul pe care îl are adăugarea diferitelor substanţe minerale asupra creşterii poate fi diferit prin indicele de utilitate specific, ce reprezintă raportul dintre biomasa formată pe un mediu de cultură complet şi cea rezultată în mediul carenţat în substanţa /elementul respectiv. Factorii de creştere Factorii de creştere sunt substanţele organice ce sunt esenţiale pentru creşterea microbiană şi nu pot fi sintetizate de microorganismul respectiv. Conform exigenţelor nutritive ale microorganismelor‚ încadrate în primul tip de nutriţie se poate stabili o anumită succesiune; cele mai pretenţioase din punct de vedere nutritiv sunt bacteriile gram pozitive‚ urmate de bacterii Gram-negative‚ şi respectiv drojdii şi mucegaiuri. Factorii de creştere ca structură si funcţie metabolică intră in următoarele 3 categorii: - aminoacizii sunt necesari pentru sinteza de proteine / enzime; - purine si pirimidine , pentru sinteza acizilor nucleici; - vitamine, care functionează ca grupari prostetice ale unor enzime sau cu funcţie de coenzime. În funcţie de natura microorganismelor necesarul de aminoacizi variază între 0 si 18 aminoacizi. Dintre bacteriile din industria alimentară‚ bacteriile lactice ale genului genului Lactobacillus necesită acid folic, acid nicotinic, biotină, vitamina B, piridoxina, bacteriile acetice necesită acid p-aminobenzoic, iar Enteracoccus faecales are nevoie de 8 vitamine diferite pentru creştere. Există şi un grup restrâns de substanţe denumite factori stimulatori de creştere care fără să fie indispensabile, prezenţa lor accelerează ritmul de creştere celulară. 36


Cunoaşterea condiţiilor de cultură şi a exigenţelor de nutriţie a fiecărui microorganism are o importanţă deosebită atât în practica de laborator cât şi la cultivarea industrială, deoarece permite reglarea activităţii fiziologice fie în direcţia obţinerii de biomasă, fie a unor produse de metabolism cu importanţă economică. 5.1.4. Modalităţi de transport a nutrienţilor în celula microbiană Pentru realizarea procesului de nutriţie este obligatoriu ca nutrienţii să pătrundă în interiorul celulei pentru a fi metabolizaţi. Nutrienţii solubili cu molecule mici pot pătrunde în celula microbiană pe diferite căi. Una din căile cele mai frecvente este pătrunderea prin difuzie şi anume prin: - difuzie pasivă - este difuzia ce se realizează ca urmare a unui gradient de concentraţie‚ posibil când în exteriorul celulei concentraţia nutrientului este superioară celui din interiorul celulei. Prin anumiţi pori ai membranei plasmatice nutrientul pătrunde în interior si este metabolizat. - difuzie facilitată - se realizează ca urmare a prezenţei în biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau în spaţiul periplasmic. Permeaza recunoaşte şi leagă molecula solubilă a apei schimbându-şi conformaţia şi o eliberează in interiorul celulei. Apoi aceasta îşi reia poziţia orientată spre exteriorul membranei plasmatice si este pregătită pentru a prelua o nouă moleculă. Acest proces poate avea loc atâta timp cât concentraţia moleculelor nutrient este mai mare în exteriorul celulei faţă de cea internă. Difuzia facilitată este mai importantă la celulele de tip eucariot pentru transportul aminoacizilor si al glucidelor, în timp ce la procariote serveşte pentru transportul glicerolului. Microorganismele adesea se întâlnesc în habitate în care conţinutul în nutrienţi este foarte redus încât pentru creştere este important transportul şi concentrarea lor in celulă. În aceasta situaţie, transportul se face contra gradientului normal de concentraţie, cu consum de energie, prin transport activ şi translocaţie de grup. Transportul activ – transportul în celulă este asigurat chiar în absenţa gradientului de concentraţie şi se realizează cu consum de energie. Transportul se activează ca urmare a energiei eliberate prin transformare ATP în ADP. Translocaţia de grup – este un transport activ întâlnit la drojdii şi mucegaiuri în care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze, care permit pătrunderea glucidelor prin membrane sub forma esterilor fosforici. Celulele pot face schimb cu mediul exterior nu numai cu ioni şi glucide ci şi cu glucide compuşi macromoleculari. Astfel, bacteriile de exemplu pot secreta proteine printr-un proces de exocitoză. Este posibilă si pătrunderea unor astfel de macromolecule in interiorul celulei prin procese de endocitoză. 5.1.2. Respirația bacteriană Reprezintă o înşiruire de procese de oxidare şi reducere prin care bacteriile îşi 37


asigură cea mai mare parte a necesarului de energie, energie pe care o utilizează pentru realizarea activităţilor lor. Respiraţia constă în preluarea de către dehidrogenază a hidrogenului rezultat în urma procesului de catabolism şi cedarea acestuia unui acceptor final reprezentat de oxigen sau o altă substanţă organică sau anorganică. Energia rezultată din procesele de respiraţie şi care nu este consumată imediat poate fi depozitată în acidul adenozintrifosforic (ATP) sub formă de energie chimică legată, de unde poate fi eliberată la nevoie sub formă de energie liberă. În funcţie de natura acceptorului final de oxigen la bacterii se deosebesc mai multe tipuri şi subtipuri respiratorii: · Tipul aerob – în care se încadrează bacteriile care folosesc ca acceptor final de hidrogen, oxigenul; ü Subtipul strict aerob – în care se includ bacteriile pentru care prezenţa oxigenului este indispensabilă; · Tipul anaerob – în care se încadrează bacteriile care folosesc ca acceptor final de hidrogen, un compus organic sau anorganic. Bacteriile anaerobe sunt lipsite de enzime fixatoare şi activatoare ale oxigenului. ü Subtipul strict anaerob – în care se includ bacteriile pentru care prezenţa oxigenului nu numai că nu reprezintă acceptorul de hidrogen, dar este chiar un gaz toxic; ü Subtipul microaerofil - în care se includ bacteriilecare necesită cantităţi foarte mici de oxigen. · Tipul aerob – anaerob facultativ - în care se încadrează bacteriile care au posibilitatea folosirii ambelor mecanisme respiratorii. 5.1.3. Creșterea și reproducerea bacteriană Celulele bacteriene cresc datorită noilor constituenți celulari rezultați din procesele de biosinteză. Această creștere se oprește la un anumit moment dat când începe diviziunea celulară. La bacterii au fost identificate mai multe modalitați de multiplicare: · prin diviziune · prin înmugurire · prin fragmentare · prin corpi elementari Multiplicarea prin diviziune - se realizează prin divizarea celulei mamă în două celule fiice, cel mai adesea absolut identice. Pregătirea diviziunii celulare se face prin dublarea tuturor constituenților celulari. Are loc apoi dublarea și separarea materialului nuclear și apariția unui sept transversal, ce împarte celula mamă în două celule noi care ulterior se vor separa complet. În condiții favorabile de viață și în prezența unui mediu nutritiv bogat, rata de multiplicare bacteriana este foarte rapidă (variind în funție de specie de la 10 la 30 de minute). Multiplicarea prin înmugurire - este caracterizată prin formarea pe corpul celulei mamă a unei protuberanțe din care ulterior se va dezvolta o singură celulă fiică. 38


Multiplicarea prin fragmentare - se întalnește la bacteriile cu dezvoltare hifală, în care alungirea se face prin adăugarea de material nou numai la extremitați și la locul de origine a ramificațiilor. După un timp are loc fragmentare în porțiuni scurte și egale (Actinomycetes). Multiplicarea prin corpi elementari - corpii elementari sunt mici structuri corpusculare care cresc și se multiplică prin diviziune. Viteza de multiplicare bacteriană este foarte mare, datorată metabolismului bacterian foarte intens, astfel la fiecare 20 de minute apare o nouă generație.

39


CURS nr. 6 PRINCIPALELE SPECII DE BACTERII PATOGENE IMPLICATE ÎN CONTAMINAREA ALIMENTELOR BACTERII GRAM NEGATIVE 6.1. Bacterii din genul Salmonella Datorită patogenităţii acestora pentru om şi a faptului că, contaminează frecvent cele mai diverse produse alimentare, bacteriile din genul Salmonella prezintă interes deosebit pentru microbiologia alimentelor, în special a celor de origine animală. Taxonomie şi caracteristici morfologice Salmonella spp - face parte din familia Enterobacteriaceae. În anul 2007, numărul serotipurilor descoperite erau de 2579. Bacteriile au formă de bastonaşe sau cocobacilare, de 2-3/0,6 microni, sunt acapsulogene, asporogene, Gram negative, mobile, cu excepţia unui serotip S.gallinarum (pullorum) sau a unor mutante imobile. Salmonelele îşi exercită patogenitatea prin virulenţă şi toxicitate (endotoxină, exotoxină). Clasificare A constituit o controversă de-a lungul mai multor ani. Conform ultimei nomenclaturi care se bazează pe descoperiri recente în taxonomie, genul Salmonella are 2 specii: · S. enterica · S.bongori. Noua terminologie pentru serovariantele genului a fost propusă de M. Y. Popoff şi L. LeMinor, în 1997. Specia S. Enterica, este divizată în 6 subspecii, având caracteristici biochimice deosebite. Aceste sunt: · Subspecia I – subspecia enterica · Subspecia II – subspecia salamae · Subspecia III a – subpecia arizonae · Subspecia III b – subspecia diarizonae · Subspecia IV – subspecia houtenae · Subspecia VI – subspecia indica În conformitate cu schema Kauffman-White (publicată pentru prima dată în anul 1934), tulpinile de Salmonella sunt clasificate în serovariante pe baza marii diversităţi a antigenelor lipopolizaharidice (LPS) (O) şi a proteinelor flagelare (H). Coform convenţiilor anterioare, în microbiologie se foloseşte mai des vechea terminologie; de pildă S. typhimurium în locul nomenclaturii complete: S. enterica subsp. enterica serovar. typhimurium. În funcţie de antigen, ca şi de testul utilizat, pot totuşi exista reacţii încrucişate între diverse serovariante, ca de pildă între S. enteritidis şi S. typhimurium. Majoritatea serovariantelor care cauzează infecţii la om şi animale aparţin 40


subspeciei enterica. Serovariantele altor subspecii sunt obişnuit izolate de la animale poichiloterme (cu sânge rece) şi din mediul ambiant. De asemenea doar câteva serovariante ale S. arizonae au fost asociate cu îmbolnăviri la păsări şi oi. Specii mai frecvent implicate în contaminarea alimentelor · S. enteritidis, S. typhimurium, S. gallinarum, S. pullorum, S. infantis, S. taksony, S. newport, S. saintpaul S. berta, S. thompson, S. virchow şi altele. Din totalul serovariantelor de Salmonella izolate numai S. enterica serovarianta enteritidis prezintă o patogenitate ridicată cu risc de producere de toxiinfecţii alimentare la consumatori. Celelalte serovariante izolate prezintă un grad de patogenitate redus, procesarea termică asistată, neconstituind ulterior un risc pentru consumatori. · Salmonella typhosa şi paratyphi - agenţii febrelor tifoide şi paratifoide; Toxigenitatea salmonelelor - este determinată de cele două tipuri de toxine pe care ea le produce: exotoxine şi endotoxine. Exotoxinele sunt reprezentate de enterotoxina şi citotoxina, care acţionează prin blocarea mecanismelor energetice ale celulei gazdă, având ca rezultat blocarea retroabsorbţiei Na + din lumenul intestinal, acumularea de lichid şi apariţia diareei. În urma acţiunii endotoxinelor apar fenomene de coagulare intravasculară diseminată. Rezumatul raportului comunitar privind tendințele și sursele de zoonoze, de agenți zoonotici și de focare de toxiinfecții alimentare, elaborat de Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară, aproximativ 80 % din cazurile de salmoneloză la om sunt provocate de Salmonella enteritidis și Salmonella typhimurium. Carnea de pasăre rămâne una dintre sursele principale de salmoneloză la om. Habitat şi surse de contaminare Deşi sunt bacterii intestinale, ele au o larg răspândire în mediu înconjurător; în mod obişnuit se izolează din dejecţii şi ape din canalizările din ferme, ape menajere şi din orice alte materiale supuse contactului cu materii fecale. Par a fi mai răspândite în zonele cu creştere intensivă a animalelor, în special păsări, porci şi vaci cu lapte ţinute în stabulaţie legată. Sursele de infecţie sunt reprezentate de animalele bolnave, cadavrele acestora, mai ales de rozătoare (şoareci, şobolani), păsări răpitoare sau de apă (raţe, gâşte etc.), insectele, care prin dejecţiile lor pot contamina solul, apa şi furajele. Şi unele artropode, cum sunt căpuşele, furnicile, albinele şi muştele, pot vehicula salmonele, dintre care ultimele o pot transmite şi vertical. Peştii, reptilele şi amfibienii pot fi de asemenea purtători de salmonele. Salmonelele se găsesc în tubul digestiv al omului şi animalelor bolnave, trecute prin boală, sau complet sănătoase (purtătoare). Starea de purtător de salmonela la om şi animale este foarte frecventă şi constituie o verigă foarte importantă în lanţul epidemiologic al salmonelelor vii în natură. Bolnavii ca şi purtătorii sănătoşi – cei mai interesanţi pentru microbiologia alimentară – contaminează mediul exterior, solul, apa, furajele şi alimentele. Pentru laptele materie primă, principala sursă de contaminare este reprezentată de fecale, deşi unele studii nu au evidenţiat nici o corelaţie între gradul de igienă al 41


animalelor exprimat prin nivelul bacteriilor indicatoare şi prezenţa salmonelelor în lapte. De cele mai multe ori însă, contaminarea are loc în mod indirect prin poluarea cu germeni din mediul înconjurator prin furaje, excremente, praf, ustensile, manipulatori, muşte. Animalele se contaminează din mediul înconjurător prin hrana şi apa contaminată, şi prin contactul cu animalele bolnave. Procentul de purtători creşte considerabil în timpul transportului de la fermă la abator şi mai ales în timpul staţionării în padocurile abatoarelor. Cu cât această aşteptare este de mai lungă durată, iar lipsa de igienă a grajdurilor şi padocurilor de aşteptare mai evidentă, cu atât proporţia de purtători intestinali de salmonele creşte, iar numărul de salmonele pe gram de fecale este mai mare. Acest lucru a fost demonstrat de către Grau şi Smith, care în urma cercetărilor intreprinse au constatat că prevalenţa carcaselor pozitive de miei, cu germeni din genul Salmonella este direct proporţională cu perioada de aşteptare a animalelor înainte de sacrificare. (26) Proporţia de carcase contaminate rezultate este de peste 2 ori mai mare decât cea a animalelor purtătoare, ceea ce arată că în timpul tăierii, jupuirii şi eviscerării are loc o importantă contaminare încrucişată. Această contaminare încrucişată este cu atât mai extinsă cu cât igiena de tăiere este mai deficitară. Exemple de contaminare încrucişată: când în timpul procesării un aliment contaminat vine în contact cu alt aliment/e necontaminate sau cand o persoană care manipulează mancarea nu curată ustensilele in mod adecvat, suparfetele, echipamentele, sau mainile dupa ce au venit in contact cu aceste produse şi astfel sunt transformate în surse potenţiale de contaminare Contaminarea carcaselor se poate produce în majoritatea stadiilor procesului de sacrificare, dar la animalele cu carnea roşie este mai probabil de realizat în timpul îndepărtării masei gastro – intestianale şi pielii. Contaminarea se extinde apoi de la carcasele contaminate la cele necontaminate prin manipulările neigienice în timpul introducerii şi scoaterii din spaţiile frigorifice, dar mai ales în timpul tranşării cărnii. Rezistenţa la acţiunea temperaturii, dezinfectantelor şi diferiţilor factori de mediu Rezistenţa salmonelelor în mediul extern este destul de mare. La 600 C sunt distruse în 12-20 minute, la 750 C în 5 minute. Congelarea bruscă reduce considerabil numărul de salmonele viabile, dar nu total, supravieţuirea în alimente fiind de câţiva ani. Toate salmonelele sunt suficient de sensibile la acţiunea căldurii, astfel că în majoritatea cazurilor ele sunt distruse de exemplu în cazul laptelui în urma procesului de pasteurizare, deşi unele epidemii au fost asociate cu acest produs. Acest lucru se poate datora deficienţelor procesului de pasteurizare, dar de cele mai multe ori contaminarea se realizează după aplicarea tratamentului termic. Salmonelele sunt distruse relativ repede în mediul extern sub influenţa luminii solare şi a uscăciunii. Dezinfectantele obişnuite le distrug în scurt timp. Persistă timp îndelungat pe alimentele depozitate în condiţii obişnuite de păstrare. Se dezvoltă bine pe mediile nutritive obişnuite cu pH în jur de 7,0 la temperatura de 37°C. Controlul infecţiilor cu salmonele este dificil deoarece ele pot creşte la temperaturi scăzute de 6ºC, mor lent în timpul păstrării alimentelor prin congelare, dar rezistă în 42


produse uscate şi pot fi eliminate din alimente numai prin tratament termic adecvat. (Internet) 6.2. Bacterii din genul Campylobacter Caractere morfologice Genul Campylobacter (cândva inclus în genul Vibrio), cuprinde bacterii Gram negative, nesporulate, necapsulate, cu formă de bastonaşe subţiri, curbate, în virgulă în spirală sau în „S”, de dimensiuni mici (groase de 0,2 – 0,5 microni şi lungi de 0,5 – 5 microni). Bacteriile din genul Campylobacter sunt strict microaerofile, ceea ce înseamnă că acestea cresc în condiţii care presupun concentraţii de oxigen mai mici decât cele existente în atmosferă. Majoritatea cresc în condiţii optime la concentraţii de 3% până la 5% oxigen şi în atmosferă de 10% CO2, motiv pentru care aceste bacterii sunt foarte sensibile la condiţiile oferite de mediului inconjurator şi pentru care sunt oarecum greu de cultivat in condiţii de laborator. În condiţii neprielnice adoptă forma cocoidală care păstrează intacte peretele celular şi falgelii. Dacă agresiunea persistă se produce liza, dar altfel aceste forme cocoidale pot trece într-o fază latentă în care toleranţa la oxigen este crescută. Multe tulpini prezintă motilitate, însuşire care este asociată cu prezenţa unu flagel la unul sau la ambele extremităţi ale bacteriei, care determină mişcări caracteristice (înainte prin înşurubare). Capacitatea patogenă a acestora este dată atât de puterea de colonizare cât şi de producerea de toxine: enterotoxină, citoxină, endotoxină; Principalele specii de Campylobacter care pot contamina alimentele şi care pot fi implicate în producerea de toxiinfecţii alimentare sunt: · Campylobacter jejuni; · Campylobacter coli; · Campylobacter sputorum (biovar. faecalis şi biovar bubulus); · Campylobacter concisus; · Campylobacter fetus - divizat în 2 subspecii: Campylobacter fetus subsp. venerealis care provoacă Campilobacterioza genitală bovină şi Campylobacter fetus subsp. fetus, care este de obicei izolat din tubul digestiv al bovinelor. Rolul său patogen este minor, comparativ cu Campylobacter fetus subsp. venerealis. Rezistenţă La fel ca majoritatea bacteriilor enterice, bacteriile din genul Campylobacter sunt sensibile la acţiunea unor agenţi fizici cum ar fi uscăciunea, încălzirea, congelarea, şi chimici cum ar fi aciditatea şi substanţele dezinfectante. Sunt distruse prin pasteurizare corect efectuată (în laptele pasteurizat, ulterior contaminat rezistă 22 zile 4°C şi 3 zile la 25°C), clorinare şi alte forme uzuale de dezinfecţie, precum şi prin iradiere cu raze gamma. Supravieţuirea creşte la rece, dar procesele de congelare şi decongelare determină reducerea de 10 ori a numărului de microorganisme. 43


Campylobacteriile nu se multiplică în carne la o temperatură sub 30˚C, ceea ce explică de ce nu au fost înregistrate episoade mari, expozive de toxiinfecţie alimentară. Campylobacter jejuni şi Campylobacter coli, împreună cu C. lari şi C. upsaliensis necesită o temperatură optimă de creştere mai mare (42 - 43°C) faţă de cea necesară altor campylobacterii, ele fiind considerate specii termofile. Numărul lor descreşte semnificativ în urma expunerii la aer şi sunt susceptibile la un spectru larg de agenţi antimicrobieni. Habitat şi surse de contaminare Campylobacter jejuni şi C. Coli se găsesc la nivelul tractusului intestinal al păsărilor şi în cel al animalelor. Ajunse în tubul digestiv, din exterior sau cei rezidenţi în intestin, sub acţiunea factorilor favorizanţi se multiplică, având ca mediu propice mucina din mucusul intestinal care facilitează multiplicarea, generând inflamaţia catarală a intestinului, de unde trece în sânge şi ajunge în diferite organe. Ficatul este organul de elecţie în care găseşte condiţii optime de dezvoltare, unde determină şi modificări degenerativ-necrotice. Concomitent are loc şi inflamaţia mucoasei vezicii biliare unde C. jejuni de asemenea se multiplică, ca şi în conţinutul acesteia, de unde se elimină în intestin. Carnea crudă de păsări, laptele (crud) nepasteurizat şi brânzeturile derivate din acesta (în special caşcavalurile produse din lapte nepasteurizat), precum şi apa contaminată, fructele de mare sau legumele, reprezintă surse majore de contaminare. Infectia cu Campylobacter la oameni a fost asociata cu manevrarea sau consumarea alimentelor crude sau negatite suficient, proaspete sau înghetate. Din acest motiv este important ca manipularea şi depozitarea materiilor prime să se facă separat de hrana gătită. Infecţia poate fi transmisă prin intermediul cărnii crude, a carcaselor de pui şi a altor produse animale în trei moduri: prin manipularea produselor când bacteriile pot fi transferate în mod involuntar de pe degete în gură, prin consumul de carne crudă sau insuficicent tratată termic, prin consumul unor alimente “inocente”care pot deveni contaminate prin intermediul mâinilor sau al ustensilelor de la materiile prime, probabil cel mai frecvent mod de infecţie dar foarte greu de demonstrat. Unele specii ale genului Campylobacter fac parte din microflora naturală a intestinelor mai multor specii de animale a caror carne este utilizata în industria alimentară, cum ar fi păsările (gaini, curcani, etc.), porcinele, bovinele şi oile. Fiecare carcasa contaminată poate conţine de la 100 pana la 100.000 de bacterii din genul Campylobacter. Ştiut fiind faptul ca până la 500 de microorganisme pot provoca o stare de infectie, produsele din carne prezintă un grad de risc semnificativ pentru persoanele care nu manevreaza corect carnea crudă sau procesată în timpul prepararii sau în cazul gătirii insuficiente. Împrăştierea bacteriilor de către păsările sălbatice determină contaminarea apelor de suprafaţă, chiar şi a celor din locuri izolate, şi cum campylobacteriile pot supravieţui câteva luni în apă, la temperaturi mai mici de 15°C, nici o astfel de apă nu este potabilă fără tratament adecvat.

44


6.3. Bacterii din genul Yersinia Morfologie Cuprinde bacterii cu formă de bastonaşe scurte sau cocoidă (1-2/0,5-1,0 microni) asporogene, acapsulogene, gram negative, imobile. Rezistenţă Deşi bacteriile din acest gen sunt destul de sensibile la acţiunea dezinfectantelor obişnuite, ca şi la temperaturi (10 min la 600C, sau 18 secunde la 71,80C – pasteurizare), ele supravieţuiesc timp îndelungat în mediul extern; unde se pot multiplica. În special Yersinia enterocolitica are o rezistenţă remarcabilă în mediile naturale. Y. enterocolitica este o bacterie care creste bine la temperaturi scazute de sub 4C. Rezista la inghet si poate suparvietui in mancarea congelata pentru perioade indelungate. Y. enterocolitica rezistă mai bine in mancarea contaminata artificial şi depozitată la temperaturi de refrigerare decat pe mancarea depozitată la o temperatură intermediară. Persista mai mult in mancarea gatita decat in cea cruda, datorita disponibilităţii sporite a nutrientilor. Y. enterocolitica poate creste usor la temperaturi de refrigerare in carnea ambalată etans, oua fierte, peste prăjit, oua lichide pasteurizate, lapte pasteurizat, cacaval si tofu, stridii, creveti cruzi si carne cruda de crap. Y. enterocolitica si Y. pseudotuberculosis pot creste la o valoare a pH – ului intre 4 si 10, cu o medie optimă de 7,6, tolerând conditiile alcaline in comparatiie cu cele acide. Habitat - Se întâlnesc în tubul digestiv al animalelor domestice şi sălbatice de unde contaminează mediul extern, inclusiv alimentele. Sunt bacterii patogene pentru om. A fost izolată frecvent în ultimii ani din laptele unor animale domestice. 6.4. Bacterii din genul Shighella Morfologie Bacteriile din genul Shigella (Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei) au formă de bacili sau cocobacili de 1 – 3/0,5 – 0,7 microni, imobile, acapsulogene, asporogene, gram negative. Rezistenţa acestora în condiţiile mediului extern este mai redusă decât a Salmonelelor, dar pot supravieţui un timp suficient de lung pentru a asigura transmiterea infecţiei. Durata lor de supravieţuire pe alimente depinde de gradul de aciditate al acestora, ştiut fiind faptul că shighelele sunt destul de sensibile la aciditate. Habitatul şi surse de contaminare - normal pentruShigella este tractul intestinal al omului.Toate speciile de Shigella sunt patogene pentru om, producând dizenteria bacilară şi toxiinfecţii alimentare. În special Shighella flexneri sonnei, pote fi introdusă în lapte şi produsele lactate prin mâinile manipulatorilor, prin apa poluată sau prin muşte. Prin lapte se vehiculează frecvent bacterii din genul Shigella. Contaminarea accidentală a alimentelor (cu excreţii ale indivizilor bolnavi de dezinterie) şi ingestia unui număr de minimum 108 celule aparţinând lui Sh.dysenteriae, după o incubare de 4-7 zile, ca urmare a producerii de exotoxine proteice cu activităţi citotoxice, neurotoxice şi enterotoxice, au loc inflamaţii şi ulceraţii ale intestinului. 45


6.5. Genul Vibrio Morfologie Cuprinde bacterii cu formă de bastonaşe relativ scurte(1,5 – 3,0/0,5 microni) curbate sau drepte, cu o formă de S sau de spirală, mobile, foarte rar imobile, asporogene, acapsulogene, gram negative, aerobe şi facultativ anaerobe, chemorganotrofe, cu metabolism fie respirator, fie fermentativ. Habitat Speciile cu semnificaţie pentru igiena alimentelor şi sănătatea omului trăiesc în mediul exterior şi formează o parte din microflora apelor sălcii, a lacurilor sărate, estuarelor şi a apelor marine şi oceanice din vecinătatea ţărmurilor teritoriilor din zonele calde şi temperate. Unii cercetători consideră speciile de Vibrio cvasiubicvitare deoarece supravieţuiesc şi se multiplică în cele mai variate medii. Cele mai multe specii sunt obligatorii halofile, dar gradul lor de halofilie diferă. Majoritatea speciilor fiind halofile se izolează din mediile marine din toată lumea: apă, sediment şi plancton din mări şi oceane din zonele calde şi temperate, din estuare, lacuri sărate şi sălcii, peşte, moluşte, crustacee. Unele din vieţuitoarele marine, cum sunt moluştele cu cochilie, pot concentra vibrionii în organele şi carnea lor. Izolarea din apele şi vieţuitoarele marine din zonele temperate se face mai ales în anotimpurile călduroase, când de altfel apar şi cele mai multe episoade de toxiinfecţii alimentare. De reţinut că din apele a căror temperatură nu scade niciodată sub 100C, vibrionii patogeni se pot izola în tot cursul anului. Vibrionii se izolează foarte rar din apele reci şi sunt sensibili la uscare şi tratamentele termice. 6.6. Bacterii din genul Brucella Caractere morfologice Brucelele sunt cocobacili, de 0,6-1,5 / 0,5-0,7μm. De obicei sunt dispuşi izolaţi şi foarte rar în perechi sau grupări mici. Morfologia lor este relativ constantă, cu excepţia culturilor vechi unde formele polimorfe pot fi evidente. Brucelele sunt imobile, nu formează spori, flageli, pili sau capsule adevărate, sunt Gram-negative şi de obicei nu manifestă fenomenul de bipolaritate, strict aerobe, catalază pozitive, oxidază pozitive în general. Ele nu sunt cu adevărat acido-rezistente, dar rezistă la decolorarea cu acizi slabi şi astfel se colorează în roşu prin metoda Stamp rezultată prin modificarea metodei Ziehl-Neelsen. Aceasta este tehnica uzuală de examinare a frotiurilor din probe de organe sau lichide biologice, care au fost fixate în prealabil prin încălzire sau etanol şi prin această metodă, brucelele se colorează în roşu în contrast cu fondul albastru. Pentru creştere optimă, mediul de cultură trebuie să aibă un pH = 7. În medii lichide produc turbiditate uniformă moderată cu un depozit uşor prăfos. Uneori ele pot să prezinte un depozit granular cu turbiditate variabilă şi pot forma peliculă la suprafaţă. Prin utilizarea mediilor deshidratate adecvate creşterii brucelelor, coloniile devin vizibile 46


după cel puţin 2 zile. După 4 zile ele devin rotunde cu diametrul de 1-2 mm, cu margini netede, translucide de culoarea mierii. Coloniile pot fi şi rugoase cu un aspect uscat, granular cu un colorit galben sau galben – brun. Coloniile netede sunt mai patogene, în timp ce coloniile rugoase sunt mai puţin virulente. Genul Brucella –este constituit din şase specii, toate patogene pentru animale, iar unele şi pentru om. Fiecare specie de Brucella infectează în mod obişnuit o anumită specie de animal sau câteva specii înrudite genetic. Astfel: Brucella melitensis: ovinele, caprinele şi omul; Brucella abortus: taurinele şi omul, rar cabalinele; Brucella suis: porcul şi omul; Brucella ovis: ovinele în special masculii la care le produce orhiepididimite; Brucella canis: câinele, foarte rar omul; Brucella neotomae: şobolanul B. abortus, B. melitensis şi B.suis sunt puternic patogene pentru om şi toate ţesuturile infectate, culturile şi materialele potenţial contaminate trebuie să fie manipulate în condiţii de biosecuritate de nivel 3. (România este indemnă la infecţia cu B. abortus şi B. melitensis). Aciditatea excesivă aşa cum se întâmplă în timpul fermentaţiei unor brânzeturi omoară rapid brucelele. Rezistenţă Germenii au rezistenţă foarte mare în mediul exterior. În sol şi apă rezistă 20 120 de zile, în piei 6 luni, pe îmbrăcăminte 14 zile, în urină 4 zile, la lumina solară directă 1 oră, căldura umedă distruge brucelele la 55°C în 2 ore, la 80°C - rezistă 5 minute, în carnea refrigerată peste 30 zile, în carnea congelată 5 luni, în carnea sărată 21 zile. Antisepticele le distrug în funcţie de concentraţie: formolul 1% în 5 minute, soda caustică 2 % într-un minut, cloramina 0,2 % în câteva minute, derivaţii cuaternari de amoniu (detergenţii) 1-5 % în circa 1 minut, alcoolul 70 - 90 % instantaneu, clorura de var 5 % în 1,5 ore , laptele de var în 2 ore. Habitat şi surse de contaminare Brucelele pot fi prezente în carne, în special cea cu resturi de ţesut limfatic, splina, ficatul, organele genitale, limfonozi, care reprezintă surse importante de infecţie pentru om. Laptele, smântâna şi brânza proaspătă sunt principala sursă pentru bruceloza umană. Excreţia în lapte poate atinge 104/ml la începutul lactaţiei şi apoi să scadă la câteva bacterii (cca. 10/ml) dar poate persista de-a lungul mai multor perioade succesive de lactaţie. Smântâna este în mod obişnuit, mai puternic contaminată decât restul laptelui şi conservă germenii vii mai mult timp. 6.7. Bacterii din genul Escherichia Caractere morfologice şi de toxicitate Escherichia coli reprezintă specia tip a genului, ubicvitară şi formează taxonul bacterian cel mai studiat şi probabil orgnismul viu cel mai bine cunoscut. Această bacterie constituie de mult timp principalul microorganism folosit în cercetările fundamentale de biochimie, genetică bacteriană şi de biologie moleculară. Majoritatea tulpinilor de E.coli sunt lipsite de risc şi pot fi folosite ca indicatori igienico-sanitari în controlul microbiologic al alimentelor. 47


Escherichia coli este un bacil sau cocobacil Gram negativ, aerob şi facultativ anaerob, poliform, colorat bipolar, cu dimensiuni de 2 – 6/1,1 -1,5 microni, nesporogen, acapsulogen, mobil datorită unui bogat aparat ciliar dispus peritrich sau uneori imobil. Majoritatea tulpinilor normal întâlnite în microbiota intestinală aparţinând lui E.coli sunt lipsite de risc şi pot fi folosite ca indicatori igienico-sanitari în controlul microbiologic al alimentelor. Proprietatea producţiei de verotoxine (VT) distinge E. coli producătoare de verocitotoxine ( ECVT) de alte serotipuri de E. coli enterice patogene de tipul E. coli enterotoxigene, E. coli enteroinvazive, E.coli enteropatogene şi E.coli enteroagregative. Termenul de E. coli enterohemoragic (EHEC) a fost aplicat acelor serotipuri VTEC care au caracteristici clinice, epidemiologice şi patogenetice identice celor asociate tulpinii prototip de E. coli O157:H7. Toxinele produse de E. coli producătoare de verocitotoxine (ECVT), dintre cele mai implicate în patologia umană sunt: VT1, VT2 şi VT2c, care lezează celulele ţintă specifice (probabil celulele endoteliale ale capilarelor din rinichi şi din alte organe şi ţesuturi), rolul acestora în înbolnăvirea omului fiind luat în considerare începând cu anul 1980. Verotoxinele sunt printre cele mai puternice substanţe biologice cunoscute, toxice pentru celule în concentraţii de pico la nanomolar. (Oxford) Rezistenţă Cunoaşterea rezistenţei în mediu a ECVT este limitată., dar s-a demonstrat că O157 poate supravieţui lungi perioade (mai mari de 40 de zile) în apă şi este posibil ca mediile contaminate cu materii fecale să fie surse pentru aceste microorganisme mai mult timp. În alimente tulpina O157 este distrusă prin pasteurizarea de rutină a laptelui sau la temperaturile de gătit în mod similar multor altor bacterii patogene. Izolarea tulpinilor O157 din carnea de vită tocată şi congelată, după mai multe luni, sugerează că aceste microorganisme pot persista în mediu în condiţii de iarnă perioade f. lungi. Capacitatea unor tulpni de a supravieţui în condiţii de pH scăzut (4,5), întâlnită în perioade asociate cu consumul de cidrul şi maioneză, demonstrează că aceste microorganisme pot supravieţui în urma diferitelor metode de preparare a hranei. Unele tulpni de E.coli, supravieţuiesc în mediul extern o perioadă scurtă de timp. De aceea prezenţa ei în sol, apă şi alimente sau diferite alte obiecte arată o contaminare fecală recentă şi o prezenţă potenţială a germenilor enterici patogeni. Escherichia coli este sensibilă faţă de acţiunea substanţelor dezinfectante obişnuite în concentraţiile folosite în practica curentă, motiv pentru care această bacterie este parametrul principal, şi de cele mai multe ori, unic pentru verificarea eficienţei operaţiunilor de spălare şi dezinfecţie. Este foarte sensibilă la căldură, dar înglobată în substraturi proteice sau în grăsime poate rezista timp de o oră la 550C şi 15 – 20 minute la 600C. Din această cauză, pentru a fi distrusă din substraturile alimentare, acestea trebuie tratate termic la nivele mai mari de 600C, echivalente sau mai mari decât pasteurizarea obişnuită. 48


Enterotoxinele produse de E.coli sunt endotoxine legate ferm de peretele celular, sunt proteine termolabile care se inactivează la 60ºC în 30 de minute şi se distrug complet la pH = 3,5-5. Sunt rezistente la acţiunea tripsinei. Habitat şi surse de contaminare Bacteriile din genul Escherichia sunt larg răspândite în natură. Habitatul obişnuit al Escherichia coli se găseşte în tubul digestiv al omului şi animalelor cu sânge cald şi al unor insecte şi reprezintă microflora dominantă a intestinului gros, având un rol important în menţinerea fiziologiei normale a acestuia. Bacteria se elimină în mediul exterior odată cu fecalele, contaminând solul, apa şi alimentele. În unele studii serotipul O157:H7 a fost izolat la 0,6-2,5% din probele de fecale examinate, de obicei reprezentând a doua sau a treia bacterie patogenă frecvent izolată (Oxford) Escherichia coli poate proveni din mamela infectată sau ulterior de pe mâinile manipulatorilor sau în timpul mulsului neigienic, de pe animalul murdar cu fecale contaminate. Laptele se poate contamina cu E.coli în principal prin persoanele purtătoare. Infecţia poate fi contractată prin apă (fiind frecvent izolate din apa fântânilor sau din alte surse de suprafaţă) sau prin transmitere de la o persoană la alta.

49


CURS NR. 7 PRINCIPALELE SPECII DE BACTERII PATOGENE IMPLICATE ÎN CONTAMINAREA ALIMENTELOR BACTERII GRAM POZITIVE Genul Listeria Morfologie L.monocytogenes se prezintă ca un bacil scurt sau cocobacil, de 1-2 / 0,3- 0,5μm, cu capetele rotunjite, Gram pozitiv , necapsulat, nesporulat, mobil (la 20-25 ° C), aerob, cultivabil pe mediile obişnuite, dispus în lanţuri scurte, în palisadă, ”V” sau „Y”, sunt mobile şi catalază pozitive. Listeria monocytogenes se deosebeşte de celelalte specii prin faptul că produce hemoliză, fermentează ramnoza şi testul CAMP pozitiv cu Staphylococcus aureus. În genul Listeria sunt încadrate, pe lângă L.monocytogenes şi alte specii, dintre care numai L. ivanovii a fost incriminată în etiologia listeriozei, restul fiind nepatogene. Rezistenţa Optimul de creştere al bacteriilor din genul Listeria este la temperatura de 20 - 370 C (se multiplică şi la 3-4 0C). La acţiunea factorilor de mediu este mai mare comparativ cu alte bacterii nesporulate. La 60 0C rezistă 12 minute, la 75 - 90 0C - 20 minute, în sol 65 - 295 zile, în gunoiul de grajd 4-11 luni, materii fecale amestecate cu pământ 34 - 242 zile, iar păstrate la 5°C - 5 până la 6 ani. În furajele vegetale şi combinate rezistă 105 275 zile iar în cele însilozate la 5°C, 6 ani, în apa de lac şi de râu la 25 °C 345 - 750 zile, în cadavrele îngropate rezistă 45 -120 zile. Se poate constata că listeriile rezistă mai bine la temperaturile joase, ceea ce explică supravieţuirea lor în mediul exterior perioade de timp mai lungi în anotimpurile reci. (Patologie) Listeria monocytogenes rezistă diferitelor tratamente termice mici sau moderate şi proceselor de fermentare - maturare a diferitelor brânzeturi, dar sunt distruse în mediile cu pH mai mic de 4,5 sau mai mare de 9,5. De asemenea rezistă la concentraţii mari de NaCl la temperaturi de 370C. Dezvoltarea ei este oprită dacă produsele se tratează cu sorbat de potasiu în cazul unor preparate din carne preambalate în pungi vacuumate (care a fost ambalat şi sigilat ermetic după eliminarea aerului din ambalaj), care se păstrează la temperaturi joase, condiţiile de vacuum fiindu-i favorabile. Este sensibilă la acţiunea dezinfectantelor uzuale, iar dintre antibiotice la ampicilină, eritromicină. tetraciclină, cloramfenicol şi negamicină şi rezistentă la streptomicină şi polimixină. Habitat 50


Este o bacterie ubicvitară în mediul extern , saprofită în sol, apă şi furaje unde se şi multiplică sau epifită în diferite organe, fiind izolată de la animalele sănătoase din fecale şi tubul digestiv. Bacteriile din genul Listeria se pot multiplica în sol, ape de suprafaţă, ape de canal, gunoi de grajd, fecale, furaje însilozate, diferite cereale şi legume, diferite produse alimentare şi chiar pe suprafeţele de lucru neigienizate din unităţile de procesare. Surse de contaminare Listeriile se găsesc atât saprofite în mediu (apă, sol, furaje) cât şi comensale în oganismul animal, acestea constituind elemente care pot servi ca surse de contaminare a alimentelor. Contaminarea mediului ambiant se poate realiza de către animalele domestice sau sălbatice, fie direct prin secreţiile şi excreţiile acestora (provenite de la animale bolnave sau de la purtătorii sănătoşi), fie indirect, atunci când omul foloseşte ca îngrăşământ dejecţii provenite de la animale domestice. În cazul folosirii dejecţiilor ca îngrăşăminte, riscul apariţiei îmbolnăvirilor de listerioză la om este mare, deoarece produsele vegetale fertilizate cu ajutorul îngrăşământului contaminat, pot să ajungă să fie consumate fără a fi tratate temic, riscul de îmbolnăvire devenind astfel iminent. Dacă listeriile ajung să contamineze anumite produse vegetale, acestea se pot multiplica pe perioada stocării lor, ducând astfel la o încărcătură bacteriană mare (nr de celule bacteriene/gram), periculoasă pentru consumatorul uman. 7.2. Bacterii din genul Staphylococcus Morfologie Cuprinde bacterii cu formă de coci, Gram pozitive, cu diametrul de 0,5 -1,5 microni, dispuşi ca celule izolate, în perechi, tetrade, lanţuri scurte, sau mai des grupaţi în grămezi sub formă de ciorchine, de unde şi denumirea. De obicei sunt catalazo pozitive, facultativ anaerobe, imobile, asporogene. În afara speciei Staphylococcus aureus cu implicaţiile cele mai mari în patologia umană, inclusiv în igiena alimentară, în ultimele două decenii s-a stabilit că şi alte specii de Staphylococcus pot fi implicate în microbiologia alimentelor mai ales speciile care sunt coagulazo pozitive, fiind implicate adeseori singure sau în comun cu alte bacterii în cazuri de toxiinfecţii alimentare la om Rezistenţa Principalul pericol al contaminării alimentelor (în special a laptelui şi produselor lactate) cu stafilococi, constă în elaborarea de către unele tulpini (coagulazo – pozitive) a unei enterotoxine capabile să provoace la om gastroenterita acută. Enterotoxina stafilococică este termostabilă, din care cauză, după elaborarea ei, este greu sau chiar imposibil de a o inactiva. Termorezistenţa enterotoxinei stafilococice are o importanţă practică considerabilă, metodele de pasteurizare fiind ineficace pentru distrugerea acesteia. Abia după o fierbere de 60 minute se constată o anume reducere a activităţii enterotoxinei. În autoclav la 2 51


atm., enterotoxina stafilococică este inactivată. S.aureus se multiplică la>5-6°C şi elaborează enterotoxina la > 18°C; Pentru inhibarea dezvoltării germenilor patogeni, carnea trebuie stocată la temperatura < 5°C, de preferat în jurul a 0°C. Surse de contaminare Staphylococcus aureus este frecvent purtat de oamenii aparent sănatoşi (de regulă, pe mucoasa nazală şi pe piele) care manipulează laptele şi produsele lactate, ca şi de animalele producătoare de lapte. Frecvenţa purtătorilor este mai mare printre oamenii care prezintă sau au prezentat furunculi, panariţii sau diferite răni la nivelul pielii. Ugerul şi pielea animalelor de lapte constituie o altă sursă importantă de poluare a laptelui cu stafilococi. Leziunile mameloanelor şi pielii ugerului conţin adesea stafilococi cu care se contaminează laptele, fie direct, fie prin mâinile mulgătorilor. Mamitele stafilococice produse de S.agalactiae, S.dysgalactiae şi S.uberis s-au rărit ca incidenţă, urmare a utilizării unor antibiotice în tratamentul animalelor bolnave. Concentraţiile nocive în lapte ale stfilococilor pentru om sunt atunci când densitatea celulelor vii de stafilococi este minimum 500.000-1.000.000/ ml(g) de aliment. Sub 10 °C, multiplicarea stafilococului este practic nulă şi nu are loc nici producerea de enterotoxină. De aceea toxiinfecţia cu enterotoxina stafilococică poate apărea de cele mai multe ori prin consumul de lapte pasteurizat, dacă înainte de pasteurizare a fost contaminat şi ţinut în condiţii favorabile multiplicării stafilococilor. 7.3. Bacterii din genul Streptococcus Morfologie Au formă de coci sferici sau ovali, relativ mici(Ø < 2 microni), grupate în diplo sau sub formă de lanţuri, gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii sunt capsulogene. Unele specii din grupa Streptococilor lactici datorită calităţilor lor de a fermenta lactoza se folosesc în cultură pură sau mixte cu alte bacterii sau mucegaiuri, la fabricarea unor produse lactate, laptele bătut, sana, unt, brânzeturi, etc. Habitat şi surse de contaminare Grupa Streptococilor fecali sau a enterococilor, au ca habitat obişnuit tubul digestiv al omului şi păsărilor, cu o mare răspândire în natură. Grupa streptococilor piogeni sunt de semenea de mare interes pentru microbiologia alimentelor. Streptococcus (Enterococcus): S.faecalis, S.bovis, S.durans, provoacă posibile stări de toxiinfecţie când concentraţia bacteriilor în produs este de 106-107/g. Contaminare se poate face prin persoanele care manipulează şi ambalează diferitele produse şi care poartă aceşti germeni la nivelul nasofaringelui. Din această cauză, laptele praf, în special cel pentru copii, ar trebui investigat şi în direcţia streptococilor beta hemolitici. 7.4. Bacterii din genul Clostridium Clostridium perfringens şi Clostridium botulinum 52


Morfologie Cuprinde bacteriile cu formă de bastonaşe, adesea de talie mare, aşezate izolat sau sub formă de lanţ, anaerobe, Gram pozitive, sporogene, majoritatea mobile. Forma şi prezenţa sporului prezintă o mare importanţă toxonomică. El poate fi central, subterminal sau terminal, deformând sau nu celula, ceea ce dă bacililor sporulaţi forme diverse: de lămâie, sau suveică (spor central); de sticlă de lampă de petrol (spor subterminal); de măciucă (spor terminal rotund) şi de rachetă (spor terminal oval). Unele specii ale genului Clostridium sunt implicate în provocarea unor toxiinfecţii alimentare la om. Acestea sunt Clostridium perfringens şi Clostridium botulinum care au şi importanţă pentru microbiologia alimentelor. Clostridium perfringens este o bacterie cu formă de bastonaşe, tăiate drept la capete, de lungime foarte variabilă (de la 3 la 9 microni), relativ groase (0,9 – 1,3 microni) foarte polimorfe, Gram pozitive, imobilă, sporogenă, sporii sunt ovali, cu poziţie subterminală/ capsulogenă. Se găseşte ca saprofit frecvent în sol, apă, praf, precum şi ca epifit în tubul digestiv al omului şi animalelor Clostridium botulinum este o bacterie cu formă de bastonaşe drepte sau uşor curbate, cu dimensiuni foarte variabile (1,6 – 1,9/0,4 – 1,9 microni), strict anaerobă, mobilă, sporogenă, sporul este oval şi subterminal, Gram pozitivă şi nu capsulează. Este foarte răspândită în natură. Se întâlneşte în sol, sedimente marine, alimente, pe vegetale. Poate fi frecvent găsit ca epifit în intestinul omului, animalelor şi peştelui marin. Dezvoltarea bacteriei Clostridium botulinum ca şi elaborarea de toxină activă a acestuia este favorizată de prezenţa CO2. Tulpinile producătoare de neurotoxine A, B, E, dau botulismul la om şi produc sindrom neuroparalitic cu efect letal. Manifestarea stării de boală are loc după 1-10 zile şi cazurile letale ajung până la 68%. După ingerarea toxinei botulinice după 8-36 ore apar stări de vomă, dureri abdominale şi diaree, apoi starea de uscăciune în gură, dilatarea pupilelor, viziune dublată, dificultăţi respiratorii, căderea muşchilor faciali, iar moartea este datorată asfixierii, stopului cardiac, infecţiilor pulmonare. Toxinele botulinice au o toxicitate ridicată (o doză de 0,2 μg poate omorî un om de 100 kg). Surse de contaminare Bacteriile din genul Clostridium sunt larg răspândite în natură: sol, apă, materii organice în descompunere. Deseori sunt prezente în conţinutul intestinal al omului, animalelor şi insectelor. Speciile din genul Clostridium (microorganisme cu habitat teluric), ajung în lapte in timpul mulgerii şi manipulării odată cu praful atmosferic, murdăria de pe corpul animalelor, sau prin contactul cu vasele de muls, cu mâinile operatorilor sau cu diferite ustensile neigienizate. Ele se întâlnesc în lapte în tot cursul anului dar sunt mai frecvente şi mai numeroase în cel provenit de la animalele în stabulaţie. Aceste bacterii pot proveni din sol, apă, furaje (siloz), cheag, fecale, etc., rezistă la pasteurizarea laptelui şi rămân în stare de endospori până când pH-ul creşte prin neutralizarea acidului lactic de fermentaţie la valori mai mari de 6. Clostridiile ajung pe sau în carne de pe suprafaţa animalelor (piele, blană, 53


murdăria de pe ongloane), din fecale şi din mediul înconjurător neigienizat corespunzător, în care se taie animalele, se depozitează şi se manipulează carnea. În cazul animalelor sacrificate în stare de oboseală pronunţată, stresate, a celor eviscerate târziu după sângerare, clostridiile împreună cu alte bacterii prezente în conţinutul tubului digestiv pot pătrunde în organe şi masele musculare profunde. Cu cât starea sanitară a animalului înainte de tăiere este mai bună şi procesul de tăiere se face în condiţii mai igienice, cu atât numărul de clostridii din carne este mai mic. (3) Clostridium perfringens, se găseşte frecvent în dejecţiile omului, animalelor şi insectelor. Sporii pot rezista foarte mult timp în sol şi praf. (3) C.perfrigens - se găseşte obişnuit în fecale, sol, apă şi se introduce în abatoare odată cu pasărea vie. Rezistenţă Sporii unor clostridii, rezistenţi la caldură, pot supravieţui în anumite condiţii tratamentului termic şi apoi germinează, în măsura în care proprietăţile conţinutului, în special valoarea pH şi aw, permit acest lucru. Germinarea lor este urmată de multiplicare, ceea ce determină alterarea conţinutului şi (sau) transformarea lui într-un aliment nociv pentru om. Astfel formele sporulate ale bacteriilor din genul Clostridium, rezistă tratamentelor termice aplicate în mod obişnuit (ex pasteurizarea în cazul laptelui crud), ca şi diferitelor procese de fermentare-maturare pe care le suferă unele produse alimentare (ex. produsele lactate). Trebuie mentionat că de exemplu laptele de consum, obţinut printr-un proces de pasteurizare eficient şi ambalat în conditii aseptice conţine în exclusivitate bacterii din genul Clostridium şi Bacillus. Numarul lor în laptele de consum, provenit din lapte crud obţinut în condiţii igienice si dupa pasteurizare eficienta, are valori in jur de 1000 bacterii/ml lapte. Sporii pot rezista foarte mult timp în sol şi praf. Pentru a se evita înmulţirea acestui germene în laptele contaminat este nevoie ca acesta să se păstreze la temperaturi mai mici de 15 °C. C. perfringens, nu rezistă în produsele lactate acide şi în brânzeturi. (3) Germenii patogeni nu se pot multiplica la temperaturi mai mici de 5°C. C.perfrigens se multiplică semnificativ la > 20°C; C.botulinum eborează toxina numai la >10°C. Tipul E de C.botulinum este psihrotrof şi se multiplică şi la 3-5°C. Pentru inhibarea dezvoltării germenilor patogeni, carnea trebuie stocată la temperatura < 5°C, de preferat în jurul a 0°C, refrigerarea carcaselor trebuind să se realizeze cât mai repede de la obţinere. Germenii patogeni din carnea congelată sunt cei existenţi pe carne şi înainte de congelare. Ei nu mor în timpul congelării şi depozitării la temperatura de congelare, ci numai se reduc din punct de vedere numeric (cca 5% pe lună la -20°C) şi o mică parte din microorganismele care contaminează carnea mor. Este o mare greşeală de a congela produse cu insuşiri organoleptice şi microbiologice dubioase, în speranţa că prin aceasta se vor ameliora asemenea însuşiri. Din contră, ele vor deveni şi mai defavorabile la produsul decongelat. Cele mai sensibile sunt bacteriile Gram negative (formele vegetative ale C.perfrigens mor rapid la temperatura de congelare), iar sporii bacterieni rămân neafectaţi. Cu toată această distrugere, carnea congelată şi decongelată conţine un numar 54


destul de mare de microorganisme, ceea ce poate determina alterarea ei rapidă. C.perfringens nu se multiplică în carnea de pasăre decât dacă temperatura de depozitare este total inadecvată (peste 20 °C) şi devine un risc pentru sănătatea consumatorilor numai dacă după gătire, carnea este păstrată mai mult timp (peste 6-10 ore) la temperaturi mai mari de 20°C. (3) Opărirea reduce în mod semnificativ numarul de microorganisme aerobe (în special enterobacterii) de la nivelul pielii şi o mare parte din acestea, se îndepartează mecanic odată cu stratul cornos (cuticula) superficial al pielii. Sporii bacterieni, (ex.sporii de C.perfringens), supravieţuiesc operaţiunii de opărire. Germenii patogeni ce contaminează peştele nu se multiplică la temperatura de refrigerare, cu excepţia tipurilor psihrotrofe (E şi F) de Clostridium botulinum, dar care sunt concuraţi de microflora saprofită, în majoritate psihrotrofă. (3) Conservele supuse unor tratamente termice de 117-121°C, un timp variabil, funcţie de specificul conţinutului şi mărimea ambalajelor, un asemenea tratament termic nu modifică în mod esenţial produsul din punct de vedere organoleptic şi nutritiv în aşa fel încât să îl facă impropriu consumului uman. Ele asigură însă moartea tuturor formelor vegetative ale microorganismelor şi sporii speciilor mezofile de bacterii din genurile Bacillus şi Clostridium, inclusiv cei ai speciei C.botulinum, indiferent de numărul acestora în produs înainte de tratarea termică. La asemenea tratamente rezistă sporii speciilor termofile din genurile Bacillus şi Clostridium, motiv pentru care dacă conservele sunt ţinute la temperaturi mai mari de 40°C, ele se vor altera. În zonele cu climă rece şi temperată conservele pot fi păstrate timp de 4 ani fără a se altera. Temperatura lor de depozitare nu trebuie însă să fie mai mare de 25°C, deoarece la temperaturi mai mari, alterarea abiotică poate să apară în timp mai scurt, datorită faptului că unii spori reziduali ai speciilor termofile pot să îşi reia dezvoltarea. 7.5. Bacterii din Genul Bacillus Caracteristici morfologice Genul Bacillus este un gen relativ heterogen, format din bacili Gram pozitivi, din care unii uşor labili, aerobi sau facultativ anaerobi, cu dimensiuni de 2,5 – 10/0,5 – 1,2 microni, qvasiubicvitari în mediul exterior.Toate speciile sunt sporogene, unele şi capsulogene şi imobile. Datorită răspândirii mari în natură, a capacităţilor patogenice şi enzimatice, numeroase specii din genul Bacillus sunt implicate în patologia umană şi animală, precum şi în igiena alimentelor. Bacillus anthracis - este singura bacterie obligatoriu patogenă din cadrul genului Bacillus. Este o bacterie sporogenă, Gram – pozitivă, de formă bacilară, cu capetele tăiate drept, dispus în lanţuri, cu dimensiuni de 4 – 6 /1 – 1,95 microni. Capsulează „in vivo” în organismul infectat şi „in vitro” în mediile de cultură. Formează spori ovali situaţi central, cu diametrul mai mic decât grosimea celulei vegetative. Nu sporulează în condiţii anaerobe, ci numai în prezenţa oxigenului. Cei doi factori de virulenţă cunoscuţi ai Bacillus anthracis sunt polipeptidul capsular acid poli-g-D-glutamic, care protejează 55


faţă de fagocitoza celulelor defensive ale gazdei şi toxina produsă în timpul fazei de creştere exponenţială. Morfologia colonială a Bacillus anthracis este foarte caracteristică după incubarea peste noapte a agarului cu sânge în condiţii de aerobioză la 37°C. Coloniile sunt relativ mari, măsurând aproximativ 0,3 – 0,5 cm în diametru. Sunt albe spre alb – cenuşii, nehemolitice, cu aspect rugos, de sticlă pisată şi are o consistenţă vâscoasă, untoasă. Adesea se observă prelungiri sub formă de smocuri care pornesc din colonie. Această caracteristică a fost descrisă ca aspect de “ cap de meduză “. Celula vegetativă a B.anthracis este mare măsurând 3-5 mm în lungime şi aproximativ 1 mm în grosime. Sporii elipsoidali centrali, care nu dezvoltă sporangii, sunt formaţi spre sfârşitul fazei de creştere exponenţială a celulelor. Celulele care se colorează intens Gram pozitiv sunt grupate “in vitro” în lanţuri lungi, iar “in vivo” în perechi sau în lanţuri scurte şi adesea au capetele retezate (câteodată lanţurile au aspectul unei garnituri de vagoane – aşa numitul aspect de “vagon de marfă”). În ţesuturi bacilii sunt încapsulaţi, dar această caracteristică se pierde atunci când bacteria este cultivată “in vitro” în aerobioză pe agar nutritiv sau bulion nutritiv. Formarea capsulei poate fi indusă prin cultivarea cel puţin 5 ore pe sânge defibrinat de cal sau prin cultivarea pe agar nutritiv cu 0,7% bicarbonat de sodiu şi incubaţie în atmosferă cu CO2, la 37°C. Vizualizarea bacililor capsulaţi, de obicei în număr mare, în frotiurile din sânge colorate cu albastru de metilen policrom (metoda M’ Fadyean) este foarte utilă pentru diagnostic. Capsula se colorează în roz în timp ce corpii bacilari se colorează în albastru închis. Coloraţiile Gram şi Giemsa obişnuită nu evidenţiază capsula. Bacillus cereus - este foarte asemănător morfologic cu Bacillus anthracis. Rezistenţă B. anthracis - forma vegetativă pare să fie surprinzător de fragilă; supravieţuirea speciei depinde de sporularea rapidă a bacililor în urma expunerii la aer, dar rata unei sporulări eficiente nu depăşeşte niciodată 0,1%, şi de obicei este chiar mai mică. Totuşi odată atinsă faza de spor, este bine stabilit că acesta poate supravieţui decenii. Sporii rezistă ani de zile în sol şi nu sunt distruşi în carnea supusă tratamentelor termice la 700C. B.cereus - poate creşte la temperaturi scăzute de 10ºC, dar se consideră că toxinele pot fi elaborate la temperaturi peste 15ºC. Habitat şi surse de contaminare Multe din celelalte specii ale genului Bacillus sunt în mod obişnuit saprofiţi, ambientali ubicvitari, chiar dacă unele dintre ele, ca de exemplu B.cereus, B.licheniformis şi B.subtilis sunt ocazional asociate cu intoxicaţii alimentare la om. Bacillus anthracis se găseşte în sol sub formă de spori. B. anthracis poate trece din sângele animalelor bolnave în lapte. Antraxul afectează de obicei oamenii care lucrează cu carcasele de animale, în urma manipulării şi prelucrării părului, lânii, pielii, oaselor sau a altor produse animale contaminate. (Oxford) Bacillus cereus - este foarte răspândit în natură, găsindu-se de regulă în sol, apă, aer, pe plante, izolându-se frecvent din cele mai diverse alimente. Deseori participă la 56


alterarea alimentelor. Foarte puţin patogen în condiţii naturale. 7.6. Bacteriile din genul Mycobacterium Morfologie Cuprinde bacterii cu formă de bacili drepţi, uşor sau puternic curbaţi, lungi de 0,2 – 10 microni, mobile, asporogene, slab gram pozitive, acapsulogene, acido-alcolorezistente, aerobe şi microaerofile. Mycobacterium bovis, un bacil acido-rezistent, cu creştere lentă, nonfotocromogen. Habitatul microbacteriilor este format din multe elemente ale mediului: apă, sol, praf, vegetale. Aceasta nu înseamnă că ele se înmulţesc în mediul extern. Mycobacterium paratuberculosis se găseşte în număr mare în fecalele bovinelor şi ovinelor infectate şi deşi aceşti bacili pot supravieţui perioade lungi de timp în sol, nu există nici o dovadă că ei s-ar multiplica în afara organismului gazdă. Rezistenţă Mycobacterium tuberculosis, poate rezista în fecalele ajunse în mediul exterior, pământ, păşuni, până la 1 an, în spută 3 – 4 luni, în cadavre îngropate ca şi în apele de canal mai multe luni. Practic acestea sunt cele mai rezistente microorganisme asporogene în mediul extern. Bacteriile din genul Mycobacterium rezistă 220 de zile în brânza Cheddar, 305 zile în brânza Tilsit, 3 luni în Camembert, 90-120 zile în brânza Emmenthal. Surse de contaminare M.bovis se propagă la om prin laptele provenit de la capre, oi şi alte rumegătoare bolnave. Frecvenţa tuberculozei bovine la om depinde de gradul de infecţie al efectivelor de bovine şi consumul laptelui crud sau insuficient tratat termic. Bacilii tuberculozei pot ajunge în laptele din ugerul infectat chiar dacă nu sunt prezente leziuni la nivelul acestuia. În urma unor studii, s-a constatat ca aproximativ 4% din vacile tuberculino-pozitive excretau bacili prin lapte, în condiţiile în care numai 25% din aceste animale prezentau leziuni mamare. Atunci când provenienţa bacilililor tuberculozei este din sânge, prezenţa lor în lapte este intermitentă, deoarece şi bacteremiile la animalele bolnave sunt intermitente.

57


CURS nr. 8 DROJDII (Levuri) Drojdiile reprezintă un grup complex şi eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot (celule cu nucleu diferenţiat), care se înmulţesc prin înmugurire, ca formă generală de reproducere şi în mod particular prin ascospori formaţi pe cale asexuată şi sexuată. Denumirea de „drojdie” semnifică, în general, sedimentul care se formează după ce a avut loc fermentaţia alcoolică a musturilor dulci. Denumirea de levuri provine de la verbul „lever” (limba franceză – a ridica) ce sugerează creşterea în volum a aluatului la fabricarea pâinii. Cunoscute din timpuri străvechi pentru activitatea lor fermentativă, drojdiile sunt studiate de Louis Pasteur (1863), studiu continuat de microbiologii: Meyen, Rees şi Hansen care realizează o clasificare a drojdiilor în 1896, completată de Guillermond în 1928. Un studiu taxonomic de referinţă aparţine lui Lodder (1952, 1970) şi mai recent, lui Kreger van Rij (1984). 8.1. Importanţă şi rol Drojdiile joacă un rol foarte important în industria alimentară, biotehnologie, în natură. Având drept caracteristică principală capacitatea de a produce fermentarea glucidelor simple cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate în biotehnologii alimentare la fabricarea alcoolului, a vinului, berii şi pâinii. Drojdiile au o compoziţie chimică valoroasă şi după cultivare în condiţii de aerare şi prelucrare sunt utilizate ca sursă de proteine în alimentaţia umană, cu denumirea de SCP (single cell protein – proteine din monocelulare) sau în alimentaţia animalelor, deoarece pe lângă 45-55% proteină brută/100 g s.u., aduc în raţie aminoacizi (lizină etc.) şi vitamine ale grupului B (tiamină şi riboflavină). În microbiologia industrială, din biomasă de drojdie se obţin: - extracte (plasmolizate, autolizate), folosite ca aditivi alimentari sau pentru îmbogăţirea în substanţe azotate a mediilor de cultură destinate fermentaţiilor; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: β-fructofuranozidaza şi β-galactozidaza; - prin hibridizări şi inginerie genetică, din mutanţi ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obţinut interferonul – substanţă cu efect antiviral şi citostatic. 8.2. Răspândire în natură şi rezistenţă Drojdiile au o largă răspândire în mediul ambiant, fiind întâlnite în toate habitaturile naturale. În sol, celulele de drojdie se întâlnesc în straturile superficiale până la adâncimi de aproximativ 30 cm, în concentraţii de 102- 2·105/g. Din sol, prin acţiunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar în 58


aer şi să se răspândească la distanţe mari; din sol şi aer drojdiile pot ajunge în ape şi unele specii pot fi întâlnite chiar la adâncimi de 4000 m. În regnul vegetal drojdiile se întâlnesc pe suprafaţa frunzelor, fructelor, florilor, în rădăcini. Răspândirea drojdiilor este favorizată de insecte care odată cu nectarul/sucul preiau şi celulele de drojdie. O parte din drojdii supravieţuiesc iarna în tubul digestiv al insectelor, iar primăvara sunt eliminate. În regnul animal drojdiile sunt prezente în microflora intestinală şi se elimină natural prin produse de dejecţie; în cantităţi mai reduse se întâlnesc în cavitatea bucală şi pe piele. Temperatura optimă de dezvoltare este de 25 – 280C (mezofile). Există însă specii psihrotrofe care se pot multiplica la temperaturi joase(+5 la 00C) şi care au semnificaţie mare pentru conservabilitatea alimentelor cu ajutorul frigului. 8.3. Caractere morfologice generale Sunt ciuperci microscopice de tip unicelular care după înmulţire, rămân unite în lanţ, aspect morfologic denumit pseudomiceliu. Are în mod obişnuit formă sferică, ovală sau cilindrică, cu dimensiuni medii de 4-14 µm. Forma şi dimensiunea celulelor este un caracter de gen şi specie şi acestea pot fi influenţate de starea fiziologică şi condiţiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri cu importanţă industrială se menţionează: - forma ovală (elipsoidală) specifică drojdiilor fermentative ce aparţin genului Saccharomyces; - forma sferică predomină la drojdii din genul Torulopsis; - forma apiculată (de lămâie) la genurile Kloeckera şi Hanseniaspora; - forma de sticlă la drojdii din genul Saccharomycodes. Prin cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de malţ cu agar), în cazul în care la suprafaţă se află o celulă unică, cu caractere morfologice specifice. Coloniile de drojdii au diametrul între 0,2-2 cm au aspect cremos, lucioase sau mate, de culoare în general alb-crem; drojdii din g. Rhodotorula şi Sporobolomyces formează colonii colorate în roşu-portocaliu datorită pigmenţilor carotenoizi sintetizaţi intracelular. În funcţie de specie, colonia în secţiune poate avea un profil lenticular, semicircular sau triunghiular cu perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate. Caracterele morfocoloniale reprezintă criterii valoroase pentru identificarea drojdiilor. 8.4. Structura celulei de drojdie Ca şi celelalte celule eucariote, drojdiile au structura compusă din învelişuri celulare, citozol, nucleu, mitocondrii, ribozomi, vacuole şi alte organite intracelulare.

59


Fig. Organizarea internă a celulei de drojdie: cm - cicatrice mugurală G - corp Golgi L - incluziuni lipidice Lz - lizozomi Mt - mitocondrie N - nucleu n - nucleol Pc - perete celular Pl - plasmalemă RE - reticul endoplasmatic V - vacuolă In - înveliş nuclear prevăzut cu pori Ipl - învaginări plasmalemale Învelişurile celulare – peretele celular şi plasmalema – sunt structuri ce limitează celula şi determină forma de bază a acesteia şi intervin în toate procesele biologice fundamentale care se desfăşoară la nivel celular. 8.4.1. Peretele celular are o grosime cuprinsă între 150 şi 250 nm şi poate să reprezinte o pondere de 5÷15% din biomasa uscată a drojdiei. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar şi este alcătuit din 2÷3 straturi. Diferenţiat după stadiul de dezvoltare al celulelor, peretele celular se prezintă subţire şi flexibil la celulele tinere, mai gros şi rigid la celulele bătrâne. Stratul extern prezintă o suprafaţă rugoasă în care se observă cicatricile mugurale, rămase după desprinderea mugurilor de celula mamă. O celulă normală de Saccharomyces cerevisiae poate înmuguri de circa 20 de ori, aşa încât înainte de a-şi pierde viabilitatea aproape întreaga suprafaţă celulară este acoperită cu cicatrici mugurale. Din punct de vedere chimic, în componenţa stratului extern s-au descoperit manani, glucani şi chitina, care împreună reprezintă peste 90% din substanţa uscată a peretelui celular, alături de prezenţa unor cantităţi mici şi variabile de lipide, enzime, cationi şi apă. Stratul intern are o suprafaţă ornamentată cu riduri proeminente formate din fibrile constituite din molecule liniare de b-glucan ce formează complexe cu proteinele asigurând rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular. La nivelul peretelui celular sunt localizate şi enzime (invertaza, fosfataza, endoglucanaze, permeaze) implicate în biosinteza compuşilor peretelui celular şi în procese de transfer a substanţelor. Rolul esenţial al peretelui celular este cel de a asigura forma celulei şi de protecţie faţă de factorii mediului ambiant. În cooperare cu plasmalema, participă la creşterea şi reproducerea celulară, în biosinteză şi catabolism. 60


De asemenea, peretele celular este implicat în reacţiile de floculare şi aglutinare ale drojdiilor, proprietăţi tehnologice importante pentru drojdiile fermentative. Prin îndepărtarea peretelui celular prin metode enzimatice, se obţin protoplaştii folosiţi în ingineria genetică pentru obţinerea prin fuziune a hibrizilor cu importanţă practică. Prin amplasarea protoplaştilor pe mediu nutritiv în timp de 8÷12 ore are loc regenerarea peretelui celular. 8.4.2. Plasmalema (membrana citoplasmatică), reprezintă cel de-al doilea înveliş al celulei de drojdii ce aderă strâns pe toată suprafaţa sa cu peretele celular, cu care cooperează funcţional. La microscopul electronic apare ca un strat lamelar cu o grosime de circa 8÷9 nm, care delimitează protoplastul la exterior. La celulele tinere apare ca un strat omogen, neted, fără nici o învaginare, în timp ce la celulele mature în membrană se evidenţiază învaginări - similare unor şanţuri care îi măresc mult suprafaţa. Din punct de vedere chimic plasmalema este constituită din lipoproteine, în care lipidele reprezintă 23÷30%, iar proteinele 30÷33% din masa membranei, raportul proteine/lipide variază în funcţie de specie, fenofază şi procedeul de izolare utilizat, între 1,1 şi 1,4. Dintre lipidele prezente în plasmalemă predomină fosfolipidele care împreună cu sterolii şi acizii graşi nesaturaţi au un rol esenţial în procese de permeabilitate. Lipidele, cu rol de solvent hidrofobic, permit accesul în celulă al unor substanţe utile (aminoacizi nepolari, vitamine). Proteinele plasmatice sunt glicoproteine ce au o mare mobilitate în plasmalemă şi sub formă de molecule sau complexe moleculare îndeplinesc funcţii de recepţie şi transport. Conform modelului stabilit de Robertson, plasmalema prezintă două straturi lipidice în care moleculele de lipide sunt orientate cu partea hidrofobă spre interior şi cu cea hidrofilă – polară spre periferie şi sunt delimitate în ambele părţi de macromolecule proteice; particule globulare proteice se pot evidenţia şi între straturile lipidice, modificându-şi poziţia în funcţie de starea fiziologică a celulei. Plasmalema este o structură dinamică, însuşirile sale morfologice şi biochimice ca şi potenţialul său funcţional modificându-se pregnant în funcţie de stadiul ciclului celular şi de influenţa unor factori ai mediului ambiant. În primul rând este o barieră osmotică cu permeabilitate selectivă ce reglează transferul de substanţe nutritive necesare în celulă pentru a fi metabolizate, precum şi eliminarea de cataboliţi, iar prin sistemele enzimatice active la acest nivel, intervine în reglarea procesului de creştere şi înmulţire. Plasmalema interferează cu principalele căi metabolice ale celulei vii. 8.4.3. Citoplasma este constituită din citosol şi din organite citoplasmatice care sunt dispersate în el. Este componenta celulară cu cel mai înalt dinamism, structura sa fizico-chimică şi potenţialul său fiziologic modificându-se foarte rapid, corelându-se permanent cu condiţiile mediului ambiant şi cu necesităţile metabolice ale diferitelor etape de dezvoltare. Citoplasma reprezintă mai mult de jumătate din volumul total al celulei. Hialoplasma sau matricea citoplasmatică este substanţa fundamentală a citoplasmei prezentă în toate celulele vii, localizată în spaţiul celular în afara compartimentelor delimitate de membranele intracelulare. Ea este formată dintr-o fracţie solubilă (citosol), citoschelet şi o reţea de filamente care interconectează elemente de citoschelet şi organitele celulare în citoplasmă (Dan, V., 1997). 61


Citosolul este un sistem coloidal cu un conţinut de 70÷85% apă, în care substanţele componente se află sub formă de sol sau gel, formând micele coloidale. Dintre substanţele organice predomină proteinele cu rol structural sau catalitic, lipide cu rol plastic şi glucide cu rol energetic. În compoziţia chimică a citosolului intră şi acizii nuceici (ARN ŞI ADN), nucleosidele şi nucleotidele cu implicaţii majore în metabolismul energetic al celulei ca şi unii alcooli, fenoli, acizi organici, etc. În citosol, în anumite faze ale creşterii celulare, se pot acumula substanţe în exces sub forma unor incluziuni de rezervă şi anume: · Granule de glicogen, se prezintă sub forma unor corpusculi sferici, cu diametrul de circa 40 nm şi reprezintă principala substanţă de rezervă a celulei care este metabolizată când aceasta este în stare de înfometare. Se pot evidenţia prin suspendarea celulelor de drojdie în soluţie de Lugol, când glicogenul în prezenţa iodului se colorează în brun-roşcat. · Sferozomii (oleiozomii) reprezintă incluziuni lipidice acumulate în faza staţionară de creştere celulară delimitate de o membrană simplă, ce conţin fosfolipide şi acizi graşi nesaturaţi ce pot fi metabolizaţi în condiţii de malnutriţie, după ce se produce liza enzimatică a membranei. Citoplasma joacă un rol important în biochimia celulei şi se găseşte în strânsă interdependenţă cu organitele pe care le înconjoară. În acest sens, primul stadiu al respiraţiei – glicoliza – şi fermentaţia alcoolică decurg în citoplasmă, în timp ce următorul stadiu, ciclul ATC se realizează mitocondric. 8.4.4. Organitele celulare. Dintre organitele celulare cu care citosolul interacţionează în mod permanent formând o unitate morfofuncţională, fac parte următoarele: nucleul, mitocondrii, aparatul Golgi, sistemul vacuolar. 8.4.4.1. Nucleul reprezintă spaţiul genetic în care are loc stocarea, replicarea şi transmiterea informaţiei celulare şi poate fi secvenţializat în următoarele părţi: înveliş, nucleoplasmă, cromonemată, nucleol şi fus intranuclear. Are o formă sferică sau ovală, de obicei cu o poziţie excentrică în citosol şi prezintă o anvelopă nucleară în care s-au evidenţiat pori care asigură legătura între nucleu şi citosol. Învelişul nuclear conferă individualitate nucleului prin controlul riguros şi medierea schimbărilor nucleocitoplasmatice. Nucleoplasma reprezintă mediul în care sunt înglobate cromonemata, nucleolul şi fusul intranuclear. Nucleolul constă dintr-un miez denumit core, alcătuit din histone în formă de disc pe care sunt înfăşurate segmente de ADN, formând aranjamente helicoidale sau solenoide. În nucleol sunt sintetizate proteine ribozomale şi ARN ribozomal care apoi trec prin porii nucleari, în citosol. În funcţie de caracterele genetice ale speciei de drojdie, numărul de cromozomi nu depăşeşte valori de 8÷18, Saccharomyces cerevisiae are 17 cromozomi (Konovalov, 1980). 8.4.4.2. Mitocondriile sunt organitele de bază sau structurile subcelulare în care se sintetizează substanţele care înmagazinează energia chimică a celulei, de aceea, nu întâmplător sunt supranumite şi „uzine energetice celulare”. Pot ocupa până la 25% din volumul citosolului, în număr variabil, de 10÷50/celulă, într-o continuă metamorfoză, încât în unele faze fiziologice pot forma o mitocondrie unică, ramificată denumită condriom. 62


Sunt organite puternic hidratate, apa reprezentând până la 70% din masa mitocondriei, ceea ce reflectă un potenţial fiziologic particular. Substanţa uscată este constituită în principal din proteine şi lipide (peste 90%), acizi nucleici, nucleotide, ioni minerali. Proporţia diferitelor componente variază considerabil în funcţie de starea fiziologică a celulei şi de influenţa unor factori de mediu. Conform ultimelor date ştiinţifice, proteinele se află repartizate în proporţie de 5% în membrana externă, 20% în membrana internă şi 75% în condriopasmă. Mitocondriile posedă sisteme de transport specifice, diversificate, care realizează transportul unor metaboliţi esenţiali prin membranele mitocondriale ce separă condrioplasma de citosol. În mitocondrii există enzime ce realizează procese de oxidare ale compuşilor organici, enzimele lanţului respirator şi numeroase enzime oxidative, enzime ce asigură fosforilarea. 8.4.4.3. Reticulul endoplasmatic face legătura între nucleu şi vacuom şi reprezintă o reţea de vezicule, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NAD+, enzime ale lanţului transportor de electroni) şi are rol în transportul substanţelor nutritive, în declanşarea procesului de înmugurire, în biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; participă, de asemenea, la expansiunea învelişului nuclear şi a plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei. 8.4.4.4. Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alcătuit din unităţi funcţionale – corpi Golgi sau dictiozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic şi plasmalemă, între reticulul endoplasmatic şi alte organite celulare. Aparatul Golgi este aparatul de sortare şi dirijare a proteinelor şi componentelor membranare spre locul de destinaţie; au rol în expansiunea peretelui celular (Dan, V., 1999). 8.4.4.5. Ribozomii denumiţi şi granule Palade după numele cercetătorului de origine română care i-a pus în evidenţă în anul 1953, sunt particule nucleoproteice implicate în sinteza proteinelor celulare răspândiţi în citosol – citoribozomi, liberi sau în asociaţii de 5÷6 polizomi. Au în structură ARN – ribozomal şi proteine (în cazul ribozomilor de Sachharomyces cerevisiae valoarea raportului ARN/proteine variază între 1,04 şi 1,12. ARN ribozomal este implicat în procese de transcripţie a informaţiei genetice pentru biosinteza proteinelor/enzimelor, necesare celulei. 8.4.4.6. Lizozomii sunt structuri veziculare bogate în enzime: proteaze, fosfataze, lipaze (peste 40 de tipuri de enzime), active la pH = 5 cu rol în digestia unor compuşi ai celulei vii, care nu mai funcţionează eficient; în exteriorul lizozomului, în citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Enzimele lizozomale sunt în mod normal inactive, latenţa lor este dependentă de integritatea membranei lizozomale, care acţionează ca o barieră ce se interpune între enzimă şi substrat. Când sub acţiunea unor factori, de exemplu în starea de înfometare, în absenţa apei care să asigure transportul în exteriorul celulei a cataboliţilor formaţi, pH-ul în citosol scade, enzimele din lizozomi sunt activate şi celula moare prin autoliză. 8.4.4.7. Peroxizomii sunt structuri sferice sau ovale înconjurate de o membrană simplă şi cu o matrice fin granulată pe care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea celulei de drojdie la condiţii aerobe şi intervin în degradarea acizilor graşi, a 63


aminoacizilor, a apei oxigenate şi a altor substanţe (de ex. a metanolului). 8.5.

Caractere fiziologice generale ale drojdiilor

Levurile sunt heterotrofe,cu metabolism exclusiv oxidativ sau cu metabolism mixt o-xidativ şi fermentativ.Sunt aerobe şi se înmulţesc în medii acide şi neutre(pH-3 – 7,5), fiind în general acidofile. O proprietate importantă a unor drojdii cu utilizări în industria alimentară este aceea de a fermenta în condiţii de anaerobioză glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon şi produse secundare care dau aroma caracteristică produselor fermentate: C6H12O6 -----→ 2CH3-CH2-OH + 2CO2 + 117kj În condiţii de aerobioză, drojdiile asimilează glucidele transformându-le prin respiraţie la CO2 şi H2O, iar energia eliberată favorizează creşterea şi înmulţirea celulelor: C6H12O6 ———→ 6CO2 + 6H2O + 2840 kj Celulele de drojdie reacţionează activ la presiunea osmotică dată de concentraţia substanţelor dizolvate în mediul în care se află suspendate. Dacă mediul este hipotonic, cu o concentraţie a substanţelor dizolvate mai mică decât concentraţia intracelulară, apa va pătrunde în celula care îşi măreşte volumul şi dacă se prelungeşte această stare de turgescenţă, celula suferă deteriorări fizice ireversibile. În mediu hipertonic, când concentraţia mediului este superioară concentraţiei intracelulare, apa din celulă difuzează în exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece în starea de plasmoliză (Dan, V., 1999). Celulele de drojdie, în funcţie de condiţiile de cultivare si vârstă pot prezenta activitate metabolică diferenţiată concretizată prin trei stări în care se pot afla celulele si anume: · starea de metabioză (activă), în care celulele au activitate metabolică maximă. În condiţii favorabile de cultură, celulele cresc, se reproduc şi acumulează intracelular substanţe de rezervă glicogen şi trehaloză; · starea de anabioză (latentă), celulele îşi menţin caracteristicile vitale, dar nu se pot înmulţi. Această stare apare când substanţele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consumă din substanţele de rezervă intracelulare; · starea de autoliză (moartea fiziologică). Se produce o solubilizare a compuşilor intracelulari sub acţiunea enzimelor proprii celulei. 8.6.

Reproducerea drojdiilor

Forma generală de reproducere a drojdiilor este înmugurirea vegetativă (calea asexuată) care are la bază un proces simplificat de mitoză, când din celula mamă se formează noua celulă, identică din punct de vedere genetic.

64


Unele drojdii au capacitatea de a se înmulţi prin sporulare, ce poate avea loc pe cale asexuată (prin procesul de meioză) şi pe cale sexuată (prin procese de copulare). Sporularea este condiţionată genetic are loc în anumite condiţii de mediu. 8.6.1. Reproducerea prin înmugurire. Înmugurirea are loc când drojdiile se află în condiţii optime de mediu (nutrienţi, pH, temperatură). O condiţie necesară pentru înmugurire este aerarea corespunzătoare a mediului, deoarece în prezenţa oxigenului din aer are loc asimilarea eficientă a nutrienţilor cu recuperarea energiei potenţiale a acestora, energie folosită de celulă în creştere pentru procese de biosinteză, consumatoare de energie. În aceste condiţii, în prima etapă celula de drojdie creşte în dimensiuni în urma creşterii coordonate a compuşilor intracelulari; creşterea în volum fiind mai rapidă decât a suprafeţei învelişurilor celulare, are loc o înmuiere enzimatică a peretelui şi apare o protuberanţă - mugurele. Între celula parentală şi mugure se perfectează un canal - diverticulum prin care se transferă în celula nou formată material nuclear şi citoplasmatic (cariokineză şi citokineză). Când celula fiică va conţine toate componentele şi organitele necesare unei vieţi independente, la nivelul canalului se formează un perete inelar cu o concentraţie ridicată în chitină, ce se dezvoltă centripet până are loc obturarea şi separarea (Dan, V., 1999).

Fig. 2. Înmugurirea la drojdii: 1- mugure; 2- canal de legătură; 3- nucleu; 4- vacuolă adiacentă nucleului; 5- nucleol. Celula fiică, cu activitate metabolică independentă, poate rămâne ataşată de celula mamă formând asociaţii sau pseudomicelii, sau se separă de celula parentală, iar la locul de desprindere rămâne vizibilă cicatricea mugurală. În condiţii optime de viaţă, o celulă de drojdie poate forma 9÷42 noi celule apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. 8.6.2.Reproducerea prin sporulare. Sporularea are la bază procesul de meioză, prin care numărul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumătate, iar celulele formate primind un singur rând de cromozomi sunt haploide. Sporularea este iniţiată după circa 10 ore de expunere pe mediul de sporulare şi este mai intensă după 24÷48 ore. În timp, celula generatoare de spori denumită şi asc se poate rupe sau să se solubilizeze prin autoliză şi ascosporii liberi, în condiţii favorabile germinează şi formează prin reproducere vegetativă clone haploide. Ascosporii haploizi pot fi de tip “a” sau “α” în funcţie de natura feronomilor specifici; în condiţii favorabile, celulele ajunse la maturitate fiziologică denumite şi gameţi pot să fuzioneze printr-un proces de conjugare pentru a forma din nou celule diploide. Dacă are loc conjugarea 65


între celule de acelaşi tip “a” sau “α” celulele diploide sunt viabile, dar ascosporii formaţi îşi pierd această calitate. Sub formă de ascospori drojdiile rezistă timp îndelungat în sol, în condiţii de uscăciune, în schimb termorezistenţa lor este apropiată cu cea a celulelor vegetative (inactivare la 75÷850C). Meioza este importantă din punct de vedere practic pentru că se pot realiza copulări dirijate cu obţinerea unor hibrizi ce prezintă proprietăţi superioare preluând de la celulele parentale caractere deosebite.

66


CURS nr. 9 Clasificarea generală a drojdiilor şi principalele specii implicate în contaminarea alimentelor Levurile ocupă un loc esenţial în producerea unor bunuri alimentare, ele fiind agenţii multor fermentaţii utilizate în fabricarea pâinii, berii, alcoolului, brânzeturilor. Ele de asemenea pot contamina alimentele şi acţionează asupra lor, degradându-le, devenind improprii pentru consumul uman. Acţionează în principal asupra alimentelor acide, glucidice şi alcoolizate. Deşi nu sunt agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare prezenţa şi dezvoltarea lor pe unele alimente poate creea condiţii de multiplicare a unor bacterii toxigene. Potrivit Codului Internaţional de Nomenclatură Botanică tulpinile de drojdii sunt grupate în specii, speciile în genuri, iar genurile în subfamilii şi familii. O clasificare de referinţă este cea propusă de Lodder şi Kreger van Rij (1952) care clasifică drojdiile în 38 genuri şi 349 de specii de drojdii, iar clasificarea cea mai recentă şi cuprinzătoare aparţine lui Kreger van Rij (1984) (60 genuri cu aproximativ 500 de specii). Din această clasificare se vor menţiona genuri şi specii cu implicaţii în industria alimentară, în calitatea lor de agenţi ai fermentaţiei alcoolice sau de alterare a produselor alimentare. Principalele genuri şi specii cu implicaţii în microbiologia alimentară sunt: 9.1. Genul Saccharomyces Cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fermentativă. Se înmulţesc prin înmugurire şi sporulare, producând 1-4 ascospori. Cuprinde numeroase specii folosite în industria berii, vinului şi pâinii. Stau la originea creşterii (dospirii) pastei de făină. Ele produc aproape în totalitate dioxidul de carbon necesar acestei creşteri, datorită vitezei lor mari de a fermenta glucoza. Levurile din genul Saccharomyces sunt prezente de asemenea frecvent pe fructe si legume. Ele actioneaza asupra produselor numai când vin in contact cu sucul celular dulce, ceea ce este posibil în cazul zdrobiri şi lezării integrităţii lor împreună cu diferite alte levuri (Candida, Hansenula, Kloeckera, Torulopsis s.a). Activitatea lor se manifestă în primul rând prin fermentaţia alcoolică a glucidelor şi prin înmuierea ţesuturilor datorită enzimelor pectinolitice. Folosesc ca sursă de carbon acidul malic, caracteristică care le face posibilă dezvoltarea şi pe fructele acide. S. cerevisiae – este o drojdie de fermentaţie superioară folosită la fabricarea alcoolului şi la obţinerea drojdiei de panificaţie. S.cerevisiae (varietăţile S.ellipsoidus. S.turbidans, S.uvarum, S.minor) fac parte din microflora naturală prezentă pe cereale şi 67


deci şi în făină. Din biomasa de celule obţinută în mediul nutritiv şi în condiţii de aerare, prin procedee biotehnologice se pot obţine enzime (invertază), vitamine din grupul B, interferon ş.a. S.cerevisiae subsp. ellipsoides (S.vini) - drojdii de fermentaţie (drojdii de cultură), fac parte din microflora levuriană a strugurilor şi contribuie la formarea vinului. La aceasta se adaugă S. italicus, S.florentinus, S.chevalieri, S.fructanu cu rol în formarea substanţelor de aromă. În condiţii industriale, o dată cu prelucrarea strugurilor şi obţinerea mustului, are loc o creştere importantă a numărului de drojdii ale genului Saccharomyces. S. cerevisiae subsp. ellipsoideus (S.vini) este drojdia mereu prezentă şi predominantă în toate musturile,asociată cu Kloeckera apiculata (mustul din struguri roşii) sau Torulopsis bacillaris (în mustul din struguri albi). S. cerevisiae drojdie de fermentaţie superioară, se utilizează şi la fabricarea berii. Fermentaţia înaltă se realizează la 18 – 220C, folosind suşe de S. cerevisiae, care nu floculează. S.bayanus cu var.bayanus şi var.oviformis (drojdie de cultură) - este folosită în obţinerea şampaniei. S.uvarum (carlsbergensis) – drojdie de fermentaţie inferioară se foloseşte la fabricarea berii prin inocularea mustului răcit şi aerat. Fermentaţia joasă este cea mai răspândită şi are loc la 7 – 150C. La finele fermentaţiei S.carlsbergensis, floculează şi sedimentează. S.pasteurianus, S.diastaticus - drojdii sălbatice pot produce fermentări anormale ale berii, care schimbă gustul şi produc tulbureală. S.florentinus, S.acidifaciens - în cazul băuturilor nealcoolice produc o fermentaţie rapidă. S.intermedius; S.bailli, S.hisporus - în cazul băuturilor nealcoolice produc o fermentaţie lentă. 9.2. Genul Candida este un gen bogat în specii (81), eterogen din punct de vedere morfologic şi fiziologic şi care a suferit în timp multe modificări taxonomice. Genul Candida – cuprinde specii patogene pentru om, animale şi plante cât şi specii utile pentru industria alimentară: Candida mycoderma - denumită şi floarea vinului se dezvoltă în prezenţa aerului la suprafaţa lichidelor slab alcoolice formând un voal caracteristic. Prin oxidarea alcoolului la dioxid de carbon şi apă are loc deprecierea vinului, berii. În urma dezvoltarii în exces produce filanţa verzei şi saramurii. Candida kefyri - este utilă la fabricarea chefirului, Candida krusei – determină fermentarea boabelor de cafea şi cacao. Candida kefyri – este folosită la fabricarea chefirului. Candida pulcherima – este prezentă în microflora levuriană a strugurilor, cu o frecvenţă mai redusă pe boabele de struguri ajunse la maturitatea fiziologică. Candida parapsilopsis - în cazul băuturilor nealcoolice produce o fermentaţie rapidă. Candida tropicalis, albicans, krusei - pot fi des implicate în contaminarea laptelui, ele putând infecta ţesuturile ugerului şi apoi să fie excretate prin lapte în număr mare. 68


Candida spp - pot produce de asemenea fermentări anormale ale berii, care schimbă gustul şi produc tulbureală. Concomitent cu mucegaiurile, pe suprafaţa brânzeturilor se pot dezvolta drojdii din genul Candida ce dau modificări de culoare. Ele pot fi prezente frecvent pe fructe si legume. Unele specii din genurile Candida, actioneaza împreună cu diferite specii de Saccharomyces şi Schizosaccharomyces şi folosesc ca sursă de carbon acidul malic care le face posibilă dezvoltarea şi pe fructele acide. 9.3. Genul Rhodotorula include celule cu formă oval-cilindrică, sunt drojdii oxidative şi pot sintetiza pigmenţi carotenoizi care imprimă coloniei culoarea roşucărămiziu. Rhodotorula glutinis şi Rhodotorula mucilaginosa - predominante pe alimente: pui, peşte, creveţi, pe suprafaţa untului, fiind specii psihrotrofe. Rhodotorula spp. - pot fi prezente frecvent pe fructe si legume. Odată cu dezvoltarea, unele specii de levuri din genul Rhodotorula formează pigmenţi şi colorează zonele alterate. Levurile din genul Rhodotorula pot izolate de asemenea din lapte dar şi de pe suprafaţa brânzeturilor cărora le produc modificări de culoare. 9.4. Genul Kloeckera – diferitele specii fac parte din microflora levuriană a strugurilor. Saccharomyces cerevisiae subsp. ellipsoideus(Saccharomyces vini) este drojdia mereu prezentă şi predominantă în toate musturile, asociată cu Kloeckera apiculata (mustul din struguri roşii). K.apiculata, K.magna - prin activitatea lor enzimatică intervin în formarea vinului. În anumite condiţii pot produce defectul de refermentare a vinurilor. Kloeckera spp - drojdiile sălbatice pot produce fermentări anormale ale berii care schimbă gustul şi produc tulbureala. Levurile din genul Kloeckera pot fi prezente frecvent pe fructe si legume. Unele specii din genul Kloeckera, actionează împreună cu diferite specii de Saccharomyces şi Schizosaccharomyces şi folosesc ca sursă de carbon acidul malic care le face posibilă dezvoltarea şi pe fructele acide. De asemenea pot fi întâlnite pe fructele dulci. 9.5. Genul Brettanomyces cuprinde drojdii de formă oval cilindrică, în aerobioză pot să producă prin fermentarea lentă a glucozei, alcool etilic 11-12% alcool, acid acetic, citric, lactic, succinic. Dau alterări ale berii, vinului (tulburare, iz de şoarece) cu formare de esteri şi substanţe cu gust amar, a băuturilor nealcoolice, a murăturilor. 9.6. Genul Debaryomyces cuprinde drojdii de formă oval cilindrică, poate produce mucus la suprafaţa batoanelor de salam, se dezvoltă la suprafaţa brânzeturilor determin ând modificări de culoare, iaurtului şi dau alterări ale sucurilor concentrate de portocale. 9.7. Genul Hanseniaspora include drojdii cu proprietăţi fermentative reduse (50 alcool), cu formă apiculată şi sunt răspândite în microbiota fructelor citrice, a smochinelor; intervin în fermentarea naturală a boabelor de cacao. Hanseniaspora apiculata - poate reprezenta până la 90% din microbiota mustului şi îşi reduce viteza de fermentare la acumularea de 5-7% alcool. Se poate dezvolta în vin fiind responsabilă pentru formarea de acizi volatili, esteri care dau un gust amar, 69


străin vinului. Prin contaminarea vinului folosit la obţinerea şampaniei la sticle, Hanseniaspora apiculata poate forma un sediment aderent la sticlă şi care se îndepărtează greu la degorjare. 9.8. Genul Pichia conţine 35 de specii. Au o slabă activitate fermentativă, sunt drojdii peliculare; prin dezvoltare şi formare de voal produc deprecierea vinului, a berii. Se pot izola de pe suprafaţa peştilor şi a creveţilor, din saramura măslinelor conservate şi pot produce alterări ale produselor vegetale murate. Pichia membranaefaciens – drojdie nefermentativă pot să determine în unele cazuri tulbureala siropurilor concentrate. 9.9. Genul Saccharomycodes Saccharomycodes ludwigii - prezintă forme apiculate sau oval alungite, poate fi agent de alterare a musturilor şi sucurilor de fructe şi dau tulburarea cidrului, a vinurilor semidulci. 9.10. Genul Saccharomycopsis Saccharomycopsis fibuligera - prezintă celule ovale, fermentează lent glucoza, zaharoza, maltoza, asimilează amidon, alcool etilic, acid lactic etc.; unele tulpini sunt folosite pentru producerea de glucoamilază sau pentru obţinerea de drojdii furajere. 9.11. Genul Schizosaccharomyces cuprinde drojdii de formă cilindrică, ovală. Schizosaccharomyces pombé - este agent al fermentării sucului de trestie de zahăr şi folosită pentru obţinerea romului şi a băuturii arak. S. pombe şi S. bacilli - prin activitatea lor enzimatică intervin în formarea vinului. În anumite condiţii pot produce defectul de refermentare a vinurilor. Drojdiile din genul Schizosaccharomyces pot fi prezente frecvent pe fructe si legume. Folosesc ca sursă de carbon acidul malic, aspect care le face posibilă dezvoltarea şi pe fructele acide. 9.12. Genul Torulopsis - cuprinde specii slab alcooligene, osmotolerante, psihrotrofe şi sulfitorezistente. Prezintă celule sferice, ovale sau cilindrice. Specii ale genului întâlnite în mustul de struguri, au putere alcooligenă redusă. Torulopsis bacillaris,Torulopsis stellata – se întâlnesc frecvent în mustiul de struguri. Pot produce alterări ale laptelui concentrat, a siropurilor, a sucurilor. 9.13. Genul Torrula Torrula nigra - poate produce unele defecte ale laptelui crud şi pasteurizat cum ar fi laptele negru – se caracterizează prin apariţia unor pete negre. Torrula amara - gustul amar. Torula kefirii – drojdie lactică care pe lângă Streptococii lactici şi Lactobacilii lactici, se utilizează la fabricarea Kefirului, băutură lactată acidulată, puţin alcologazoasă. Intră în componenţa maialei, cu rolul de fermentare a lactozei, dând alcoolul etilic şi CO2 . 9.14. Genul Zygosaccharomyces cuprinde drojdii cu celule ovale, cu proprietăţi fermentative, osmotolerante. Pot produce fermentarea mierii, a siropurilor concentrate de zahăr cu formare de alcool etilic, acid acetic, dioxid de carbon. Z.bailii var. osmophillus şi Z.rouxii – produc fermentarea siropurilor concentrate. Alterarea se manifestă printr-un gust alcoolizat şi câteodată cu degajare intensă 70


de gaze,care pot produce bombarea ambalajului. Acţiunea drojdiilor se manifestă când T≤350C. În unele cazuri fermentaţia alcoolică este însoţită de producerea de acizi volatili, formarea tulburelii şi apariţia depozitelor, odată cu apariţia unui gust şi miros anormal.

71


CURS nr. 10 MUCEGAIURI Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, diferenţiate din punct de vedere morfologic şi care se reproduc prin spori formaţi numai pe cale asexuată sau pe cale mixtă (asexuată şi sexuată). 10.1. Răspândire şi rol Mucegaiurile sunt foarte răspândite în natură, habitatul preferat şi cel mai populat este solul, în special în stratul superficial, care le asigură condiţii de creştere şi supravieţuire. Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile participă la transformarea unor compuşi organici (celuloza, hemiceluloze, substanţe pectice, amidon, lipide) în compuşi mai simpli şi sunt consideraţi agenţi de putrezire. Mucegaiurile participă astfel la circuitul carbonului în natură şi îmbogăţesc solul în substanţe cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de către plante. Din sol, prin intermediul factorilor naturali, sporii de mucegai sunt antrenaţi pe calea aerului la distanţe foarte mari, ceea ce asigură răspândirea nelimitată de graniţe geografice. În aer, mucegaiurile sub formă de spori sau hife vegetative pot supravieţui un timp îndelungat, iar în absenţa curenţilor de aer se depun cu o viteză ce atinge valori de 3 cm/sec. În apă prezenţa mucegaiurilor este ocazională, apa fiind un mediu prin care se poate face răspândirea sporilor. Creşterea mucegaiurilor în apă este dependentă de conţinutul acestora în compuşi organici şi poate avea loc numai în condiţii de aerare. Sporii de mucegai se întâlnesc frecvent la suprafaţa plantelor, în tractul digestiv, în special la ierbivore. În industria alimentară activitatea de biodeteriorare este nedorită deoarece fungii cauzează pierderi prin mucegăirea seminţelor alimentelor. Ca efect secundar este formarea de micotoxine, de către unele mucegaiuri, încât alimentele devin inutilizabile. În afara mucegaiurilor saprofite – agenţi ai putrezirii, se întâlnesc mucegaiuri patogene care pot parazita: plante, animale, peşti şi insecte. Mucegaiurile sunt frecvent întâlnite în microbiota plantelor, pe suprafaţa fructelor şi legumelor. Dacă produc îmbolnăviri la plante poartă denumirea de mucegaiuri fitopatogene şi sunt responsabile pentru aproximativ 70% din totalul îmbolnăvirilor întâlnite la cereale şi legume. Dintre mucegaiurile fitopatogene se pot enumera cele care produc boli ca mălura, rugina, tăciunele etc. ale plantelor industriale. La om şi animale mucegaiurile patogene produc un număr mai redus de îmbolnăviri, se dezvoltă pe piele, unghii, păr. Un număr mic de mucegaiuri pot produce îmbolnăviri interne atunci când sporii sunt inhalaţi (pe cale respiratorie) dând micoze (de exemplu, Aspergillus fumigatus produce aspergillom pulmonar).

72


10.2. Rolul mucegaiurilor în industrie În afară de rolul important al mucegaiurilor în natură, în industria alimentară, culturi fungice selecţionate se pot folosi la fabricarea brânzeturilor – tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. Cu ajutorul mucegaiurilor pe cale biotehnologică se pot obţine compuşi deosebit de valoroşi: - antibiotice: peniciline cu Penicillium chrysogenum, cephalosporine (Cephalosporium), griseofulvine (Penicillium griseofulvum) acidul fusidic cu Fusidium coccinenum şi antibiotice active faţă de bacterii Gram pozitive cu Mucor ramannianus; - acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); - vitamine (B2, ergosterol – provitamina D2); - enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). Mucegaiurile se mai pot folosi pentru îmbogăţirea în proteine a făinurilor vegetale şi ca agenţi de depoluare a apelor reziduale. În tehnologiile moderne se obţin SCP cu fungi din care: Fusarium graminearum în Marea Britanie şi specii de Paecilomyces în procesul Pekilo în Finlanda unde sunt cultivate pe leşii sulfitice şi deşeuri din industria hârtiei. 10.3. Caractere morfologice Mucegaiurile se răspândesc în natură sub formă de spori rezistenţi la uscăciune, formă în care se menţin în stare viabilă mai mulţi ani. Dacă un astfel de spor ajunge pe suprafaţa unui mediu favorabil pentru creştere, cu o cantitate suficientă de apă liberă care să-i permită absorbţia substanţelor nutritive, în primul stadiu care poate să dureze 3-4 ore, are loc absorbţia apei şi activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale şi formarea tuburilor vegetative numite hife sau thal. Hifele cresc numai prin vârf şi deci au o creştere apicală, după care se ramifică. Hifele se extind pe suprafaţa mediului, se diversifică şi îndeplinesc anumite funcţii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta şi în profunzimea mediului realizând absorbţia nutrienţilor şi au rol în susţinere; hifele de răspândire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formează hifele reproducătoare, generatoare de spori, diferenţiate în funcţie de gen şi specie. Totalitatea hifelor vegetative şi reproducătoare alcătuieşte miceliul. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid în condiţii favorabile, astfel în interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formează colonii vizibile diferenţiate. În cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu aseptat, coloniile se dezvoltă rapid, sunt extinse, cu tendinţa de a ocupa tot spaţiul disponibil, au aspect pâslos şi culori alb, bej, cenuşiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formează colonii cu o creştere radială limitată şi culoare ce diferă de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuanţe specifice în funcţie de gen şi specie. Când sporii de mucegai ajung la suprafaţa unui mediu nutritiv lichid, prin întrepătrunderea hifelor vegetative se formează o peliculă denumită dermă, la 73


început netedă, în timp, prin creşterea suprafeţei derma se cutează şi la suprafaţă se dezvoltă hifele reproducătoare, se produce sporularea şi colorarea specifică. Prin introducerea sporilor de mucegai în mediu lichid şi cultivarea pe agitator rotativ, ca rezultat al agitării, mucegaiurile formează prin creştere vegetativă, sfere vizibile, întotdeauna de culoare albă. 10.4. Structura mucegaiurilor Mucegaiurile au la bază celula de tip eucariot ce include toate organitele descrise la celula de drojdie. Spre deosebire de drojdii, peretele celular este mai gros şi în afară de α şi β-glucani se găseşte în cantitate mare celuloza. Celula poate conţine 1-2 nuclei cu câte 2-4 cromozomi fiecare. În funcţie de caracterele genetice pot fi: - mucegaiuri inferioare – sunt monocelulare şi se dezvoltă sub forma unei celule gigantice ce prezintă mai multe ramuri. În aceste celule migrează liber nucleii citoplasmatici şi organitele intracelulare. În cazul în care un spor ajunge pe un mediu nutritiv, atunci prin creştere are loc germinarea sporului care constă într-o creştere în volum a acestuia producându-se hife vegetative. Prima dată se formează hife de extindere care se dezvoltă în paralel de-a lungul mediului nutritiv. Se formează apoi hife submerse ce se dezvoltă în profunzimea mediului realizând absorbţia nutrienţilor şi au rol de susţinere. Totalitatea acestor hife de extindere şi submerse formează miceliul vegetativ. Odată cu creşterea şi dezvoltarea miceliului vegetativ încep să apară hife aeriene care sunt şi reproducătoare; - mucegaiuri superioare sunt pluricelulare şi au miceliu septat, aceasta pentru că la anumite distanţe apar pereţi despărţitori (septum) prevăzut cu un por central prin care se poate face transfer citoplasmatic. 10.5. Caractere fiziologice generale Mucegaiurile sunt microorganisme uşor adaptabile, deoarece au capacitatea de a forma enzime induse în funcţie de natura substratului pe care se află, încât produc degradarea atât a produselor alimentare cât şi a fibrelor textile, a cauciucului, betonului etc. Mucegaiurile sub formă de hife sau spori sunt foarte rezistente la uscăciune şi se menţin în stare latentă de viaţă un timp îndelungat. Ele sunt puţin pretenţioase la cantitatea de apă liberă prezentă în produs, de aceea ele pot produce mucegăirea produselor care se conservă prin uscare numai când acestea încep să absoarbă apă din mediul ambiant. În raport cu oxigenul, mucegaiurile sunt microorganisme aerobe deci necesită pentru creştere prezenţa oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat în mediul lichid. Mucegaiurile se pot dezvolta în limite largi de pH (1,5÷9) cu o valoare optimă în domeniul acid (pH = 5,5÷6). Mucegaiurile sunt microorganisme mezofile cu temperaturi optime de creştere la 25ºC, un număr restrâns sunt termofile – cele patogene au temperatura optimă la 37ºC, iar altele sunt adaptate la temperaturi scăzute (0÷3ºC). Rezistenţa termică a 74


mucegaiurilor sub formă de hife sau spori este mică, majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80ºC, cei mai rezistenţi spori sunt distruşi la 88ºC în 10 minute. 10.6. Reproducerea mucegaiurilor Mucegaiurile se înmulţesc pe cale vegetativă şi prin sporulare. Reproducerea vegetativă se realizează prin intermediul fragmentelor de hife rupte sub acţiunea unor factori mecanici atunci când acestea conţin cel puţin o celulă. Fragmentele hifale chiar când, de exemplu în cazul mucegaiurilor superioare conţin mai multe celule, vor forma o singură colonie. Din acest motiv la determinarea numărului de mucegaiuri din diferite produse exprimarea se face în unităţi formatoare de colonii (UFC). Fungii filamentoşi pot să crească în dimensiuni fără să modifice raportul între volumul de citoplasmă şi suprafaţa hifelor, astfel încât schimbul de substanţe între miceliu şi mediu implică transport numai pe distanţe scurte. Se cunosc 3 mecanisme prin care are loc reglarea creşterii miceliului şi anume: prin reglarea extinderii hifelor, prin iniţierea de ramificaţii şi prin distribuirea spaţială a hifelor. Timpul de dublare a miceliului ca şi intervalul între cicluri succesive de formare a septumului depind de specie şi condiţii de cultură şi poate dura aproximativ 2 ore (Aspergillus nidulans). Se apreciază că, pentru mitoza completă a nucleilor la mucegaiuri sunt suficiente 10 minute, iar intervalul între mitoză şi apariţia septumurilor este de 20÷40 minute. Reproducerea prin sporulare. Este forma cea mai răspândită la mucegaiuri şi poate avea loc pe cale asexuată sau pe cale mixtă.

75


CURS nr. 11 CLASIFICAREA GENERALĂ A MUCEGAIURILOR ŞI PRINCIPALELE SPECII IMPLICATE ÎN CONTAMINAREA ALIMENTELOR Mucegaiurile reprezintă un grup taxonomic complex, motiv pentru care clasificarea acestora este în continuă transformare. Numărul posibil de specii ce ar putea exista în natură este apreciat la aproximativ 250.000. Mucegaiurile de interes alimentar sunt grupate în 20 de genuri şi aproximativ 1000 de specii. Clasificarea are la bază anumite criterii morfologice, structură, caractere coloniale, pigmentogeneză, integrate cu date fiziologice şi genetice. Cele mai importante sub raportul impactului pe care acestea îl au asupra consumatorilor sunt mucegaiurile toxicogene. Ele produc intoxicaţii denumite micotoxicoze cu o perioadă de incubare prelungită încât este dificilă asocierea îmbolnăvirii, cu alimentul incriminat. Mucegaiurile pot forma colonii la suprafaţa produsului şi în etapa de creştere colonială, o dată cu apariţia sporilor, pot să sintetizeze produşi secundari de metabolism de natură hidrocarbonată cu o toxicitate deosebit de ridicată. Omul poate să sufere intoxicaţii prin consum de alimente mucegăite, intoxicaţii care se manifestă prin îmbolnăviri ale diferitelor organe (ficat, rinichi etc.). Dintre bolile produse prin consum involuntar de micotoxine fac parte: ergotismul, aleucie toxică alimentară (ATA), hepatocarcinogeneza, nefrotoxicoze, sindromul hemoragic, poliurie ş.a. Mucegaiurile fac parte din diviziunea Eumycota cu următoarele 5 subdiviziuni: 11.1. MASTIGOMYCOTINA - cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin oospori, pe cale sexuată, cu următoarele genuri: 11.1.1. Genul Peronospora – cu specii fitopatogene, produc mana viţei de vie; 11.1.2. Genul Phytium – include agenţi ce produc putrezirea plantelor tinere de grâu; 11.1.3.Genul Phytophtora – cu specia Phytophtora infestans, agentul producător al manei la cartofi. 11.2. ZYGOMYCOTINA – cuprinde mucegaiuri inferioare cu miceliu aseptat care se reproduc prin zigospori pe cale sexuată şi prin sporangiospori şi chlamidospori pe cale asexuată. 11.2.1. Genul Mucor (88 specii) – se caracterizează prin formarea de sporangiospori în stilosporange, la maturitate prin ruperea membranei şi eliberarea sporilor rămâne la baza columelei, un collar. În funcţie de specie, columela poate avea dimensiuni şi forme diferite. Dintre speciile mai importante ale genului fac parte: Mucor mucedo - denumit şi mucegaiul alb al pâinii, Mucor racemosus- agent de putrezire a fructelor şi legumelor, 76


Mucor pussillus şi Mucor miehei - specii selecţionate pentru obţinerea de proteaze cu acţiune similară cu cea a cheagului animal. Se utilizează pentru obţinerea de enzime de natură microbiană cu acţiune coagulantă în vederea obţinerii brânzeturilor. Unele specii din genul Mucor produc tulbureala sucurilor nealcoolizate 11.2.2. Genul Rhizopus (11 specii) se caracterizează prin stilosporange de dimensiuni mari, cu columelă semisferică, fără collar după ruperea membranei sporangelui. Sporangiosporii se dezvoltă în mănunchi dintr-un punct în care se dezvoltă rhizoizi - hife de susţinere cu rol absorbant. Extinderea coloniei are loc rapid ca urmare a formării unor lăstari micelieni denumiţi stoloni. Rhizopus stolonifer - este specia cea mai răspândită pe toate produsele alimentare. Este un important agent de mucegăire al fructelor şi legumelor chiar dacă sunt păstrate la temperatura de refrigerare: pere, piersici, zmeură, fragi. Miceţii din genul Rhizopus, pot produce unele defecte ale laptelui crud şi pasteurizat cum ar fi laptele negru care se caracterizează prin apariţia unor pete negre. Analizând procentual proporţia diferitelor genuri de fungi izolaţi din lapte crud de vacă 16% din numărul probelor examinate au fost contaminate cu Rhizopus spp. De asemenea miceţii din genul Rhizophus mai pot fi întâlniţi pe suprafaţa untului şi pe suprafaţa ambalajelor care pot să constituie o importantă sursă de contaminare prin contact, atât a materiei prime în prima fază a procesului tehnologic cât şi a produsului finit. Unele specii de miceţii din genul Rhizopus produc micotoxine ce dau stări de oboseală şi poliurie. 11.2.3. Genul Thamnidium – se caracterizează prin formarea de sporangiofori terminaţi cu un stilosporange mare sub care se dezvoltă sporangiofori scurţi purtători de sporangioli cu un număr mic de sporangiospori. Thamnidium elegans - produce mucegăirea produselor conservate prin refrigerare. Thamnidium spp – miceţii pot fi întâlniţi pe suprafaţa carcaselor bine zvântate (uscate), când alături de alţi miceţi, precum şi levuri iau locul bacteriilor. Acest lucru se întâmplă dacă UR a atmosferei din depozitul frigorific este <80% si daca, aerul se misca rapid pe suprafata carnii, , efectul fiind formarea unei pelicule uscate şi dure. 11.2.4. Genul Absidia - prezintă sporangi mici cu columelă de formă conică. Unele specii sunt termofile şi produc îmbolnăviri la animale şi om. Poate produce mucegăirea porumbului şi elaborează toxine. Mucegaiurile din genul Absidia pot constitui o componentă a microflorei mustului, respectiv a vinului. De pe struguri mucegăiţi, ajung în must spori, fragmente de mucegaiuri printre care şi Absidia, etc., în număr mai mare când mustul provine din struguri deterioraţi fizic şi care prin eliberarea de suc, au favorizat dezvoltarea acestor microorganisme înainte de recoltare.Vinurile obţinute din struguri mucegăiţi sunt vinuri de calitate inferioară, care îşi pierd aroma, care casează. 11.3. ASCOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se reproduc pe cale asexuată şi sexuat prin ascospori.

77


11.3.1. Genul Byssochlamys produce asci cu 8 ascospori termorezistenţi şi produc alterarea alimentelor conservate cu acizi. Byssochlamys fulva şi Byssochlamys nivea - produc alterarea conservelor de fructe. 11.3.2. Genul Monascus Monascus ruber - este folosit pentru obţinerea de coloranţi roşii de uz alimentar. 11.4. BASIDIOMYCOTINA cuprinde mucegaiuri superioare cu ciclu de viaţă mai evoluat şi care se reproduc pe cale sexuată prin bazidiospori. 11.4.1. Genul Puccinia - cuprinde specii fitopatogene agenţi ai ruginii cerealelor. Boala se întâlneşte la grâu, secară, porumb, ovăz, unele plante industriale, medicinale şi la arbori şi se manifestă prin pierderi importante la producţia de cereale. Plantele atacate de agenţii ruginii pierd multă apă prin transpiraţie şi prezintă o creştere a permeabilităţii celulare şi o scădere a intensităţii procesului de fotosinteză, încât substanţele nutritive din boabe se reduc. Modificările fiziologice influentează negativ dezvoltarea plantelor, tulpinile şi spicele sunt mai mici, ca şi numărul boabelor din spic. Boabele sunt mai uşoare, conţin cantităţi mai reduse de proteine glutenice şi de poliglucide, devin sistave, au o culoare galben-deschisă, dau o faină de calitate inferioară, cu proprietăţi tehnologice nesatisfacătoare. 11.4.2. Genul Ustilago - produc la grâu şi porumb boala denumită popular tăciune. Pătrunderea lor în bob depinde de condiţiile oferite de bob. Bobul oferă condiţii favorabile pătrunderii microorganismelor în perioada de maturizare când ploile alternează cu zilele însorite. Ustilago tritici – provoacă la grâu boala numită şi tăciunele zburător şi determină pagube foarte mari. Ea afectează şi planta şi spicul. Plantele infectate nu se dezvoltă normal, rămân mici şi formează spicul înaintea celor sănătoase. După înspicare, mucegaiul distruge ovarele, staminele şi celelalte părţi ale spicului, în afara axei principale. Spicul de grâu parazitat are aspectul unei mase negricioase, pulverulente, formate din chlamidospori şi se aseamană cu unul ars de foc. Chlamidosporii plantelor bolnave sunt luaţi de vânt şi se depun pe spicele plantelor sănătoase, unde se dezvoltă pe stigmatele florilor de grâu, formează miceliu care pătrunde prin pereţii ovarului şi ajunge în ovule, unde un timp se dezvoltă împreună cu embrionul şi endospermul. Sămânţa se dezvoltă normal, încât în momentul recoltării boabele infectate nu se deosebesc de cele sănătoase. Aceste boabe cu aspect normal, când sunt însămânţate, germinează, formează plantula de grâu, dar odată cu aceasta se dezvoltă şi miceliul de mucegai. Miceliul invadează tulpina şi ajunge în florile spicului. Miceliul se fragmentează în celule care se transformă în spori negri, iar din spic rămâne întreg numai rahisul. Ustilago maydis – provoacă la porumb boala numită şi tăciunele zburător. Pe plantele parazitate apar tumorete de diferite dimensiuni, localizate de obicei pe ştiulete, pe care micetul îl distruge în totalitate. În locul boabelor se dezvoltă nişte formaţiuni globuloase alb-cenuşii pline cu o masă pulverulentă de chlamidospori sferici negricioşi. Tumoretele negricioase pline cu spori se pot forma şi pe spicul tulpinii, nodurile şi rădăcinile plantei de porumb. Ele ating dimensiuni de 10-15 cm diametru, sunt acoperite de o membrană 78


subţire care se rupe uşor şi pun în libertate Chlamidosporii care urmează un ciclu de dezvoltare ca cel descris la grâu. Taciunele apare şi la orz, ovăz şi la unele ierburi furajere. Este o boală gravă a cerealelor şi produce pierderi mari de recoltă. 11.5. DEUTEROMYCOTINA cuprinde numeroase genuri şi specii de mucegaiuri superioare care se reproduc prin conidiospori şi la care nu există cale sexuată de sporulare sau aceasta nu a fost încă evidenţiată. 11.5.1. Genul Aspergillus (132 specii) cuprinde numeroase specii cu importanţă biotehnologică. Se caracterizează prin formarea de conidiofori drepţi, neramificaţi care poartă capul conidial alcătuit dintr-un suport anatomic denumit veziculă pe care se dezvoltă celulele conidiogene – respectiv fialide, generatoare de lanţuri lungi de fialospori. Specia Aspergillus niger formează colonii radiale de culoare brun-negru, prezintă două rânduri de fialide pe toată suprafaţa veziculei, capul conidial este sferic. Numeroase tulpini selecţionate sunt folosite pentru obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucozoxidaze, invertaze, enzime pectolitice sau pentru obţinerea acizilor organici: acid citric, acid lactic, gluconic. Specia Aspergillus oryzae formează colonii de culoare bej-oranj cu conidiofori drepţi şi cap conidial sferic cu un singur rând de fialide. Este numit pe drept cuvânt „arsenalul enzimelor” deoarece se cunosc peste 200 de enzime elaborate de mucegai şi obţinute în stare purificată. Pentru obţinerea de amilaze mai pot fi folosite speciile Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspegillus usamii, Aspergillus cinnamommeus. Aspergillus flavus formează colonii de culoare alb-gălbui la maturitate galben-verzui spre brun cu revers colorat în galben brun. Este răspândit în sol, pe produse vegetale şi are capacitatea de a produce aflatoxine, micotoxine cu efect cancerigen. Reprezentanţii genului produc aflatoxine denumite astfel de la specia Aspergillus flavus. Se cunosc 12 aflatoxine dintre care cele mai toxice sunt: B1, B2, G1, G2. Iniţialele provin de la fluorescenţa pe care o dau aceste toxine prin expunerea plăcii cromatografice la radiaţii UV cu λ = 360 nm (blue = albastru, green = verde), în timp ce numerele se referă la ordinea de migrare pe cromatogramă. Aflatoxinele M1, M2 cu toxicitate mai redusă, pot fi detectate în laptele provenit de la animalele hrănite cu furaje (mucegăite cu specii toxicogene). Mai produc aflatoxine unele tulpini ale speciilor Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus wenti. Aflatoxinele au efect toxicogen asupra animalelor şi produc ciroze în 3 săptămâni de la ingerarea acestora cu 1 mg/kg corp. Încălzirea la 120ºC, timp de 4 h, nu distruge în totalitate aceste micotoxine. Aflatoxinele nu sunt solubile în apă, ci în solvenţi organici, dar aceştia nu pot fi folosiţi pentru îndepărtarea micotoxinelor deoarece prin extracţie se pierde valoarea alimentară a produsului. Miceţii din genul Asperillus se dezvoltă în timpul procesului de încingere a cerealelor, mai ales în faza de varf a cesteia, când temperatura masei de cereale creşte la 40-50° C şi atinge, în final, valori maxime de 55°-65°C. Ca urmare a acestor temperaturi înalte microflora epifită este inactivată, iar numarul celor care formează 79


microflora externă a boabelor se reduce semnificativ. În timpul însilozării sfecla cu înveliş deteriorat contractă diferite infecţii microbiene ca: putrezirea în siloz; Aspergillus spp. Microorganismele identificate pe sfecla de zahăr în timpul depozitării sunt: Aspergillus glaucum, Aspergillus ochracus, Aspergillus niger var.tieghi.. Microorganismele care poluează zahărul sunt reprezentate de mucegaiuri: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae care pe lângă consumul mare de zaharoză, depreciază calitatea zahărului Microorganismele ce pot fi prezente pe condimente sunt de obicei cele care rezistă în condiţii de uscăciune, motiv pentru care pe condimente se vor găsi de cele mai multe ori spori ai bacteriilor gram pozitive şi spori de fungi. Numărul total de microorganisme de pe condimentele măcinate este în general acelaşi cu cel de pe condimentele întregi, dacă măcinarea s-a făcut în condiţii igienice. Numărul cel mai mare de microorganisme de pe condimentele măcinate este format din specii ale genului Bacillus şi mucegaiuri: Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Penicillium spp., Mucegaiurile din genul Aspergillus contribuie la zaharificarea amidonului în procesul de obţinere al spirtului. Astfel pentru obţinerea amilazelor de origine microbiană se folosesc mucegaiuri selecţionate din genul Aspergillus: A.awamori, A.phoenicis, A.ussamii, A.oryzae, A.niger. Unele specii din genul Aspergillus produc tulbureala sucurilor nealcoolizate. Aspergillus flavus poate fi des implicat în contaminarea laptelui, untului şi brânzeturilor, dând naştere aflatoxinei B1, care poate afecta grav starea de sănătate a consumatorilor. Pe suprafaţa brânzeturilor pot apare pete colorate specific, care imprimă acestora miros caracteristic, are loc degradarea cojii şi a zonelor adiacente, existând risc de formare a micotoxinelor şi difuzare a lor în pastă. Analizând procentual proporţia diferitelor genuri de fungi izolate din lapte crud de vacă 22% din numărul probelor examinate ( 50 probe) au fost contaminate cu Aspergillus spp. 11.5.2. Genul Penicillium (453 specii) - se caracterizează prin formarea unui aparat reproducător ramificat alcătuit din ram, metule, fialide şi fialospori cu diferenţieri morfologice în funcţie de specie. În cadrul genului, specii selecţionate sunt folosite la obţinerea un or brânzeturi cum ar fi: P. roqueforti – se utilizează la obţinerea brânzeturilor cu pastă albastră tip Roquefort . În România se fabrică brânza Bucegi din lapte de oaie, vacă sau amestecul acestora şi brânza Homorod din lapte de bivoliţă. Aceste brînzeturi se obţin prin maturarea brînzei (45-90 zile) sub acţiunea mucegaiului Penicillium roqueforti, care se dezvoltă sub formă de colonii liniare de culoare albăstruie, în jurul orificiilor create prin înţeparea prealabilă a caşului; la maturare contribuie şi Bacterium linens, care se dezvoltă la suprafaţă. P. camemberti - se utilizează la fabricarea brânzeturilor cu pastă moale, tip Camemebert (originară din Franţa – Normandia). Aceasta se obţine prin 80


maturarea brânzei (8-15 zile) sub acţiunea combinată a mucegaiului alb Penicillium camemberti şi a bacteriei Bacterium linens ce se dezvoltă la suprafaţă. Au coaja subţire, netedă acoperită de mucegai alb; miezul este compact, cu ochiuri de fermentare foarte mici, de culoare alb- gălbuie; este o brînză fină, moale, cu gust slab picant de ciupercă. P. nalgiovense – se utilizează la maturarea salamurilor crude uscate P. notatum şi P. chrysogenum – se utilizează pentru obţinerea de antibiotice din grupa penicilinelor. Speciile acestui gen sunt deseori implicate însă în unele procese alterative, unele putânmd produce peste 60 de toxine mai ales când se dezvoltă pe cereale şi furaje (patulina, ochratoxina, citrioviridina). Dintre speciile producătoare fac parte: P.islandicum - se dezvoltă pe orez şi produce 2 micotoxine: islanditoxina şi luteoskirina. P.expansum - este unul din principalii agenţi de putrezire umedă a merelor şi perelor şi produce patulina cu risc cancerigen pentru om. Se poate dezvolta pe cereale şi produse de panificaţie. Patulina este rezistentă la temperaturi ridicate, la pH acid şi are efect cancerigen. Dacă sucul de fructe este supus fermentaţiei, o parte din toxină se elimină din lichidul fermentat. P. expansum afecteaza zmeura, fragii, strugurii; P.digitatum - se dezvolta pe citrice, le înmoaie şi le dă gust pronunţat de amar, aceste modificari determinând putrezirea verde - albastra a citricelor. P.italicum - produce modificări asemanătoare la portocale şi grefe şi mai rar la lămâi. P.citrinum - produce citrinina pe orez decorticat, cauzând afecţiuni renale; P. citreoviridae – citreoviridina, toxină ce produce la om dereglări nervoase, simptome cardiace similare cu cele întâlnite în boala beri-beri etc. P. citreoviridae – citreoviridina, toxină ce produce la om dereglări nervoase, simptome cardiace similare cu cele întâlnite în boala beri-beri etc. P. simplex – produce mucegăirea zahărului şi boabelor de cafea - mucegăirea acestora se poate produce datorită condiţiilor necorespunzătoare de depozitare(UR> 70% şi T > 100C). P. stekii – face parte din categoria microorganismelor care pot polua zahărul. P. spp – poate contamina condimentele, în special cele măcinate, produc tulbureala sucurilor nealcoolizate. Miceţii din genul Penicillium acţionează în principal asupra lipidelor din lapte. Ele elaborează lipaze care determină hidroliza grăsimii cu formare de acizi graşi şi glicerină. Consecinţa este apariţia diferitelor modificări de miros şi gust – butiric, iute, înţepător, picat, rânced. Ei pot produce mucegăirea untului şi brânzeturilor - apariţia de pete colorate specific, miros caracteristic, degradarea cojii şi a zonelor adiacente, risc de formare a micotoxinelor şi difuzarea lor în pastă. 11.5.3. Genul Botrytis - formează colonii extinse, pâsloase, de culoare cenuşie. Botrytis cinerea - este denumit mucegaiul cenuşiu şi poate produce putrezirea vulgară sau nobilă a strugurilor. Afectează de asemenea zmeura, fragii şi produce pătarea şi degradarea la tomate, salată, pepeni, castraveţi, fasole, piper. În timpul însilozării sfecla cu înveliş deteriorat contractă diferite infecţii microbiene ca 81


putrezirea uscată cenuşie produsă de Botrytis cinerea. Specii fitopatogene dau boli la floarea soarelui şi alterări în depozit ale fructelor şi legumelor. 11.5.4. Genul Fusarium – afectează mai frecvent grâul, secara şi porumbul din regiunile cu climat umed. Speciile din genul Fusarium determină o scădere a recoltei de boabe şi reduc calităţile tehnologice şi nutritive ale acestora, deoarece mucegaiul pătruns în boabe le modifică compoziţia prin degradarea parţială a glucidelor şi protidelor. Odată cu acţiunea lor asupra boabelor, aceste mucegaiuri produc o serie de micotoxine care ajung în făină, în pâine sau în alte produse de panificaţie şi pot determina îmbolnăviri grave la om. Micotoxinele produse de fuzarii pot fi sintetizate şi la temperaturi scăzute şi nu sunt inactivate de tratamentele termice care se aplică în mod obişnuit acestor produse în timpul procesării lor, fiind deosebit de rezistente în timp (mucegaiurile pot să moară dar toxina rezistă ani de zile). Specii toxicogene sunt: F. sporotrichoides - produce sporofusariogenina producătoare de ATA ce se manifestă prin apariţia pe piele a unor pete specifice, anghină pectorală, diateze hemoragice, afecţiuni ale măduvii, dând simptome similare cu cele produse prin iradiere cu radiaţii ionizante sau otrăvirea cu benzen. F.nivali - se dezvoltă în special pe cereale şi produce trei tipuri de toxine: fusarenona, fusarenona X şi nivalenolul, toxine care determină în organismul animal o proliferare anarhică a celulelor, hematopoeză şi simptome similare ATA (aleukie toxică alimentară). Fusarium tricinctum, F. equiseti, F. graminearum (roseum), F. moniliforme si F. proliferatum - paraziteaza frecvent cerealele. Produc de asemenea putrezirea brună a fructelor, citricelor, putrezirea umedă a smochinelor, mucegăirea cerealelor (orz, grâu) cu producerea de micotoxine. Fusarium solani şi Fusarium oxisporum – produc putrezirea uscată a cartofllor şi cuprinde atât planta cât şi tuberculii. La cartofii depozitaţi se produce putrezirea uscată. Pe suprafaţa lor apare un miceliu alb-roz şi în condiţii de UR a aerului scazută, tuberculii se zbârcesc, se întăresc, iar miezul lor se brunifică. Treptat ei se usucă şi iau aspectul unei mase gălbui, pulverulente. În tuberculii în care se dezvoltă aceste mucegaiuri se formează unele fuzariotoxine dăunătoare sănătăţii omului şi animalelor. Fusarium oxysporium (roseum) - atacă în principal merele şi perele, conferindu-le un gust amar. Când fructele se pastrează în spaţii umede alterarea uscată se poate transforma în una umedă. În urma dezvoltării, aceste mucegaiuri elaborează numeroase toxine-fusariotoxine dăunătoare consumatorilor. Fusarium betae – produce putrezirea sfeclei cu înveliş deteriorat în timpul însilozării. Principalele fusariotoxine (trichotecene) cunoscute şi cu importanţă medicală sunt: · toxine - 2; · nivalenolul; · desoxinivalenolul (DON), cunoscut şi sub denumirea de vomitoxină; 82


· · · ·

diacetoxinpenolul; neosolaniolul; diacetoxiscirpenolul (DAS); zearalenona. Aceste toxine au stabilitate remarcabilă, în condiţii de mediu cu variaţii moderate de temperatură şi pH. Oxigenul şi lumina nu le influenţează activitatea. Datorită acestor proprietăţi ele nu sunt inactivate în procesarea grăunţelor de cereale. Câteva din efectele lor biologice asupra organismului uman şi animal sunt: · Imunotoxicitatea - provoacă o creştere a sensibilităţii organismului faţă de bolile neoplazice (uneori reprezintă cauza cancerului esofagian) şi o stimulare a unei funcţii imune care determină tulburări autoimune. Rezultatele multor lucrări demonstrează că imunotoxicitatea are semnificaţia cea mai mare asupra sănătăţii omului, pentru că ele apar şi dupa expuneri la doze mici de toxine, aşa cum se întâmplă în practică; · Superinducţia producţiei de citoxină de către celulele helper T şi activarea macrofagelor şi celulelor T sa producă citoxine proinflamatorii, asemanătoare cu cele observate în şocul provocat de lipopolizaharide; · Inducerea tulburărilor hematologice cum sunt neutropenia, trombopenia şi anemia la om şi animale. Fumosinele sunt implicate deseori în îmbolnăviri ale omului cu aspect de toxiinfecţie alimentară, apărute în urma consumului de produse făcute din cereale contaminate şi inhibă asimilarea vitaminelor de către organism. 11.5.5. Genul Cladosporium - formează colonii cu aspect catifelat de culoare brun-oliv cu revers colorat în bleumarin -negru. Se reproduc prin blastospori în formă de lămâie. Este prezent în microbiota cerealelor proaspăt recoltate. Miceţii din genul Cladosporium pot produce la temperaturi scăzute toxine de tipul acizilor tricarboxilici nesaturaţi care dau simptome caracteristice. Miceţii din genul Cladosporium pot contamina laptele ctrud. Analizând procentual proporţia diferitelor genuri de fungi izolate din lapte crud de vacă 36% din numărul probelor examinate au fost contaminate cu Cladosporium spp. Ei fac parte din rândul microorganismelor care acţionează în principal asupra lipidelor din lapte. Ele elaborează lipaze care determină hidroliza grăsimii cu formare de acizi graşi şi glicerină. Consecinţa este apariţia diferitelor modificări de miros şi gust – butiric, iute, înţepător, picat, rânced. Miceţii din genul Cladosporium împreună cu alţi miceţi şi drojdii se pot dezvolta pe carcasele bine zvântate ale carcaselor (uscate), înlocuind microflora bacteriană existentă iniţial, deteriorându-le. Cladosporium herbarum - mucegai microaerofil ce se dezvoltă în micropicături de lichid din masa de unt, formând puncte negre, inestetice, produce defectul de mucegăire profundă al untului. Cladosporium herbarum poate fi implicat şi în contaminarea fructelor, producând pe lângă putrezirea uscată a fructelor dulci (în special a strugurilor) şi mucegairea cu pete negricioase a pepenilor. 11.5.6. Genul Alternaria - formează colonii pufoase cu miceliu septat şi conidii mari cu septumuri longitudinale şi transversale. Dau putrezirea brună a 83


fructelor. Este considerat mucegai de câmp şi este prezent pe suprafaţa seminţelor proaspăt recoltate fiind folosit ca indice de prospeţime a cerealelor. La cartofi produce pătarea neagră a frunzelor de cartofi. Boala se manifestă la început sub formă de pete circulare, negre, cu diametru de 1-2 cm, situate între nervuri. Aceste pete se măresc, necrozează ţesuturile frunzelor care cad. Când apare la tuberculi, boala se manifestă prin apariţia petelor negricioase, circulare, care determină în final putrezirea lor. Alternaria spp. - produce alterarea fructelor dulci şi putrezirea brună la pepeni galbeni, pere şi citrice. De asemenea afectează zmeura, fragii, strugurii; Alternaria citri - este agentul putrezirii umede a grapefruit - urilor; Alternaria radicina şi Alternaria brasicae - produc înegrirea frunzelor de varză şi de tomate; Alternaria alliaceus şi Alternaria solani - produc pătarea şi degradarea la ceapă, varză şi cartofi; Alternaria dauci, Alternaria chartarum, Alternaria tenuis - produc pătarea şi degradarea la tomate, salată, pepeni, castraveţi, fasole, piper; Unele specii din genul Alternaria produc tulbureala sucurilor nealcoolizate. 11.5.7. Genul Geotrichum - formează colonii extinse, catifelate de culoare albă. Produce miceliu septat din care se separă arthrospori ce au tendinţa de aranjare în zigzag. Geotrichum candidum şi Geotrichum auranticum - cu activitate proteazică şi lipazică lipsită de potenţial toxicogen, pot produce mucegăirea brânzeturilor, defect care se caracterizează prin apariţia de pete colorate specific, miros caracteristic, degradarea cojii şi a zonelor adiacente, risc de formare a micotoxinelor şi difuzarea lor în pastă. Poate contamina deasemenea ambalajele. Geothricum spp. - pot produce defecte produselor lactate acidulate, cărnii şi mustului obţinut din struguri contaminaţi. Mucegăirea este întâlnită în special la smântână. În condiţiile în care în grăsime rămân bacterii lipolitice la păstrare se produce râncezirea hidrolitică cu eliberarea de acizi graşi care prin oxidare generează aldehide şi cetone. Miceţii din acest gen pot fi întâlniţi de asemenea şi pe suprafaţa untului. Daca UR a atmosferei din depozitul frigorific este <80% şi dacă, aerul se miscă rapid pe suprafaţa cărnii, evaporarea apei are loc mai repede decât difuzia ei din interiorul cărnii şi straturile superficiale pierd cea mai mare parte din apa lor, formandu-se o peliculă uscată şi dură. Pe o asemenea peliculă nu se pot dezvolta bacteriile, ci numai levurile şi mucegaiurile, cum sunt şi cele din genul Geotrichum,, situaţie întâlnită la cărnurile uscate. De pe struguri mucegăiţi, pot ajunge în must spori, fragmente de mucegaiuri cum ar fi cele de Geothricum. Acestea se găsesc în număr mai mare atunci când mustul provine din struguri deterioraţi fizic şi care prin eliberarea de suc,favorizează dezvoltarea acestor microorganisme înainte de recoltare.Vinurile obţinute din struguri mucegăiţi sunt vinuri de calitate inferioară, care îşi pierd aroma, care casează. 11.5.8. Genul Trichoderma - formează colonii extinse pufoase sau pulverulente de culoare gălbui spre verde. 84


Trichoderma reesei - produce activ celulaze şi un antibiotic gliotoxina cu efect fungistatic faţă de mucegaiuri care produc putrezirea lemnului. Trichoderma spp. – poate să ajungă de pe struguri mucegăiţi în must în număr mai mare când acesta provine din struguri deterioraţi fizic şi care prin eliberarea de suc, au favorizat dezvoltarea lui înainte de recoltare.Vinurile obţinute din struguri mucegăiţi sunt vinuri de calitate inferioară, care îşi pierd aroma, care casează. 11.5.9. Genul Trichothecium formează colonii cu aspect pufos de culoare rozportocaliu. Trichothecium roseum - este cel mai întâlnit pe reziduuri vegetale, ca agent al putrezirii fructelor. Este întâlnit pe suprafaţa boabelor de cereale: grâu, orz, porumb şi poate produce mucegăirea pâinii. Produce mucegăirea uscată la smochine şi fructe dulci, ca şi putrezirea roză a merelor. Putrezirea uscată se manifestă prin deshidratare accelerată, zbârcirea cojii şi o sporire a enzimelor plasmolitice. Volumul, textura, gustul, mirosul şi culoarea fructului se modifică.

85


CURS nr. 12 ALTE MICROORGANISME CARE POT CONTAMINA ALIMENTELE 12.1. Virusuri 12.1.1. Consideraţii generale Importanţe virusurilor pentru microbiologia alimentelor de origine animală este minoră, aceasta din mai multe motive: virusurile nu se multiplică în afara celulelor vii şi nu au nici un rol în alterarea alimentelor; virusurile au o rezistenţă mică la căldură, ceea ce face ca ele să fie inactivate de tratamentele la care sunt supuse marea majoritate a alimentelor de origine animală înainte de a fi consumate. Sursele principale de contaminare a alimentelor sunt secreţiile şi excreţiile umane, a purtatorilor de viruşi ca: virusul hepatitei A; urina şi fecalele rozatoarelor cât şi insectele care vin în contact cu alimentele. 12.1.2. Virusuri care pot fi implicate în contaminarea alimentelor 12.1.2.1. Alimente de origine animală Semnificatia virusurilor care pot infecta omul prin consumul de lapte este puţin cunoscută. Pasteurizarea corectă a laptelui pare suficientă pentru a preveni apariţia unor episoade de boli virale. Nu este exclus însă ca unele virusuri patogene pentru om, cum sunt virusul encefalitei transmisibile prin artropode, virusul Coxsackie să aibă un punct termic de inactivare uşor superior temperaturilor de pasteurizare folosite curent şi în acest caz să constituie surse de infecţie pentru consumatorul uman. Contaminarea prin manipulatori umani este astfel cea mai importantă din sursele de contaminare a laptelui şi brânzeturilor cu virusuri patogene pentru om. 12.1.2.1.1. Enterovirusuri - aceste virusuri, sunt transmisibile pe cale orală şi se multiplică la nivelul mucoasei tractului gastrointestinal al omului şi animalelor. Dintre acestea, virusul poliomielitei şi alte enterovirusuri ca de exemplu virusul Coxsackie sunt adesea excretate prin fecalele persoanelor clinic sănătoase şi pot, să contamineze laptele. Laptele crud şi cel contaminat după pasteurizare joacă un rol important în diseminarea acestor virusuri, mai ales în ţările în curs de dezvoltare. 12.1.2.1.2.Virusul febrei aftoase - este unul din cele mai contagioase pentru animale. Contagiozitatea sa pentru om este mică sau absentă. Boala se constată foarte rar la om şi are, de regula, ca sursă de infecţie, laptele crud provenit din ferme contaminate. Virusul trece în lapte în faza de viremie a animalului bolnav, dar şi după, prin aftele de pe uger. Nu rezistă în lapte la temperatura de pasteurizare. 12.1.2.1.3. Virusul hepatitei infectioase - este transmis pe cale orală şi poate fi eliminat de indivizi convalescenţi sau clinic sănătoşi. Laptele poate fi contaminat prin manipulări de către persoane purtătoare şi eliminatoare de virus, ca şi prin apa contaminată folosită în procesare. 12.1.2.1.4. Virusul encefalitei transmisibile prin artropode (capuşe şi alţi acarieni) - omul poate fi infectat pe cale cutanată, în urma înţepăturilor căpuşelor 86


Ixodes persulcatus şi Ixodes ricinus, sau pe cale orală, mai ales prin ingestia laptelui netratat termic provenit de la capre infectate. 12.1.2.2. Alimente de origine vegetală Vegetalele reprezinta deseori alimente prin care se transmit la om numeroase boli produse de virusuri. O sursa potenţială de contaminare primară cu virusuri o reprezintă irigarea şi fertilizarea plantelor fructifere sau a legumelor cu ape uzate din aglomerările umane. Virusurile pot contamina direct părţile aeriene ale plantelor sau unele pot ajunge în plante prin rădăcini odată cu absorbţia apei. Salata implicată în gastroenterita virală, se contaminează deseori în timpul preparării ei de persoanele bolnave sau purtatoare de virusuri. Literatura de specialitate semnalează numeroase cazuri de îmbolnavire cu virusuri, în special cele ale poliomelitei şi hepatitei epidemice, prin consumul unor vegetale crude contaminate. Cerealele şi făina de grâu - se cunosc 25 de viroze la plantele cerealiere. Ele se transmit de la an la an prin seminţele netratate, iar în perioada de vegetaţie, de la plantă la plantă, prin insecte. Virozele se manifestă prin încetinirea dezvoltării plantelor, degenerarea acestora şi flori sterile, ceea ce determină o scădere a recoltei şi o reducere semnificativă a calităţii tehnologice a boabelor. Principalele boli virotice ale plantelor se manifestă sub forma de mozaic, necroze şi deformaţii. Cartofii - Rasucirea şi încretirea frunzelor este o boală a plantei de cartof produsă de un virus care determină o proliferare anarhică a celulelor frunzelor, al carui rezultat este nedezvoltarea normală a plantelor care rămân pitice, dar care acumulează în partea lor aeriană o cantitate de amidon mult mai mare decât plantele sănătoase, în detrimentul nedezvoltării sau dezvoltării insuficiente a tuberculilor. Producţia de cartofi este grav afectată. Mozaicul este o altă boală virotică care afectează frunzele plantelor şi care se manifestă prin apariţia pe frunze a unor pete galbene de forma neregulată, ceea ce le dă un aspect de marmorat. Plantele afectate de această viroză nu se dezvoltă normal, iar formarea tuberculilor este impiedicată. Stolburul este o viroză foarte gravă care afectează planta în mtregime şi îi determină ofilirea şi uscarea treptată a părţii aeriene, putrezirea parţială a sistemului radicular, iar tuberculilor o consistenţă moale, cauciucoasă, dar care nu putrezesc în timpul depozitării obişnuite. Fructele si legumele - nu sunt produse cu riscuri mari pentru sanatatea consumatorilor, in primul rand, datorita faptului ca ele nu reprezinta substraturi nutritive din cele mai convenabile multiplicarii microorganismelor pentru om. Contaminarile cu asemenea microorganisme, care au loc in timpul recoltarii, transportului si depozitarii, sunt reduse din punct de vedere numeric, iar multiplicarea loc pe fructele si legumele depozitate este inhibată de o multitudine de factori naturali de aparare. Literatura de specialitate citeaza infectii gastro-intestinale cu aspect de toxiinfectii alimentare extinse si grave aparute in urma consumului unor legume sau fructe (hepatite virale epidemice s.a. ). 12.2. Micovirusurile Micovirusurile sau micofagii sunt virusuri patogene pentru ciupercile 87


microscopice, reducând capacitatea celulelor de a se multiplica cu repercursiuni asupra puterii acestora de participare in procesarea produselor alimentare. 12.3. Viroizii Viroizii sunt agenţi infecţioşi subvirali formaţi numai din ARN liber şi nu au structuri de virion.Sunt patogeni numai pentru plante cărora le pot produce boli grave ca:boala tuberculilor fuziformi de cartof, nanismul hameiului şi crizantemelor sau excortismul portocalilor şi lămâilor. 12.4.Bacteriofagii Sunt virusuri catre parazitează bacteriile pe care în mod obişnuit le lizează (gr.=lysis=dizolvare, distrugere). Sunt 3 tipuri de fagi: · sub formă de cireaşă (cu cap si coada); · sferici (fara coadă); · filamentoşi. Cel complet este compus din cap, gât şi coadă, iar in interiorul capului se află aidul nucleic (genomul fagului). Posedă ADN şi ARN ca şi virusurile. În mediile solide pentru bacterii contaminarea cu bacteriofagi duce la formarea de plaje (suprafeţe de mediu pe care sunt distruse bacteriile ) sau limpezirea mediilor lichide. Fiecare plajă de liză este iniţiată de o particula virală (fagică). După contactul bacteriofagului cu bacteria, aceasta injectează în bacterie acidul nucleic (genomul) care o subordonează pentru a sintetiza noi bacteriofagi, ca şi în cazul virusurilor. Urmează fie liza bacteriei sau integrarea acestui genom străin în cel al bacteriei (fagi temperaţi) numite celule lizogene, influenţând genomul bacteriei gazdă, să se replice şi să se transmită la descendenţi bacteriei. În acest caz bacteriile lizogene (care posedă în genomul propriu şi un genom al bacteriofagului), castigă noi proprietăţi: · devin imune la o reinfecţie (suprainfecţie) cu fag homolog (identic cu cel deja existent în bacterie). · bacteriile lizogene se pot liza spontan. Bacteriofagii sunt foarte răspândiţi în natură, ei aflându-se peste tot acolo unde se află bacterii sensibile. Ei reglează densitatea populaţiei bacteriene în natură influenţând într-o mare măsură evoluţia acestora. Bacteriofagii, prin efectul lor litic se folosesc în terapia unor boli bacteriene, în identificarea şi clasificarea bacteriilor (lizotipie sau tipizare prin fag), precum şi în studiul epidemiologic al infecţiilor bacteriene, inclusiv al toxiinfecţiilor alimentare (TIA), confirmând identitatea sau nu a bacteriei din aliment cu cea izolată de la bolnav, cum se practică la S.aureus şi Salmonella. O celulă bacteriană infectată de un bacteriofag produce 20.000 particule fagice în cca 22 minute. În taxonomia lor se foloseşte gruparea lor în familii, având în vedere tropismul faţă de unele grupe bacteriene, cum sunt: · familiile: Myoviridae, Styloviridae, Pedoviridae, Leviviridae, Microviridae, având gazdă Enterobacteriaceele; · familiile Plasmaviridae, Crystoviridae, Corticoviridae cu gazdă Pseudomonas; · familia: Inoviridae au gazdă Enterobacteriaceaele şi 88


Pseudomonas, Mycoplasma, iar familia Tectiviridae ca gazda Pseudomonas, Vibrio şi Bacillus. Infecţia cu fagi poate avea şi influenţe negative asupra unor procese industriale din domeniul alimentar sau al industriei antibioticelor. 12.5. Cianofagii Cianofagii sunt virusuri asemănătoare ca structură şi ciclu de dezvoltare, cu bacteriofagii numiţi şi ficovirusuri sau algofagi, şi parazitează numeroase specii de cianobacterii. Au o acţiune infecţioasă asupra populaţiilor de alge verzi – albastre influenţând distribuţia geografică si sezonieră ca şi dinamica de dezvoltare a acestora. Prin aceasta ei au un rol important în menţinerea echilibrului acestor alge în bazinele acvatice naturale. Pot fi folosiţi ca mijloc eficient pentru distrugerea algelor nedorite şi pentru combaterea fenomenului de „înflorire” a acestora. 12.6. Prionii Au următoarele caracteriatici fizico-chimice şi biologice: dimensiuni sub nivelul virusurilor mici (18-30 nm virusuri mici, 50 – 150 nm virusuri mijlocii, 150-300 nm virusuri mari), parazitează la om şi animale, nu sunt antigeni şi nu determină reacţii imune prin aticorpi specifici, nefiind posibil a se diagnostica prin reacţii serologice, nu produc interferon, prezintă o rezistentă insolită la acţiunea agenţilor fizici şi chimici. Prionii sunt încadraţi într-o grupă de elemente infecţioase atipice ATNC (Agent transmisibil necunoscut), denumiţi şi agenţi transmisibili neconvenţionali, virusuri neconvenţionale sau prioni, cu afinitate pentru SNC. Sunt compuşi dintr-o singură moleculă proteică, lipsiţi de acizi nucleici. Termenul şi conceptul de prion (Proteinaceous infectious particle - proteine anormale, neurotoxice, proteine glicoforme sialilate, hidrofobe, rezistente la protează) a fost definit de Prusiner în 1982, în urma unor studii asupra unei boli a ovinelor (scrapie) considerată o boală virală. Rezistenţa foarte mare la factorii fizico-chimici ai agentului infecţios: 60’ la 3600°C, aldehida formica nu distruge, ci măreşte rezistenţa la temperatură, a anulat însă ipoteza virală. Prionii sunt o formă modificată a unei proteine celulare normale (PrpC). Ea se sintetizează normal şi permanent de celulă care este apoi degradata de proteaze. Este nepatogenă şi netransmisibilă, cu o structură în formă de helix (gr.melc). Unele mutaţii ce pot sa apară pe gena care o codifică duce la apariţia proteinei prionice modificate sau prion, întâlnită în boala scrapie şi în alte boli (PrPSC). După ce s-a format ea acţionează asupra proteinei prionice normale din celule şi o transformă, prin deplierea ei de la forma de alfa helix în beta pliere (împăturire). Această conversie îi conferă proteinei prionice normale. PrPC, intr-o proteina infectioasa (prion), PrPsc fenomen întâlnit în toate bolile prionice. Deci, Prionii aflati in celulele nervoase pot avea o origine endogena (prin mutatii) sau una exogena, prin infectie,din exterior,de la un bolnav, om sau animal. Prionii se acumulează în celulele nervoase pe care le vacuolizează şi apoi le distruge. Rezistenţă 89


Prionii sunt formaţi dintr-o proteină de tipul amiloidului cu gm = 27- 30Kd, notată cu acronismul PrSC27-30, proteină hidrofobă foarte rezistentă la acţiunea factorilor de mediu, astfel: · prionii cu dimensiuni de 10-10nm sunt inactivaţi numai după o oră la 1320°C sau după 18’ la 1340°C; · supravieţuiesc la iradieri de 20.000.000 de rad. , faţa de virusuri care sunt distruse de 300.000 de rad. şi om la la numai 6000 de razi; · rezistentă la formaldehidă 20% 4 ore ca şi la eter, cloroform. · fenolul peste 2%, ureea 8M şi periodatul 0,01M/pH 3,5 ii inactiveaza in 30’,iar hidroxidul de sodiu 2 - 4% la 200°C într-o oră. Boli produse de prioni Prionii, încadraţi în categoria ”agenţilor transmisibili neconvenţionali” (ATNC) produc la om şi animale encefalopatii spongiforme, cum sunt: · Encefalopatia spongiformă a bovinelor (ESB) – la bovine domestice, transmisă prin făina de carne-oase; · Scrapie - la oi, capre, mufloni; · Boala cronica cahectizantă a cervideelor - diagnosticată în America de Nord; · Boala Kuru – s-a înregistrat la om in Noua Guinee în urma canibalismului. · Boala Creutzfeldt-Jakob (BCJ) – care se transmite prin contactul cu ţesutul nervos şi alte ţesuturi ale bolnavilor; · Boala Gertsmann – Straussler - Scheinker (BGSS); · Insomnia fatala familiala (IFF); · Encefalopatia transmisibila a nurcilor (la nurcile de crescatorie); · Encefalopatia spongiformă a ungulatelor exotice; · Encefalopatia spongiforma a felinelor. Deoarece este dovedită transmiterea acestor boli de la animale la om, ele prezintă o deosebită problemă de igienă alimentară. Prionii nu induc elaborarea de anticorpi şi nici de interferon.

90


CURS nr. 13 Paraziţi implicaţi în contaminarea alimentelor 13.1. Trichinella spp. Sunt nematozi din familia Trichinellidae. Se cunosc 7 specii de Trichinella: T. spiralis (numită şi T-1) asociată cu porcii domestici şi mistreţi, T. nativa (T-2) o specie adaptată climatului rece prezentă în general la canidele sălbatice, urs şi morsă, T. britovi (T-3) se găseşte predominant la animalele sălbatice, T. murrelli (T-5), o specie nord americană care se găseşte la animalele sălbatice (poate apare la om atunci când acesta consumă carne de vânat infestată), T.nelsoni (T-7) izolată sporadic de la animalele sălbatice din Africa, T .pseudospiralis (T-4), cosmopolită în răspândire, diagnosticată la păsările răpitoare, carnivorele sălbatice, şobolani şi marsupiale în Asia, America de Nord şi subcontinentul australian. T.spiralis este un nematod cu partea anterioară mai subţire decât cea posterioară şi cu dimensiuni reduse. Masculul măsoară 1,4 -1,6 mm/ 40μm şi femela 3-4 mm/60 μm. Ca adult, trăieşte în intestinul subţire (jejun), iar ca larvă în muşchii sriaţi ai aceleiaşi gazde. Femela este vivipară, elimină larve, cu dimensiuni de 100/6 μm, în număr de aproximativ 2000 în cele 4 - 6 săptămâni de viaţă. Din intestin, larvele ajung prin vasele limfatice în circulaţia sanguină, în tot corpul gazdei localizându-se în musculatura striată. Pătrunde în fibrele musculare, se răsucesc în spirală şi se înconjoară cu o membrană după 7-8 saptămâni de la infestare, închistându-se, izolând-o de ţesuturile din jur. Chistul trichinelotic, de formă ovală, asemănător unei lamâi ce măsoară 300800/200-400 μm, are în interior de obicei o singură larvă spiralată, rareori 3 - 4 sau mai multe. În acest stadiu, evoluţia este întreruptă şi nu se poate relua decât dacă larva închistată este ingerată de un animal receptiv, în care sub acţiunea sucurilor digestive se pun în libertate larvele ce devin după 48 ore trichinele adulte. Are loc copularea după care masculii mor, iar femelele pătrund în mucoasa intestinului unde are loc ponta şi se reia ciclul biologic. O parte din larvele infectante iau calea circulaţiei sanguine, pe când altele se elimină cu fecalele şi pot fi ingerate de diferite animale, vertebrate sau nevertebrate coprofage, în corpul cărora se continuă ciclul biologic sau se constituie doar în vectori. După un interval de 6 luni chiştii pot degenera şi începe calcificarea lor, proces ce se termină după aproximativ 16 luni când larva moare. Longevitate acestora în musculatură este la om de până la 24 ani, iar la animale toată viaţa. Rezistenţa larvelor este în funcţie de vârsta şi substratul în care se găsesc; în fecale rezistă 8-27 zile, în carnea alterată 6 luni, iar în corpul unor insecte 5-8 zile. La 7580°C în interiorul unor bucăţi de carne parazitată cu dimensiunile de 10/10/10 cm. larvele mor după 40 minute de fierbere. Rezistă 4 zile în carnea congelată la –20 0Cşi o oră la 30 0 C. Cea mai eficace metodă de distrugere a larvelor din carne este menţinerea 3 zile la -30°C temperatură în interiorul bucăţilor. Sărarea şi afumarea nu distrug larvele. În

91


cârnaţii de casă, preparaţi în gospodărie, larvele supravieţuiesc până la 2 ani, iar în carne până la 21 ani. Trichinella găsită în carnea de vânat (T.nativa sau T-2 şi T-6) poate fi rezistentă la congelare şi astfel carnea congelată poate să pună în pericol sănătatea publică. Surse de infestare În răspândirea parazitului în natură se disting 2 tipuri de focare; unul silvatic (primar, focar natural), format de animalele sălbatice, dintre care viezurele este considerat ca rezervor natural de larve. Al doilea este tipul de focar sinantrop, (secundar) ce cuprinde animalele sinantrope (câine, porc, pisică, şobolan etc). Lanţul trofic existent în focarul natural, menţine şi trichineloza în interiorul lui dar totdeauna necesităţile trofice duc la interferenţe între aceste două tipuri de focare şi implicit la trecerea bolii din primul în al doilea, în care rezervorul de larve îl reprezintă şobolanul. Extinderea bolii are loc mai ales in lunile reci când se conservă mai mult timp larvele în musculatură. În focarele naturale gradul de infestatie este destul de ridicat : 7,14% la şobolani (2-22%) şi 5,26% (1-19%) la şoareci. Fecalele de şobolan şi de şoarece, infestaţi experimental, conţin larve infestante. 13.2. Sarcocystis spp. Sporozoare dixene din genul Sarcocystis, care afectează un număr mare de animale domestice şi sălbatice (porcul, mistreţul şi cerbul). Etiologie Este produsă de sporozoare dixene din genul Sarcocystis (Gr. Sark, sarkos = carne, kystis = veziculă), care afectează un număr important de specii din toate clasele de vertebrate. Boala se întâlneşete mai frecvent la porci, mistreţi şi cerbi, şi mai rar la muflon (S.tenella) şi diferite specii de păsări acvatice (S.anatina). La mistreţi boala este produsă de două specii: Sarcocystis suicanis (S. miescheriana) şi Sarcocystis suihominis. Sarcocystis suicanis măsoră 50 – 1500 x 15 - 10 µm şi se formează în muşchii scheletici şi cardiac începând de la 20 – 30 zile după infestare. Gazda intermediară este porcul domestic şi mistreţul. Gazda finală este reprezentată de câine (Canis lupus familiaris), vulpe (Vulpes vulpes) şi lup (Canis lupus lupus). Sporochiştii măsoară 12,7 x 10,1 µm. Sarcocystis suihominis – măsoară 5 mm lungime şi se formează în muşchii scheletici şi cardiac şi ocazional în creier, după 20 – 30 zile de la infestare. Gazda intermediară este reprezentată de porcul domestic şi mistreţ. Gazda finală este omul. Cerbul este parazitat de mai multe specii, Sarcocystis hemionilatrantis şi Sarcocystis spp. Sarcocystis hemionilatrantis – are ca gazdă intermediară cerbul. Gazda definitivă este coyotul (Canis latrans). Sacociştii măsoară 14,4 x 9,3 µm. Sarcocystis spp – au ca gazdă intermediară cerbul şi gazdă definitivă câinele. Sporochiştii se elimină după 11 – 12 zile de la infestare şi măsoară 14,9 – 17,2 x 9,0 – 10,5 µm. 92


Surse de contaminare Sursa de paraziţi o constituie gazdele definitive (om, câine, coyot, lup, pisică, reptile, păsări de pradă) care elimină sporochişti. Dispersarea sporochiştilor se realizează prin deplasarea gazdelor definitive şi prin intervenţia unor artropode (Musca domestica, Calliphora erythrocephala) şi păsări. Acestea pot vehicula sporochiştii din fecalele gazdelor definitive. Ciclul vital include trei faze: schizogonia, gametogonia şi sporogonia. Schizogonia se desfăşoară în gazde intermediare care în cazul animalelor sălbatice sunt reprezentate de cerb, mistreţ, căprioară, elan, gazelă, zebră. În gazda finală sau definitivă reprezentată de om, câine, coyot, lup, pisică, reptile, păsări de pradă are loc gametogonia şi sporogonia, terminându-se cu formarea oochistului matur, infestant pentru gazda intermediară. Speciile genului Sarcocystis sunt strict specifice atât pentru gazda definitivă, cât şi pentru gazda intermediară. Ciclul lor vital necesită obligatoriu o alternanţă între două gazde vertebrate care se află în relaţie de pradă – prădător. Gazda intermediară se infestează prin ingestia sporochiştilor eliminaţi în mediul ambiant de gazda finală. În intestinul gazdei intermediare se eliberează sporozoiţii care trec din circulaţia sangvină şi invadează celulele endoteliale ale arterelor de talie medie din diverse ţesuturi printre care şi encefalul. Începând cu a 4 – 6 – a zi de la infestare în celulele endoteliale ale ficatului se localizează schizonţii. Merozoiţii din aceşti schizonţi invadează celulele endoteliale ale capilarelor din întregul organism. Acestea se rup de suport, se detaşează, pierd legăturile cu celulele vecine, flotează în sânge, se dezagregă şi pun în libertate merozoiţii generaţiei prime. Aceşti merozoiţi pătrund în celulele endoteliale din diverse organe parenchimatoase şi iniţiază o nouă schizogonie care se va solda cu formarea de schizonţi din generaţia a doua. Spre a 15 – 19 – a zi de la infestare noii schizonţi dau naştere la generaţia a 2 – a de merozoiţi. Spre a 20 – a zi după infestare meroziţii generaţiei a doua trec în circulaţia sangvină şi apoi în ţesutul muscular, intră în fibra musculară şi chiar în creier, ceea ce antrenează formarea chistului denumit “complex xenoparazitar” sau xenoparazitom. În fibra musculară paraziţii sunt la început înconjuraţi de o vacuolă parazitară, limitată la o membrană unistratificată, care poate prezenta mici protuberanţe dirijate spre interiorul chistului. Complexul muscular xenoparazitar (sarcochistul) conţine un număr mare de merozoiţi, capabili de a asigura infestarea gazdei definitive. Sarcochiştii pot creşte timp de cel puţin un an, devenind vizibili macroscopic. Dezvoltarea complexului xenoparazitar se desfăşoară în interiorul unei fibre musculare striate cardiace sau în esofag, uneori şi în creier, apărând ca o masă fuziformă albicioasă de talie macro şi microscopică. Gazda finală se infestează prin ingerarea musculaturii proaspete, crude cu xenoparazitoame a gazdelor intermediare. Merozoiţii sunt puşi în libertate în intestin, schizonţii exchistează în prezenţa bilei, începând după 30 de minute de contact şi intră în celulele din lamina propria, ale intestinului în care evoluează cu formarea de micro şi 93


macrogameţi. După fecundarea macrogameţilor de microgameţi se formează zigotul. Acesta se înconjoară de un perete complet, dând naştere la oochistul nesporulat. În oochist are loc o primă diviziune care dă naştere la doi sporochişti din care apar patru sporozoiţi şi un corp rezidual. În acest stadiu, peretele subţire şi fragil al oochistului se rupe şi eliberează sporochiştii. Eliminarea sporochiştilor complet sporulaţi în fecalele gazdei definitive, debutează între a 5 – 11 –a zi după infestare şi durează mai mult de şase săptămâni. Prevenirea îmbolnăvirilor la consumator se realizează prin evitarea consumului cărnurilor crude infestate de către gazdele definitive. Ingestia de carne provenită de la animale infestate conduce la un tablou clinic sever care constă în balonare abdominală, inapetenţă, greaţă intensă, durere gastrică intensă şi diaree la 6 - 8 ore de la consum. Voma poate fi continuă. Apare dispneea şi un puls rapid. 13.3. Anisakis spp. Larvele de Anisakidae au o morfologie de tip ascaroid şi se deosebesc de alţi paraziţi eventual prezenţi în musculatură, prin aspectul lor de şarpe şi protejarea acestora de o capsulă. Mărimea, culoarea, modul de prezentare a parazitului în interiorul fileului sau a cavităţii abdominale a peştelui, comportarea larvei după extragerea din capsulă permit deosebirea larvelor de Anisakidae, între ele, şi chiar identificarea lor, cu o precizie de 95%. Larvele de A. simplex sunt localizate în cavitatea abdominală şi pe viscerele abdominale în interiorul peritoneului, astfel încât se pot înlătura, aproape în totalitate, odată cu peritoneul şi viscerele. Rare larve se găsesc sub foiţa peritoneală şi aderă de musculatura abdominală. Localizarea musculară este rară la majoritatea speciilor de peşte. Această localizare se întâlneşte mai des la morun. Larvele sunt rulate în jurul propriului ax sub formă de spirală plana şi strânsă, asemanătoare unui arc de ceas cu diametrul de 3-4 mm, uşor observabile la o examinare atentă. Ele au o culoare albicioasă-transparentă, sunt înconjurate de o membrană fină care constituie „capsula” şi masoară 10-29 mm lungime şi 0,44-0,54 mm grosime. Odată eliberate din capsulă, larvele devin foarte active, agitate, cu mişcări de şarpe. Dacă se încearcă derularea lor, ele tind să ia rapid forma iniţială. Pentru examinarea microscopică, ele se fixează în alcool 70% şi se clarifică în fenol lichid, până viermele devine translucid (câteva ore sau peste noapte). Puse pe lame şi examinate la microscop, larvele prezintă urmatoarele caractere distinctive: forma de cârlig la care extremitatea posterioară rămâne rasucită pe ea însăşi, cuticula cu striaţii fine, 3 buze bilobate, una dorsală şi două ventro-laterale, un dinte perforant situat în partea ventrală a orificiului bucal, un por excretor între buzele ventro-laterale, un tub digestiv simplu format din esofag, ventricul şi intestin, fără cecum. Larvele vii prezintă un spot opac, uşor vizibil, de câţiva mm, la partea lor anterioară, ceea ce corespunde ventriculului esofagian şi care devine neobservabil la larvele moarte. Dintre membrii grupului Anisakis (Anisakis, Acanthocheilus, Paranisakiopsis, Metanisakis, Paranisakis, Pseudoanisakis), numai membrii genului Anisakis ajung in 94


mod natural la stadiul de adult în vertebratele homeoterme, în mamifere şi de aceea pot produce anisakioza umană. Nematodele care în mod normal sunt cantonate în stomac şi intestin, migrează pe una din cele trei rute: 1) unele migrează spre partea anterioară; acestea provin în primul rând din stomac şi părăsesc peştele gazdă pe la nivelul filamentelor branhiale; 2) altele, în primul rând cele din intestine, migrează spre partea posterioară şi ies prin anus; 3) altele, cu precădere din intestin, sapă prin peretele intestinal în descompunere şi migrează nedirecţionat în cavitatea corpului. Unele dintre acestea se inseră în mezenter, altele ajung în musculatura corpului, iar altele pot trece prin muşchi şi emerg pe suprafaţa corpului peştelui gazdă. Deoarece ingestia larvelor de anisakide din musculatura peştilor este calea primară de dobândire a infestaţiei de către om, refrigerarea rapidă (inclusiv congelarea) pe navele de pescuit, care va întârzia dezintegrarea tubului digestiv al peştelui capturat, va inhiba parţial sau total migraţia nematodelor în musculatura corpului. Astfel poate fi redusă incidenţa anisakiozei umane. Aceasta este conduita care a eliminat în totalitate anisakioza umană în Olanda. Ca alternativă sau în tandem, eviscerarea rapidă a peştelui capturat pe pescadoare înainte de refrigerare, ar putea, de asemenea, să reducă incidenţa anisakiozei umane. Din păcate, în multe părţi ale lumii unde peştele marin reprezintă un procent major din raţia proteică, vasele de pescuit nu sunt dotate nici pentru eviscerarea în masă şi nici pentru refrigerare. De aceea, în aceste regiuni anisakioza are cea mai mare prevalenţă. Rezistenţă Deşi temperaturile înalte omoară larvele anisakide, încălzirea nu este întotdeauna de dorit sau o metodă practică din punctul de vedere al comerciantului en gros sau en detail, deoarece, pentru a omorî paraziţii este necesară o temperatura de 50-60ºC. Mai mult, nematodele moarte nu vor face fileul atractiv din punct de vedere comercial. De asemenea, fileurile care au fost încălzite la 50-60ºC au o perioadă de valabilitate mai scurtă. Temperaturile normale dintr-un frigider nu omoară larvele anisakide. Temperatura de congelare (la -20ºC) omoară paraziţii în 52 ore. Eficacitatea afumării şi marinării în distrugerea larvelor anisakide din fileul de peşte a fost studiata într-o oarecare masură. În general, afumarea şi marinarea sunt insuficiente. Excepţia posibilă este sărarea uscată, cu condiţia ca sarea să pătrundă în toată masa musculară sub forăa concentrată. Anisakioza umană poate fi contractată doar prin consumul de hrană de origine marină crudă sau semipreparată, în special peşte, care conţine larve infestante. Îmbolnăvirea se poate produce şi prin consumul de crustacee şi moluşte care adăpostesc larve infestante. Simptomele clinice ale anisakiozei umane includ durerea gastrică sau intestinală şi voma. Cu toate acestea, durerea nu este atât de acută ca în cazul apendicitei. 95


Apare de regulă o leucocitoză moderată, chiar dacă eozinofilia nu este întotdeauna acută. Nu apare o tensiune anormală în musculatura abdominală şi nu se inregistrează febră. Aceste semne sunt importante pentru a face diferenţa între anisakioza şi apendicita acută sau ocluzia intestinală.

13.4. Alţi paraziţi care pot contamina alimentele Unii paraziţi, pot să contamineze uneori laptele şi se pot transmite prin consumul acestuia. O parte dintre aceştia cum ar fi ouălele de Taenia solium, Ascaris lumbricoides, Trichuris, chiştii de amoebieni, ajung în lapte prin manipulatori sau obiecte contaminate. O altă parte cum ar fi Toxoplasma gondii, se pot elimina prin laptele animalelor infestate. Agenţii multor boli parazitare la om se pot transmite şi prin consumul unor legume si fructe contaminate cu dejectii umane si animale. Exemple: giardiaza, amibiaza, criptosporidiaza, diferite teniaze, ascaridioza ş.a. În prezent se consideră că sursa principală de infecţie în criptosporidiaza omului o constituie numeroase specii de animale domestice şi sălbatice care contractă această boală ca şi omul. După vindecare animalele rămân purtătoare şi eliminatoare de oochişti de Cryptosporidium parvum timp de câteva saptămani. Dejecţiile lor pot ajunge pe soluri cultivabile sau direct pe părţile aeriene comestibile ale plantelor prin consumul cărora omul se infectează. Viţeii şi mieii au fost incriminaţi cel mai des ca sursă principală de infectare a omului, prin contact direct sau prin intermediul plantelor contaminate. Apa poate fi contaminată cu unii paraziţi care prin încorporare determină modificarea statusului de salubritate al produselor alimentare - unii paraziţi ca: protozoarele: Giardia spp. şi Entomoeba histolytica, helminţi: Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Echinococcus granulosus,Taenia solium,Trichuris trichura, etc.

96


CURS nr. 14 INFLUENŢA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA BACTERIILOR 14.1. Influenţa factorilor extrinseci asupra microorganismelor 14.1.1. Temperatura Temperatura are o mare influenţă asupra proceselor fiziologice ale celulei microbiene deoarece stimulează sau inhibă activitatea echipamentului lor enzimatic. În funcţie de temperaturile posibile ale mediului natural şi ca rezultat al adaptării, diferitele specii de microorganisme prezintă următoarele temperaturi: temperatura minimă – temperatura la care mai poate avea loc creşterea, în schimb dacă temperatura scade sub valoarea minimă, creşterea este oprită; temperatura optimă – temperatura la care rata specifică de creştere este maximă; temperatura maximă - temperatura la care creşterea este încă posibilă dar prin depăşirea acesteia efectul devine letal. În funcţie de domeniul specific de creştere, microorganismele se împart în patru categorii: microorganisme psihrofile – cuprinde specii care cresc bine la 0°C, au o temperatură optimă la 10-15°Cşi maximă la aproximativ 20°C. Se consideră că aproximativ 90% din microbiota apelor prezintă temperaturi optime la aproximativ 5°C. Din grupa bacteriilor psihrofile de putrefacţie fac parte genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes. Microorganismele psihrofile prezintă sisteme enzimatice active la temperaturi scăzute, conţin în membrana plasmatică o concentraţie mai mare de acizi graşi nesaturaţi (acid linoleic), ceea ce explică menţinerea sa în stare semifluidă la rece şi degradarea la temperaturi mai mari de 30°C; microorganisme psihrotrofe – sunt facultativ psihrofile, au temperatura minimă de creştere la 0°C, cresc bine la 7°C şi produc prin păstrare la această temperatură, colonii vizibile sau turbiditate în medii lichide după 7-10 zile de păstrare. Au temperatura optimă între 20-30°C şi maximă la 35-40°C. În acest grup sunt incluse bacterii din genurile Enterobacter, Vibrio, Listeria etc., drojdii din genul Candida, genul Rhodotorula şi mucegaiuri, microorganisme ce pot da alterări ale alimentelor păstrate prin refrigerare; microorganisme mezofile – reprezintă grupul majoritar, cu temperaturi minime la 15-20°C, temperaturi optime în intervalul 30-40°C şi maximum la temperaturi peste 45°C. Cuprinde bacterii, drojdii, mucegaiuri, inclusiv microorganismele patogene pentru om/animale; microorganisme termofile – sunt microorganisme adaptate să crească la temperaturi mai mari de 45°C; majoritatea au temperaturi optime la 55-65°C şi temperaturi maxime 90°C. În cadrul grupului, se diferenţiază microorganisme: 97


ü preferenţial termofile (Tm = 25-28°C; To = 45-55°C; TM = 60-65°C) din care fac parte bacterii lactice ale genului Lactobacillus , unii fungi; ü obligat termofile (Tm = 37°C; To = 50-60°C; TM = 65-70°C) din care fac parte specii ale genurilor Bacillus şi Clostridium, actinomicete. Microorganismele termofile sunt folosite industrial pentru obţinerea de produse lactate acide, a enzimelor termostabile, pentru purificarea apelor reziduale, ca bioindicatori pentru anumite tratamente termice. 14.1.2. Umiditatea Viaţa microbiană este posibilă numai când în mediul nutritiv există apă liberă care participă ca solvent, ca mediu de reacţie pentru enzimele celulare şi pentru transportul bidirecţional al produselor de metabolism. Dacă conţinutul de apă liberă intracelulară se reduce, celulele trec în stare de preanabioză, continuată cu anabioză, în care enzimele trec în stare inactivată iar metabolismul este mult redus. În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% şi prin păstrarea alimentelor, în timp, în funcţie de temperatură şi compoziţia produsului are loc o absorbţie a vaporilor de apă din aer, instalându-se o stare de echilibru, cu creşterea cantităţii de apă liberă şi a indicelui de activitate al apei, aw. Acesta se poate calcula cu relaţia: aw = P/P0 în care: P – presiunea de vapori a apei din produs; P0 – presiunea de vapori a apei pure. Microorganismele se pot dezvolta într-un domeniu larg de aw situat între valori de 0,62-0,99 şi în funcţie de adaptare în raport cu limitele de aw care le permit creşterea se pot împărţi în trei categorii: microorganisme xerofite – aw = 0,62-0,75; din care fac parte mucegaiuri ale g. Xeromyces, g. Aspergillus, drojdii osmotolerante, bacterii halotolerante; microorganisme mezofite - aw = 0,75-0,85; cuprind majoritatea fungilor, bacterii; microorganisme hidrofite - aw = 0,85-0,99 sunt predominant bacteriile. Cunoaşterea comportării celulelor în raport cu umiditatea ca factor extrinsec ce condiţionează cantitatea de apă liberă accesibilă pentru desfăşurarea proceselor vitale, se aplică la conservarea prin uscare a produselor alimentare. Dacă acestea se păstrează în condiţii în care creşte treptat umiditatea, primele microorganisme care se dezvoltă aparţin grupului xerofitelor. 14.1.3. Concentraţia în oxigen Aerul atmosferic conţine aproximativ 20% oxigen. Microorganismele necesită oxigen pentru biosinteza compuşilor organici şi pentru desfăşurarea proceselor de oxidoreducere biologice. În funcţie de necesarul în oxigen procurat din aer se disting 5 tipuri de comportare diferenţiată a microorganismelor şi anume:

98


aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa lichidelor, a mediilor solide. Oxigenul serveşte ca acceptor final de electroni transportaţi prin catena respiratorie. Celulele eucariote folosesc oxigenul în sinteza sterolilor şi a acizilor graşi nesaturaţi (drojdii, mucegaiuri); facultativ anaerobe, nu necesită oxigen pentru creştere dar cresc mai bine în prezenţa sa. Se dezvoltă bine în medii lichide în care solubilitatea oxigenului din aer este mai redusă (bacterii lactice etc.); anaerobe aerotolerante nu necesită oxigen pentru creştere şi cresc la fel de bine în prezenţa sau absenţa sa (Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum); strict (obligat) anaerobe, nu tolerează oxigenul şi mor în prezenţa acestuia. Nu pot obţine energie prin respiraţie propriu-zisă şi folosesc fermentaţia sau respiraţia anaerobă în acest scop (bacterii butirice, metanobaceterii etc.); microaerofile – aparţin microorganismele aerobe care necesită concentraţii reduse de oxigen pentru creştere, respectiv 2-10%. 14.1.4. Energia radiantă Lumea vie este bombardată de radiaţii electromagnetice cu lungimi de undă între 10-4la 106 nm; în acest domeniu microorganismele sunt influenţate de următoarele radiaţii: Radiaţii ionizante (α, β, γ) Au lungimi de undă mai mici de 12 nm, o energie radiantă intensă ce acţionează prin ionizare cu eliberarea de ioni,radicali liberi ce acţionează prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea şi formarea dublelor legături, modificări în structură, polimerizări. În prezenţa oxigenului, acţiunea radiaţiilor ionizante este amplificată prin generarea de radicali OH- sunt intensificate procese de oxidare, denaturarea ADN-ului, ceea ce conduce la moartea celulei. Eficienţa acestor radiaţii depinde de forma şi starea celulei; celulele cu forma coccus sunt mai rezistente decât formele bacilare, iar formele vegetative sunt mai sensibile decât în stare sporulată. Succesiunea în sensul creşterii rezistenţei la efectul distructiv al radiaţiilor este următoarea: Bacterii Gram-negative > bacterii Gram – pozitive > fungi > virusuri Deşi efectul radiaţiilor ionizante se manifestă asupra tuturor microorganismelor, acestea au o radiosensibilitate diferită care se poate aprecia prin determinarea valorii D10 (adică doza absorbită care produce distrugerea a 90% din populaţia iniţială). Radiaţii ultraviolete (10-400 nm) În condiţii normale pe Terra nu ajung radiaţii cu lungimi mai mici de 287 nm deoarece acestea sunt reţinute de stratul de ozon protector cu o grosime de aproximativ 40 km. Acest lucru are o semnificaţie deosebită deoarece radiaţiile ultraviolete cu λ între 254-260 nm au efect letal sau mutagen asupra celulelor vii. Radiaţiile ultraviolete în funcţie de doză şi starea microorganismelor au efect letal maxim la λ =254 nm şi produc degradarea triptofanului cu formarea de compuşi toxici ce conduc la moartea fiziologică a celulei expuse. Microorganismele pot să-şi refacă 99


structura iniţială prin fotoreactivare când în prezenţa luminii sunt activate enzimele care desfac dimerii timinei, sau la întuneric când celula are capacitatea de a elimina porţiunea denaturată. În practică, radiaţiile se pot folosi pentru sterilizarea aerului şi pentru obţinerea de mutanţi valoroşi performanţi prin produşii lor de biosinteză. Radiaţiile luminoase (1-103 nm) Sunt utile bacteriilor din diviziunea Photobacteria. Microorganismele chimiosintetizante preferă să se dezvolte în întuneric. Dintre acestea unele microorganisme pot produce pigmenţi cu rol protector ceea ce le permite dezvoltarea în prezenţa luminii. Radiaţii infraroşii (λ>103nm) Acţionează prin energie calorică şi induc transformări ireversibile ale protidelor. Energia sonică Bioefectul ultrasunetelor asupra celulei microbiene este specific şi complex depinzând de frecvenţă, intensitate, durată, densitate de celule etc. Ultrasunetele cu frecvenţă mare ( >>1000 KHz ) pot să acţioneze producând distrugerea fizică a celulei datorată fenomenului de cavitate ultrasonoră şi efectelor electrice/termice asociate. Datorită frecvenţei mari pot apare rupturi la nivelul structurilor, apar germeni de cavitaţie sub forma unor bule mici de gaz care în stadiu de comprimare rezistă la presiuni mari, în faza de expansiune produc implozie determinând distrugeri locale. La frecvenţe mici se observă efectul de stimulare al ultrasunetelor ca urmare a unor deplasări sau deformări ale unor organite intracelulare (lizozomi, mitocondrii) şi modificări ale proprietăţilor plasmalemei cu influenţă asupra permeabilităţii şi vitezei de transport a nutrienţilor. Ultrasunetele de joasă frecvenţă şi intensitate stimulează procesul de înmugurire al drojdiei Saccharomyces cerevisiae ca rezultat al activizării echipamentului enzimatic şi a unui contact mai bun al suprafeţelor celulelor cu nutrienţii mediului. Ultrasunetele se pot folosi la sterilizarea apei, a saramurilor în industria preparatelor de carne sau pentru distrugerea pereţilor celulari în scopul extragerii unor compuşi valoroşi localizaţi intracelular. 14.1.5. Factori mecanici Dintre operaţiile utilizate în tehnici de analiză microbiologică se aplică frecvent centrifugarea şi filtrarea, în scopul separării de celule din medii lichide. Centrifugarea Este folosită pentru separarea biomasei de drojdii din medii de cultură când se folosesc viteze de centrifugare de 4000- 6000 rot/min., iar pentru separarea celulelor bacteriene, viteze de 6000-12000 rot/min. Se mai aplică lichidelor ce conţin un număr redus de celule, în vederea concentrării lor în centrifugat şi controlul microbiologic. Filtrarea Realizează reţinerea mecanică a celulelor microbiene atunci când diametrele porilor materialului filtrant sunt mai mici decât dimensiunea acestora. Separarea prin filtrare se mai poate realiza prin adsorbţie electrostatică atunci când materialul filtrant cu sarcină pozitivă reţine bacteriile cu sarcină negativă. În practica de laborator se 100


foloseşte sterilizarea prin filtrarea mediilor de cultură lichide ce conţin în compoziţie compuşi termolabili (de exemplu vitamine). Filtrarea se poate aplica pentru determinarea numărului de bacterii din apă sau alte medii lichide când se face filtrarea unui volum determinat din proba de analizat prin membrane filtrante din acetat de celuloză, care reţin celulele. După filtrare, membrana poate servi pentru numărarea directă a celulelor sau poate fi transferată pe suprafaţa unui mediu nutritiv solidificat repartizat în placă şi după termostatare se numără coloniile dezvoltate. Agitarea. Se aplică la cultivarea microorganismelor în condiţii de laborator pentru obţinerea culturilor pe agitator sau la cultivarea submersă în condiţii industriale, deoarece asigură un mai bun contact între celule şi mediul de nutriţie şi avantajează concomitent aerarea culturii. Rata de agitare la cultivarea submersă în bioreactoare variază cu volumul de mediu şi natura microorganismului cultivat. Astfel pentru 1-20 m3 viteza de rotaţie este de 120-180 rpm, iar la volume de 450 m3 poate fi de 60-120 rpm. 14.1.6. Factorii chimici Substanţele chimice cunoscute prezintă o mare diversitate de compoziţie şi se diferenţiază în funcţie de efectul pe care îl prezintă asupra celulelor microbiene şi anume: · efect stimulator, benefic în concentraţii mici deoarece numeroase substanţe conţin elemente majore sau minore ce intră în componenţa compuşilor celulari; · efect de stagnare a creşterii (microbiostatic) ca rezultat al acţiunii unor substanţe asupra enzimelor microbiene cu rol în metabolismul celulei vii; · efect letal (microbicid) atunci când substanţa, în funcţie de doză, conduce la modificări ireversibile şi dau distrugerea fizică a celulei sau inactivarea enzimelor, asociată cu moartea fiziologică. Toxicitatea este caracteristica rezultată din manifestarea biologică a organismului în care a pătruns o substanţă toxică şi este consecinţa a două reacţii şi anume acţiunea toxicului asupra celulei vii şi acţiunea celulei asupra toxicului. Din punct de vedere a toxicităţii şi a efectului produs de substanţele chimice cu efect antimicrobian acestea pot fi împărţite în patru grupe: · substanţe chimioterapice – substanţe care au efect negativ asupra microorganismelor patogene şi nu sunt toxice pentru organismul uman la dozele la care sunt aplicate în terapeutică. Substanţe ca antibiotice, sulfamide etc. acţionează prin activarea enzimelor litice din lizozomi, inhibă sinteza peretelui celular, distrugerea permeabilităţii membranei plasmatice sau interferează dereglând biosinteza polimerazelor cu rol în sinteza acizilor nucleici; · substanţe antiseptice cuprinde un grup mare de substanţe cu rol în combaterea infecţiei. În medicină, prin antiseptici se înţeleg substanţele toxice pe cale orală pentru organismul uman şi care sunt folosite pentru uz extern împotriva patogenilor de infecţie (stafilococi, streptococi patogeni etc.); · substanţe conservante – sunt substanţe netoxice pentru organismul uman şi în concentraţii mici au efect microbiostatic, folosiţi în industria alimentară pentru conservarea prelungită a calităţii produselor alimentare. Numărul 101


conservanţilor utilizaţi în industria alimentară este limitat de OMS şi FAO în funcţie de condiţiile pe care acestea trebuie să le îndeplinească şi anume: să prezinte un spectru larg de acţiune, să aibă putere microbiostatică la concentraţii mici, să fie stabil, solubil, netoxic, economic. Conservanţii determină o încetinire a creşterii microbiene acţionând prin inactivarea unor enzime specifice, blocarea unor căi metabolice, prelungind astfel intervalul de timp până se produce alterarea microbiană a produsului; · substanţe dezinfectante – sunt substanţe cu efect microbicid, toxice pentru organismul animal şi sunt folosite în industria alimentară pentru dezinfecţia utilajelor, a spaţiilor de producţie, ambalajelor, pentru unele materii prime. Operaţia de dezinfecţie are loc în mai multe etape: ü curăţirea cu îndepărtarea materiei organice de pe suprafaţa ce trebuie dezinfectată; ü aplicarea soluţiei dezinfectante ce realizează decontaminarea şi sanitizarea. Prin decontaminare are loc distrugerea microorganismelor patogene, iar prin sanitizare, reducerea microorganismelor organotrofe la limite la care activitatea lor nu prezintă risc; ü clătirea cu apă potabilă pentru îndepărtarea substanţei toxice. Modul de acţiune a substanţelor chimice folosite în industria alimentară În funcţie de natura substanţei şi a microorganismelor, efectul substanţelor chimice poate fi: · efect microbiostatic ce se manifestă prin reducerea vitezei de desfăşurare a metabolismului şi oprirea înmulţirii celulelor; · efect microbicid (germicid) ce este produs de către dezinfectanţi ce pot acţiona, în general, prin: ü denaturarea ireversibilă a proteinelor şi enzimelor produse de acizi anorganici, baze, săruri; ü blocarea grupărilor amino din structura protidelor, aminoacizilor cu formarea de punţi metilenice şi inactivarea de enzime – aldehida formică; ü permeabilizarea învelişurilor celulare, cu pierderea compuşilor intracelulari şi pătrunderea substanţei toxice – în cazul folosirii de săpunuri, detergenţi, săruri cuaternare de amoniu etc. Factori care influenţează efectul antimicrobian al substanţelor chimice Efectul unei substanţe chimice este condiţionat de numeroşi factori, biologici, dependenţi de substanţa chimică şi de mediul în care aceasta acţionează. · Factori biologici. Efectul unei substanţe chimice este dependent de natura microorganismelor, starea în care se află şi numărul de microorganisme prezente în mediul ce urmează a fi conservat. Microorganismele sunt mai sensibile la acţiunea substanţei chimice atunci când se află în stare vegetativă şi mai rezistente în starea lor sporulată. Celulele tinere, cu un conţinut mai mare de apă liberă sunt mai sensibile decât celulele mature. Eficienţa este dependentă de numărul de microorganisme în momentul utilizării, deoarece fiecare celulă absoarbe şi reţine o cantitate din doza existentă. Astfel prin 102


adăugarea unei doze constante, eficienţa acesteia se reduce când încărcarea microbiană este mare. Un factor biologic cu implicaţii practice este fenomenul de adaptare al microorganismelor la adaosul de substanţe chimice. În practică se utilizează culturi starter adaptate la doze crescute din substanţa la care alte microorganisme sunt sensibile. Un exemplu ar fi folosirea de dioxid de sulf în fermentarea mustului de struguri cu drojdii de cultură sulfitorezistente. Pentru a evita adaptarea microorganismelor în practică se recomandă alternarea substanţelor dezinfectante atunci când se constată o reducere a eficienţei. · Factori fizico-chimici - fiecare substanţă chimică acceptată în industria alimentară se caracterizează prin: ü spectrul de acţiune – reflectă efectul specific sau generalizat. Astfel pentru conservanţi acesta poate fi general (fungistatic) sau specific: levuristatic, bacteriostatic, în timp ce pentru dezinfectanţi efectul poate fi: microbicid (general), bactericid, virulicid, fungicid; ü puterea antiseptică – apreciază efectul substanţei chimice în raport cu o substanţă etalon stabilindu-se astfel o scară de apreciere. Ca substanţă etalon se foloseşte fenolul, cu stabilirea coeficientului fenolic. Puterea antiseptică este dependentă de acţiunea temperaturii şi anume cu creşterea temperaturii cu 10 grade a soluţiei dezinfectante puterea creşte de 20 ori; de aceea în industria alimentară dezinfecţia se face cu soluţii la temperaturi de 60-70°C când eficienţa este maximă. 14.1.7. Factori dependenţi de mediu Eficienţa substanţei chimice depinde de solubilitate şi de factorii care o influenţează. Substanţele chimice nu trebuie să reacţioneze cu componentele mediului. Multe substanţe cu efect antimicrobian nu pot fi folosite ca urmare a faptului că reacţionează cu protidele. De exemplu, clorul şi hipocloriţii îşi reduc efectul antiseptic dacă se introduc în ape cu grad ridicat de impurificare. Eficienţa substanţelor conservante poate creşte ca urmare a unui efect de sinergism, efect cooperant ce permite utilizarea în amestec a mai multor substanţe în concentraţii mai mici decât cele necesare pentru a avea aceeaşi eficienţă, la folosirea lor separată. 14.2. INFLUENŢA FACTORILOR INTRINSECI ASUPRA MICROORGANISMELOR Factorii intrinseci se referă la diferite componente şi structură a produselor alimentare care influenţează activitatea microorganismelor prezente pe/în produs. În funcţie de prezenţa concomitentă a mai multor factori, din totalul microorganismelor ce pot contamina produsul este favorizată activitatea unui număr restrâns, de obicei 1-4 specii care vor produce şi alterarea sa specifică. Produsele alimentare au o compoziţie chimică foarte diversificată şi un grad de încărcare cu microorganisme foarte diferit, ce depinde de acela al materiilor prime şi auxiliare, de factorii extrinseci ce intervin la prelucrare şi păstrare.

103


Dintre factorii intrinseci, dependenţi de alimentul care va reprezenta substratul pentru activitatea microorganismelor (adăugate prin culturile starter sau ocazional contaminante), mai importanţi sunt: 14.2.1.Compoziţia chimică a alimentelor Reprezintă un factor important deoarece microorganismele necesită pentru creştere surse de carbon, azot, substanţe minerale, factori de creştere şi apă disponibilă. Cu cât alimentul este mai complex cu atât asigură condiţii favorabile pentru creşterea mai rapidă, a unui număr mare de microorganisme şi este mai alterabil. Produsele alimentare lichide se alterează mai rapid decât cele solide pentru că celulele microbiene vin în contact direct cu nutrienţii solubili. Produsele vegetale (fructe, legume) cu un pH acid şi lipsite de vitamine din grupul B sunt alterate preferenţial de către mucegaiuri care nu necesită factori de creştere şi care produc enzime ce pot hidroliza poliglucidele din învelişul lor protector. Produsele bogate în glucide simple sunt de obicei fermentate cu formare de alcooli, acizi, încât prin scăderea de pH este inhibată activitatea bacteriilor de putrefacţie care necesită pentru dezvoltare pH neutru. Carnea ce conţine cantităţi importante de substanţe azotate având un pH apropiat de neutru va favoriza dezvoltarea bacteriilor de putrefacţie ce pot folosi protide ca sursă de azot. Alimentele ce conţin lipide vor fi alterate preferenţial de microorganisme producătoare de lipaze: Pseudomonas, Bacillus, Candida, Geotrichum, Aspergillus, Rhizopus etc. 14.2.2.Structura anatomică Influenţează activitatea microbiană ca urmare a menţinerii la distanţă a microorganismelor de nutrienţi accesibili. Astfel oul se alterează greu, deoarece coaja poroasă şi membrana împiedică pătrunderea unor microorganisme. Seminţele oleaginoase sau ale cerealelor prezintă un înveliş celulozic protector ce nu poate fi degradat decât de microorganisme celulozolitice. Prin absorbţia de apă, acestea suferă mucegăirea deoarece mucegaiurile au condiţii favorizante. La fructele cu înveliş ceros, greu penetrabil, alterarea intervine în zone unde se produc leziuni mecanice, înţepături de insecte etc. 14.2.3. Valoarea pH - lui Este o proprietate inerentă a unor produse naturale ce conţin cantităţi ridicate de acizi organici sau dobândesc aciditate prin procese fermentative dirijate (produse conservate prin murare). Microorganismele se dezvoltă în limite largi de pH (între 1,511). În acest interval microorganismele acidotolerante – drojdii, mucegaiuri, bacterii lactice şi acetice preferă pH 2,5-5,5 şi se vor dezvolta în produse acide care pot suferi fermentaţia şi mucegăirea. Bacteriile de putrefacţie care preferă un pH = 7 nu se pot dezvolta în medii acide care sunt astfel protejate. Acţiunea pH-ului asupra creşterii se poate observa în mediu, deoarece disponibilitatea unor nutrienţi este modificată de echilibrul ionic. Astfel la pH acid ionii de magneziu formează complexe insolubile, în timp ce la pH bazic sunt complexaţi ionii de calciu, zinc şi ionii ferici, elemente cu rol de cofactori ai enzimelor microbiene. Valori 104


extreme de pH influenţează permeabilitatea membranelor celulare. În mediu acid permeazele cationice sunt saturate de ioni de H+ care limitează sau anulează transportul cationilor indispensabili pentru celule; în mediu alcalin membrana este saturată cu OH- şi este împiedicat transferul de anioni necesari. La modificări de pH se modifică şi cinetica reacţiilor enzimatice care se desfăşoară optim la anumite valori specifice. Microorganismele patogene, de exemplu Clostridium sunt mai sensibile decât cele din genul Escherichia, Salmonella, Staphylococcus. Clostridium botulinum are pH-ul minim pentru producerea de neurotoxine egal cu 4,8, iar la Staphylococcus aureus pH minim pentru creştere este de 4,2. 14.2.4.Valoarea de rH Este dependentă de prezenţa în aliment a substanţelor cu caracter oxidant sau reducător. Alimentele cu potenţial de oxidoreducere scăzut (rH = 0-12),de exemplu laptele, favorizează dezvoltarea substanţelor anaerobe, în timp ce fructele cu rH ridicat (18,5 -28) favorizează dezvoltarea microorganismelor aerobe. Diverse lichide cu valori medii de rH (12-18,5) permit activitatea fermentativă a drojdiilor, bacteriilor lactice. 14.2.5.Indicele de activitate al apei (aw) Reflectă conţinutul de apă liberă din produsele alimentare pusă la dispoziţia microorganismelor pentru reacţii chimice, biochimice, transfer de metaboliţi prin învelişurile celulare. Domeniul general de aw pentru dezvoltarea microorganismelor este 0,62-0,99; cele mai pretenţioase sunt bacteriile care necesită cantităţi mari de apă liberă, în timp ce drojdiile osmotolerante şi mucegaiurile xerofite se dezvoltă la valorile minime ale domeniului. Între conţinutul de umiditate al produselor alimentare determinat prin uscare la etuvă la temperaturi de 105°C până la masă constantă şi indicele de aw nu se pot stabili relaţii de dependenţă. Este important de precizat că: · indiferent de temperatură, capacitatea microorganismelor de a creşte este redusă, când aw este scăzut; · domeniul de aw la care creşterea are loc este cel mai extins la temperatura optimă de creştere; · prezenţa nutrienţilor necesari în aliment creşte domeniul de aw în care microorganismele pot supravieţui. În general creşterea microbiană nu poate avea loc la aw mai mic sau egal cu 0,6, cu o stabilitate de 1 an la valori de 0,7 şi egală cu 6 luni la valori mai mari de 0,75, încât la valori peste 0,78 este probabilă alterarea rapidă. 14.2.6. Substanţe naturale cu efect antimicrobian. Unele produse vegetale folosite în alimentaţie conţin substanţe denumite fitoncide. Astfel ceapa conţine alicina, usturoiul – alil sulfonatul, de asemenea conţin fitoncide: hreanul, muştarul, cuişoarele, scorţişoara etc. Unele fructe pot conţine benzoat, salicilat (este cazul fructelor de pădure). În produse de origine animală, în ouă este prezent lizozimul, în lapte proaspăt este prezent pe lângă lizozim, lactenine, lactoperoxidază. Desigur că aceste substanţe au un 105


spectru specific şi pot influenţa numai activitatea microorganismelor sensibile. Preluare internet – pana aici

106


Bibliografie 1. Alexandru T. Bogdan, Tobă G.F., Ipate Iudith, Diaconescu D., Comşa Dana, Gruia R., Ciortea G., Burlacu R., Peticilă A., Covaci Brânduşa, Surdu I., Matiuti M., Prică I., Străteanu Amalia – Gianina, Petic Diana, Chelmu S., Tudor A., Puchianu G., Şonea C., Dancu V., 2012. Soluţii bioeconomice bazate pe biodiverditate agrosilvică pentru asigurarea independenţei şi suveranităţii agroalimentare durabile a României europene şi euroatlantice, 2012. Editura Libris Danubiu. ISBN 978-973-27-1802-5, E- mail: [email protected]. 2. Apostu S., 2006. Microbiologia produselor alimentare. Vol II, Editura Risoprint Cluj – Napoca. 3. Bârzoi D., Meica S., Neguţ M. 1999. Toxiinfecţii alimentare. Editura Diaconu Coresi, Bucureşti. 4. Bârzoi D., Apostu S., 2002. Microbiologia produselor alimentare. Editura Risoprint, Cluj Napoca. 5. Ivana Simona 2007. Microbiologie Medicală Veterinară, Vol I. Editura Ştiinţelor Medicale. 6. Ivana Simona, 2007. Microbiologie Medicală Veterinară, Vol II. Editura Asclepius. 7. Mteescu C., Nicolae I., Neguţ Lucia, Bălăucă N., Onac N., Nicolae F., 2006. Tratat de Siguranţă Alimentară. Editura Biotera Bucureşti. 8. Palmer S.R., Soulsby E.J.L., Simpson D.I.H., 2005. Zoonoze.Editura Ştiinţelor Medicale Bucureşti. Lucrare editată de Oxford Univerity Press. 9. Popa R., Lupescu C., Popovici A., Miliţă Nicoleta, Laurenţiu C., Ciupescu Veronica, 2012. Factori de contaminare a alimentelor. Revista Română de Medicină Veterinară , Vol. 22, nr. 1/2012. 10. Puchianu G. 2012. Criterii microbiologice de siguranţă alimentară şi igienă a prelucrării pentru alimentele de origine animală. Editura Universităţii Transilvania din Braşov. 11. Răpuntean G, Răpuntean S. 1999. Bacteriologie specială veterinară. Editura Tipo Agronomia, Cluj – Napoca. 12. Rusu L, Neagu M. 2011. Siguranţa Alimentelor – Calitatea Alimentelor. Editura Spiru Haret Iaşi. 13. Savu C., Georgescu Narcisa, 2004. Siguranţa Alimentelor. Editura Semne E, Bucureşti. 14. Ştirbu C., Turcu D., 1999. Noţiuni de bacteriologie. Editura Brumar Timişoara. 15. Tudor Laurenţiu., 2009. Controlul calităţii produselor agroalimentare. Editura Printech. 16. Turcu D., 2007. Bacteriologie Generală. Editura Fundaţiei România de Mâine. 17. Turcu D., 2004. Bacteriologie – Lucrări aplicative. Editura Fundaţiei România de Mâine.

107


18. Ordinul ministrului sănătăţii nr. 976/1998 pentru aprobarea Normelor de igienă privind producţia, prelucrarea, depozitarea, păstrarea, transportul şi desfacerea alimentelor. 19. Ordinul ANSVSA nr. 43/2012. Norme metodologice de aplicare a Programului acţiunilor de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, protecţia animalelor şi protecţia mediului, de identificare şi înregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor şi caprinelor pentru anul 2012 20. Regulamentul (CE) nr. 178/2002 al Parlamentului European şi al Consiliului din 28 ianuarie 2002 de stabilire a principiilor şi a cerinţelor generale ale legislaţiei în domeniul alimentelor, de înfiinţare a Autorităţii Europene pentru Siguranţa Alimentară şi de stabilire a procedurilor în domeniul siguranţei alimentelor. Adoptat la Bruxelles, 28 ianuarie 2002. 21. Regulamentul (ce) nr. 852/2004 al parlamentului european şi al consiliului din 29 aprilie 2004 privind igiena produselor alimentare 22. Regulamentului (CE) nr. 2073 / 2005 din 15 noiembrie 2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare publicat în Official Jurnal of the European Union. Realizat la Brussels, la 15 Noiembrie 2005. 23. Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei din 5 decembrie 2007 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare. 24. http://www.scribd.com/doc/49844277/MicrobiologiaProduselorAlimentaee (internet).

108

Microbiologie-generala-Curs.pdf

Recommend Documents