Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Ingeniería Bioquímica
Profesora: Larios Serrato Violeta Autor: Alonso Ruíz Carlos Alberto Colaboración: Estrada Buendía Víctor Jesús
Laboratorio de Mtodos de An!lisis
Pr!ctica: "eter#inación de $roteínas $or #todo de %L %Lo&r'( o&r'(
)ru$o: *+V,
-ec.a: //01*0/1,2
Introducción Este es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de proteínas. Se añade a la muestra un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lamert!"eer. Este método consta de dos etapas# 2
$% Los io i one s
+¿
Cu¿ , en medio alcalino se unen a las proteínas formando complejos con los 2
&tomos &tomos de nitrógeno nitrógeno de los enlaces peptídicos peptídicos.. Los complejos complejos
+ ¿− ¿ Cu¿
proteína tienen un
color a'ul claro. Esto provoca el desdolamiento de la estructura tridimensional de la proteína, 2
e(poniéndose los residuos fenólicos de tirosina que participan en la segunda etapa. El
+¿
Cu¿
se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato )% La reducción reducción del reactivo reactivo de *olin!+ioca *olin!+iocalteau lteau en medio medio &sico%, &sico%, por los grupos fenólicos fenólicos de los residu residuos os de tirosi tirosina, na, presen presentes tes en la mayorí mayoría a de las proteínas proteínas,, actuan actuando do el core core como como cata catalili'a 'ado dorr. El prin princi cipa pall cons constititu tuyyente ente del del reac reactitivo vo de *oli *olin! n!+i +ioc ocal alte teau au es &cid &cido o fosfomolidotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color a'ul intenso.
}
-lúmina# Es una proteína compuesta de $/ amino&cidos amino&cidos organi'ados en una cadena péptida simple, dolada sore sí misma en varias capas y con un peso molecular de .)01. La alumina provee presión osmótica, sirve de transporte a los nutrientes y protege al medio interno de sustancias to(ica.
Objetivos • • •
+onocer y comprender el método de Lo2ry para valoración de proteínas. +onstruir curva de caliración con solución de -lúmina por método de Lo2ry. +omprender el manejo del espectrofotómetro.
Resultados 1) CURVA DE CALIBRACI! CALIBR ACI! DE ALB"#I!A ALB"# I!A. Tabla 1. Curva de Calibración de Albúmina Tubo Cantidad de A 595 No. Proteína (ϻg/mL)
, / 6 * 2
/2 21 42 ,11 ,/2
13124 13156 13,2 13/ 13///
Promedio
131*5 13172 13,*8 13,7/ 13//
A 595
13126 13175 13,*7 13,5, 13//,
Ejemplo de conversión de solución de -lúmina de ml a 9g 3ara /.$ mL de -lúmina Si $ml!!!!!!!!!!!!!!/.)4 mg5ml /.$ml!!!!!!!!!!!!!!! ( 6 /./)4 mg5mL% $///% 6 )4 9g5mL +onstrucción de curva de caliración#
$r%&ica 1 +urva de caliración graficando en 789 promedio de A 595 cantid cantidad ad de de 3rote 3roteína ína 9g5mL%. g5mL%.
y en 7:9 datos de cantidad de
Cura de calibración de albú#ina $or #todo de Lo&r'
$r%&ica ' +urva de caliración con regresión lineal.
Cura de calibración de albú#ina $or #todo de Lo&r' f;<= > 1< ? 131, R@ > 1355
a% Ecuación de la curva curva de caliración# caliración#
y =0.0018 x + 0.009
;ónde# :# +antidad de proteína en 9g
/.//$1# La pendiente Sensiilidad del método%
8# La A 595 asorancia% /.//<# La ordenada al origen -sorancia con una concentración concentración de / de proteína 7asorancia del lanco9% % La curva curva de cali calirac ración ión cump cumple le con con la Ley Ley de "oug "ouger! er!"ee "eerr en un rang rango o de 4/ = $// 9g, visto en la gr&fica no. $
c% E(presión E(presión matem&tic matem&tica a para calcular calcular cantidad cantidad de proteína, proteína, a partir de la ecuación ecuación de la curva. x =
y −0.009 0.0018
') A!(LII E*AD+*ICO, Tabla . !"#lica$ #ara an%li$i$ e$tadí$tico. Tubo Cantidad de Proteína (ϻg/mL) No.
, / 6 * 2 8 4 7 5 ,1
13,/6 13,*/ 13,61 13,*2 13,/7 13,,7 13,6* 13,67 13,/* 13,*2
863666 463777 843/// 423222 883,,, 813222 853*** 4,3888 863777 423222
Ejemplo de c&lculo de cantidad de proteína# Empleando la ecuación# Sustituyendo valores de
x =( y −0.009 )/( )/ ( 0.0018 )
en y, se otiene para el tuo $ lo siguiente# x =( 0.123−0.009 )/( 0.0018)
x =63.333
y =0.1213
n
+&lculo de la media#
X ∑ =
i
x ‾ =
i
En E(cel
1
x ‾ =68.722
n X
n
+&lculo de desviación#
( ¿ ¿ i − x ‾ ) ∑ = i
1
n−1 S =√ ¿
X Sumatoria de ( ¿¿ i − x ‾ ) ² 6
¿
∑ ¿ 257.438 23677 23,88 ,32 83766 /38,, 73,88 134// /35** *3766 83766
+&lculo de varian'a#
/531*, /8385* /3/2 *8385* 837,4 88385* 132/, 73885 /6368, *8385*
S 2=( S )2
+&lculo de coeficiente de variación#
C . V =
S=
√
257.438
−1
10
S =5.348
S 2=( 5.348 )2
S 2=¿ '-,./11
S x 100 x ‾
%C.V =
5.348 68.722
C . V = 7.78
+&lculo de límites de confian'a de media polacional#
= x ‾ ±
ϻ
t vNC ∗S √ n
>alor >alor de t student con n 6 $/ y n = $% 6 < con <4? de confiailidad 6 ','.'
x 100
=68.722 ±
ϻ
( 2.262 )( 5.348 )
ϻ =68.722 ± 3.825
10 √ 10
=(64.897 −72.547 )
ϻ
Tabla &. !e$ultado$ de an%li$i$ e$tadí$tico
x ‾
S
S²
68.722
5.348
28.6011
%C.V
4347
ϻ
− 72.547
64.897
0) I!*ERER I!*E RERE!C E!CIA, IA, Tabla '. ecto de $u$tancia$ no #roteínica$ Tubo No.
ris ,MD $ 431
/
)licerol al , ;0= "eterHente co#ercial al , "odecil sulfato de sodio ;S"S= al , Icido triclocoactico ;CA= al 2 -enol al , Merca$toetanol al 13, ris ,MD $ ,1 rea al 2 N H ¿ S O al 6 ¿
* 2 8 4 7 5 ,1
Ti#o de intererencia generada
4,3,,,
Fo interGere
13,45
5*3***
$ositia
13,2*
713222
$ositia
13/6/
,/63777
$ositia
13,26
71
$ositia
,352, 13,67 13,61 13,,/
,1473777 4,3888 843/// 243///
$ositia Fo interGere Fo interGere neHatia
13,*/
463777
$ositia
*u$tancia
, 6
Cantidad de Proteína (ϻg/mL)
4
2
4
13,64
2) CO#3ARCIO! E!*RE #4*ODO DE LO5R6 6 BRADORD, BRADOR D, ;iferencias de e(actitud "radford referencia% y Lo2ry pruea%. 3rueba de la t
Ɖ=
∑ D
i
n
;onde Di= X prueba− X referencia
Tabla +. C%lculo de Di Cantidad de Proteína (ϻg/mL) Lo,r-
Cantidad de Proteína (ϻg/mL) radord
X prueba
X referencia
863666 463777 843/// 423222 883,,, 813222 853*** 4,3888 863777 423222
4638/, 28325* 753284 723/*6 8836/* 823/*6 8*341/ 46375, 7836/* 4435*2
Valor de la 7edia de Di 8
D media =
−52.242 10
Di
,13/77 ,43/56 //36*2 53877 13/,6 *3877 *34*, /3//2 //3*68 /3651
∑ ¿ −52.242
=−5.2242
D
Di
,13/77 ,43/56 //36*2 53877 13/,6 *3877 *34*, /3//2 //3*68 /3651
Di− Dmedia
2318* //32,4 ,43,/, *3*86 231,1 13268 53582 /3557 ,43/,/ /3766
¿
media
¿ ¿
/238*4 21431** /563,65 ,535/4 /23,15 13/74 5536,/ 73551 /583/22 731/4
∑ ¿ 1283.741
Valor de S D
D
¿
media ¿ i− D¿ ²
¿ ¿ ¿
n
∑¿ i −1
√ ¿
S D =¿
S D = √ 10−1 √ 10
1283.741 1283.741
S D =11.943
e calcula el valor de t8
n t calculada= Dmedia × √ S D
10 10 t calculada=−5.2242 × √
11.943
t calculada=−1.398
-l tener la t de student en talas con un nivel de proailidad de <4? se otiene t calculada< t vNC
t vNC =2.262
−1.398 < 2.262
@o e(iste diferencia significativa en e(actitud ;iferencias de e(actitud Lo2ry referencia% y "radford pruea%. 3rueba 9: de is;er S 2b ! calculada = 2 " ;onde S 2b > S2a Sa La varian'a en el método de Lo2ry fue de )1./$$ La varian'a en el método de "radford fue de $$A.<$A $$A.<$A ! calculada =
;e talas de otiene ! cr#tica =4.03
117.917 28.6011
$$A.<$A $$A.<$A B )1./$$
! calculada= 4.122
con < grados de liertad en numerador y denominador
! calculada > ! cr#tica 4.122 > 4.03 E(iste diferencia significativa en precisión
+omparación entre diversos métodos de determinación de proteínas.
#
Ventaja
CjeldaDl
-plicale a todo tipo de alimentos "arato Fétodo oficial para medir el contenido de proteína cruda
"iuret
H&pi H&pido do se se pued puede e comp comple leta tarr en menos de I/ minutos% Fétodo m&s simple de an&lisis de proteínas 3oc 3ocas as sust sustan anci cias as no prot protei eica cass interfieren con la reacción "iuret
Lo2ry
Fuy sensile Fenos afectado por la turide' de la muestra F&s específico que la mayoría de otros métodos
"iuret
Fét Fétod odo o r&pi r&pido do la la reac reacci ción ón se pued puede e comp comple leta tarr en ) minu minuto tos% s% Heproducile @o e(iste interferencia de cationes como C J , @a J, y Fg
cido icinconínico
Hea Heact ctiv ivo o m&s m&s esta estal le e que que el de Lo2ry
Desventaja Fide el nitrógeno org&nico total, no sólo el nitrógeno proteico +onsume mucDo tiempo al menos ) Doras para completarse% Gsa reactivos corrosivos Hequiere de ) = 0 mg de proteínas por pruea Las Las conc concen entr traci acion ones es alta altass de sale saless de amonio interfieren con la reacción ;ee ;ee esta estanda ndari ri'a 'ars rse e el colo colorr medi median ante te cantidades de proteínas conocidas El color color varias varias con difere diferente ntess proteín proteínas as mas que "iuret% Sac Sacar aros osa, a, líp lípidos idos,, uf uffers fers fosfa osfato to,, monosa monosac&ri c&ridos dos y De(oami De(oaminas nas interf interfier ieren en con la reacción -l -ltas tas conce oncent ntra raccione ioness de a'úc a'úcar ares es reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfDidrilo interfieren con la reacción El comple complejo jo proteí proteína!c na!colo olorant rante e formad formado o puede unirse a las celdas de cuar'o El El colo colorr varí varía a con con dife difere rent ntes es tipo tiposs de proteínas. La proteína est&ndar dee seleccionarse con mucDo cuidado K interferencia con detergentes El color no es estale con el tiempo, Se nece necesi sita ta cont contro rola larr cuid cuidad ados osam amen ente te el
ca%
Gltravioleta )1/nm
tiem tiempo po entr entre e el an&l an&lis isis is y la lect lectur ura a en asorancia. Los a'úcares reductores interfieren con la reacción. -lt -ltas as conc concen entr trac acio ione ness de sulf sulfat ato o de amonio Mnterfieren con la reacción. Los &cidos nucléicos tamién asoren en @o e(iste interferen interferencia cia del sulfato sulfato la región de )1/nm de amonio y otras sales uffer El conten contenido ido de amino& amino&cid cidos os arom&t arom&tico icoss Fétodo no destructivo difi difier ere e cons consid ider era ale leme ment nte e en vari varias as Gtili'ado en detección post! proteínas. columna de las proteínas La solución dee ser clara e incolora. la turide' puede producir resultados err&ticos Sal Sales es de uff uffer er y dete deterg rgen ente te no iónico no interfieren con la reacción +on +once cent ntra raci cion ones es del del medi medio o de reac reactitivo voss desn desnat atur ural ali' i'an ante tess no interfieren guanidina 0m!Dcl o urea Im%
Discusión En este método en ase a su fundamento, se oserva que a mayor concentración en la proteína de amino&cidos como tirosina amino&cido fenólico% aumenta la coloración a'ul con la reacción de *olin! +iocalteau. 3or lo que a mayor cantidad de proteína se lee una mayor asorancia. En cuanto a la curva de caliración se oservó en la gr&fica $, se cumple con la Ley de "ouguer!"eer en el intervalo de 4/ = $//% 9g donde se oserva oserva que la cantidad cantidad de proteína proteína es directament directamente e proporcional proporcional a la asorancia, los valores que quedaron fuera en la regresión lineal se deen a errores de medición del laoratorista que llevo llevo a cao el ensayo. La media estadística estadística otenida fue de 1.A4 9g que es aja a comparación comparación de los A4 9g esperados. esperados. En cuanto a las interferenc interferencias ias se otuvieron otuvieron interferencia interferenciass positivas, $ negativa y I que no interfieren, a lo cual se puede decir que aquellas que dieron interferencia positiva son soluciones que favorecen la reacción, llevando acao una mayor reducción con el reactivo de *olin!+iocalteau oteniendo una mayor coloración. En las prueas 7t9 de Student y 7*9 de *isDer se oservó que en cuanto a precisión el método de "radford es mejor, en cuanto a precisión al no e(istir diferencia diferencia estadística, la e(actitud es la misma misma para amos métodos.
Conclusión El método de Lo2ry es un método fotométrico fotométrico muy sensile sensile que oedece la 7Ley de "ouguer!"eer "ouguer!"eer9, 9, se caracteri'a por medir en el espectrofotómetro una asorancia a 4<4nm y $//?N, es un método altamente sensile en cuanto a precisión en comparación con "radford el segundo en es mejor. mejor.
Biblio=ra&>a CórdobaD +3 A3 ;// de Abril de /1,2=3 http://analisisinstrumentalmeh http://analisisinstrumentalmeh.wordpress .wordpress.com. .com. Kbtenido de
.tt$s:00analisisinstru#ental#e.3Gles3&ord$ress3co#0/1,,01*0anc6a,lisisdelas $rotec6adnas3$df "esconocido3 ;// de Abril de /1,2=3 http://catedras.quimica.unlp.edu.ar. Kbtenido de .tt$:00catedras3ui#ica3unl$3edu3ar0o60A$untes0Proteinas3$df RoasD A3 L3 ;// de Abril de /1,2=3 http://revistas.um.es/. Kbtenido de .tt$:00reistas3u#3es0analesu#ciencias0article0ie&-ile0,11*7,05272,
