DETERMINACIÓN DE PESO SECO Y PESO HÚMEDO
PRACTICA Nº 2: DETERMINACIÓN DEL PESO SECO Y PESO HÚMEDO
I.
INTRODUCCIÓN
La centrifugación es un método que utiliza la propiedad de sedimentación de partículas con base en la masa de las moléculas para la separación de partículas de una solución. Una vez obtenido el lisado o homogenizado celular se ha de proceder a su fraccionamiento.
Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran.
Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones: sobrenadante (supernatant), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.
La fuerza centrífuga es aplicada a cada partícula de la muestra la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada.
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II.
OBJETIVOS •
III.
Determinar la concentración en peso húmedo y seco de una muestra desconocida. Determinar la cantidad de cel/ml en la solución, utilizando la cámara de Neubauer.
MARCO TEORICO
Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en: centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrífuga (de 15000 g a 600000 g). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En la ultracentrífuga, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos : Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.
Rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es típico de ultracentrífuga y se emplea en separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerador (por ej. de cloruro de cesio). •
Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las condiciones son: Volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear. •
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DETERMINACIÓN DE PESO SECO Y PESO HÚMEDO Naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas. •
•
Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro. La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF: relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresión siguiente:
RCF = 1.118 * 10 -5 * r * (rpm) 2 NOTA: Si usted desea conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la fórmula de fuerza de centrifugación relativa:
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Centrifugación diferencial La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de más tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad
SEDIMENTACIÓN La sedimentación es el transporte de partículas en un campo de fuerza de centrifugación. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromoléculas y organelos celulares. Coeficiente de sedimentación
Los principios básicos de la teoría de sedimentación, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentación de una esfera en un campo gravitacional, para así mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a través del líquido. Coeficiente de sedimentación 1 drS=-----X-----W2 r dt
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DETERMINACIÓN DE PESO SECO Y PESO HÚMEDO W: velocidad del rotor Dr/dt: índice de movimiento de dos partículas (cm/s) Velocidad de sedimentación
Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamente de la ultracentrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, (S). Los coeficientes de sedimentación son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10 -13s. De esta manera, una partícula cuyo coeficiente de sedimentación es medido en 10 -12s.= 10x10 -13s., es decir que tiene un valor de 10S. Una partícula en un campo gravitacional se comporta según la LEY DE STOKES .
Donde: V = velocidad de sedimentación d = diámetro de la partícula P = densidad de la partícula L = densidad del líquido = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional
Se cumple:
La velocidad de sedimentación es proporcional al tamaño de la partícula. La velocidad de sedimentación es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partícula. La velocidad de sedimentación es 0, cuando la densidad de la partícula igual a la densidad del medio circundante. La velocidad de sedimentación disminuye al aumentar la viscosidad del medio La velocidad de sedimentación aumenta al aumentar la fuerza del campo centrífugo. El coeficiente de sedimentación es una constante característica de cada organelo o macromolécula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor.
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El tiempo de centrifugación hasta la clarificación de una organela se define por: K T (horas)= --S Donde: S= coeficiente de sedimentación de la organela K= constante del rotor. (Depende del ángulo de inclinación del tubo de respecto al eje de rotación).
IV.
centrifugación con
PROCEDIMIENTO
Se utilizo un matraz en el cual se agregó 1 gr. de levadura en 100 ml de agua potable. Lugo se homogenizó y se preparó cuatro tubos de ensayo previamente rotulados y pesados en donde se adiciono 5 ml de la solución homogenizada a cada tubo. Luego se procedió a llevar a la centrifuga por un tiempo de 10 minutos a 500 rpm. Después del centrifugado se eliminó con mucho cuidado el sobrenadante. Una vez eliminado el sobrenadante se llevó a la estufa los 4 tubos de ensayo a una temperatura de 105 ºC por un tiempo de 2 horas. Luego de las 2 horas se volvió a pesar los tubitos y así poder hallar el peso del sedimentado por diferencia de pesos. Por último se procedió a realizar el conteo de las células existentes mediante el método de la cámara de neubauer.
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V.
RESULTADOS
CUADRO 1: CONTEO DE CELULAS EXISTENTES EN LAS MICROCELDAS
CUADRO 2: DATOS ESTADISTICOS OBTENIDOS DESPUES DEL RECUENTO EN EL MICROSCOPIO. N 1 2 3 4 Promedio C.V. D.S.
PESO TUBO
PESO HÚMEDO
PESO SECO
11.0014 8.6224 11.0392 10.4942
0.0113 0.0164 0.0169 0.0173
0.0098 0.0144 0.0144 0.0137
[cel/ml]
VELOCIDAD DE CENTRIFUGACIÓN v
=
2
rpm x( r )
r = distancia del brazo de la centrifuga
V= (500rpm)2x 8.6cm v v
=〈
500
rev
min
〉2 x
2π 1rev
x
min 60 seg
x (8.6cm ) x
1m 100
cm
= m / seg .
VI.
DISCUSIÓN
En el cuadro podemos darnos cuenta que los pesos finales no fueron similares, esto se puede deber a que la solución no fue homogenizada en su totalidad y eso dio como consecuencia que la cantidad de sedimentado en cada tubito de ensayo no sea el mismo. Este tipo de sedimentado que se dió es la Sedimentación por gravedad, según Tood, Stanford (1988) si la densidad de la partícula (ρ) es mayor que la densidad del disolvente (ρ o). Esto se puede deducir a partir del Principio de Arquímedes. Según este principio, cuando se sumerge un cuerpo en un fluido, el cuerpo experimenta una fuerza E (empuje) de sentido opuesto al Peso (P), que tiene igual valor que el peso del líquido que ha desplazado. Este principio, también conocido como la Ley de Hidrostática, se aplica a los cuerpos, tanto en flotación, como sumergidos y a todos los fluidos. El principio de Arquímedes también hace posible la determinación de la densidad de un objeto de forma irregular, de manera que su
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DETERMINACIÓN DE PESO SECO Y PESO HÚMEDO volumen no se mide directamente. Si el objeto se pesa primero en el aire y luego en el en agua, entonces la diferencia de estos pesos igualará el peso del volumen del agua cambiado de sitio, que es igual al volumen del objeto. Así la densidad del objeto puede determinarse dividendo el peso entre el volumen . La centrifugación impone gracias a la aceleración centrifuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partículas experimentan una aceleración que las obliga a sedimentar. La centrifugación puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analítica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que en la segunda se procede al análisis de las macromoléculas en una ultracentrifugación. Existen diversos métodos de centrifugación y una extensa variedad de técnicas derivadas de esta. El objetivo de la centrifugación es separar partículas de diferentes características. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración G.
VII.
CONCLUSIONES
VIII.
Se determinó la biomasa de la levadura mediante el método de peso seco.(utilizando la centrifuga) Determinamos la cantidad de cel/ml en la solución, utilizando la cámara de neubauer.
BIBLIOGRAFÍA
1.-Tood, Stanford. Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 1988. Salvat. Tomo I. Pág 14. 2.http://www.scribd.com/doc/13587987/Centrifugacion.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento. htm 3.-http://tecn.rutgers.edu/bio356/lectures/DNAprep.html 4.-http://ginger.cc.utexas.edu/ithk310/sedimentation.html
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