PENENTUAN PROTEIN METODE LOWRY
SYAFIRA SALSABILA (G84130036) EMA LINDAWATI (G84110010)
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULT FAKULTAS MATEMATIKA MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PENDAHULUAN Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan bahkan terkadang terkadang dihubungkan dihubungkan oleh ikatan sulfida. sulfida. Selanjutnya Selanjutnya protein bisa mengalami pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bermacammacam. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier tersier,, dan struktu strukturr kuarte kuartener ner.. Strukt Struktur ur primer primer merupa merupakan kan struktu strukturr yang yang sederh sederhana ana dengan urutan-urutan asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai. Struktur primer terbentuk melalu melaluii ikatan ikatan antara antara gugus gugus αami αamino no dengan dengan gugus gugus αkarb αkarboks oksil. il. !katan !katan terseb tersebut ut dinama dinamakan kan ikatan ikatan peptid peptidaa atau ikatan ikatan amida amida "#erg "#erg et al. $%%&'. $%%&'. Struktur ini dapat mene menent ntuk ukan an urut urutan an suat suatu u asam asam amin amino o dari dari suat suatu u poli polipe pept ptid idaa "(o "(oet ) *udi *udith th + +'. '. Stru Strukt ktur ur seku sekund nder er meru merupa paka kan n kom kombina binasi si anta antara ra stru strukt ktur ur prim primer er yang ang linear distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus /0 dan 12 di sepanjang tulang belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder sekunder adalah α-heliks dan 3-pleated. Strukt Struktur ur ini memilik memilikii segmensegmen-segm segmen en dalam dalam polipe polipeptid ptidaa yang yang terlilit terlilit atau atau terlipa terlipatt secara berulang "Khopkar $%%4'. Struktur tersier dari tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara a ntara rantai samping sa mping "gugus 5' berbagai asam amino. Struktur ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial antar s truktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni ikatan hidrogen, ikat ikatan an ioni ionik, k, ikata ikatan n ko6a ko6alen len,, dan dan ikata ikatan n hidr hidrof ofob obik ik.. 7alam 7alam stru strukt ktur ur ini, ini, ikata ikatan n hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik akan akan berika berikatan tan di bagian bagian dalam dalam protein protein globul globuler er yang yang tidak tidak berika berikatan tan dengan dengan air, air, sementa sementara ra asam amino amino yang yang bersifa bersifatt hodrof hodrofili ilik k secara secara umum umum akan akan berada berada di sisi sisi permukaan luar yang berikatan dengan air di sekelilingnya sekelilingnya "8urray et al $%%'. $%%'. Struktur kuarterner ada kuarterner adalah lah gambara gambaran n dari dari pengat pengaturan uran sub-un sub-unit it atau promot promoter er protein protein dalam dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks yang fungsional. ikatan yang berperan dalam struktu strukturr ini adalah adalah ikatan ikatan nonko6 nonko6ale alen, n, yakni yakni interak interaksi si elektr elektrosta ostatis, tis, hidrog hidrogen, en, dan hidrof hidrofobi obik. k. Protein Protein dengan dengan struktu strukturr kuarte kuarterner rner sering sering disebu disebutt juga juga dengan dengan protein protein multimerik. *ika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik "9odish et al . $%%:'. 8etode 8etode 9owry 9owry merupa merupakan kan pengem pengemban bangan gan dari dari metode metode #iuret #iuret.. Prinsi Prinsip p kerja kerja $; ; metode metode 9owry 9owry adalah adalah reduk reduksi si /u "reag "reagen en 9owry 9owry #' menj menjad adii /u oleh tirosin, tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. 7alam metode ini terlibat $ reaksi. Awalnya Awalnya,, kompleks kompleks /u"!!'-prote /u"!!'-protein in akan terbentuk terbentuk sebagaimana sebagaimana metode metode biuret yang dalam suasana alkalis /u"!!' akan tereduksi menjadi /u"!'. !on /u ; kemudian akan meredu mereduksi ksi reagen reagen
resid residu u tyro tyrosin sinee dan dan trypt tryptop opha han n dalam dalam prot protei ein n "9owry "9owry et al. al. ++ ++'. '. 5eak 5eaksi si ini ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara %% 4% nm, tergantung sensiti6itas yang dibutuhkan. Akan muncul muncul puncak kecil di sekitar %% nm nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 4% nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi konsentrasi rendah. !nilah yang menyebabka menyebabkan n penentuan penentuan kadar protein protein metode metode 9owry dapat dapat dilaku dilakukan kan di dua dua panjang panjang gelomb gelombang ang spektr spektrofo ofotom tometer eter.. =arna arna yang yang diserap diserap maksimum oleh larutan pada panjang gelombang %% nm adalah warna hijau kebiruan atau hijau dengan warna komplementernya merah atau ungu-kemerahan "5ahayu $%%'. =arna =a rna yang terlihat pada larutan adalah tidak berwarna. Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode 9owry , yaitu , yaitu dengan metode spektrofotometri menggunakan kur6a standar.
METODE B!" #" A$%
Alat-al Alat-alat at yang yang dipaka dipakaii yaitu yaitu tabung tabung reaksi reaksi,, pipet pipet 8ohr, 8ohr, bulb, Spectro UV-VIS Genesys 10 UV , Vortex Vibrifix Vibrifix VFI electronic ele ctronic.. #ahan yang digunakan adalah akuades, #SA, protein sampel, reagen /, dan reagen 7. P&'#*& P"$+%+" P,-*%" K*&. S%"#&
Sebanyak 4 buah tabung reaksi yang bersih dan kering disiapkan dan diberi labe l %, $%, >%, &%, +%%, +$%, +>%. 9arutan standar % ?g@ml dibuat dari +% ml akuades. 9arutan standar $% ?g@ml dibuat dari %,$% ml #SA yang diencerkan dengan ,% ml akuades. 9arutan standar >% ?g@ml dibuat dari %,>% ml #SA yang diencerkan dengan ,&% ml akuades. 9arutan standar &% ?g@ml dibuat dari %,&% ml #SA yang diencerkan dengan ,>% ml akuades. 9arutan standar +%% ?g@ml dibuat dari +,%% ml #SA yang diencerkan dengan ,%% ml akuades. 9arutan standar +$% ?g@ml dibuat dari +,$% ml #SA yang diencerkan dengan ,% ml akuades. 9arutan standar +>% ?g@ml dibuat dari +,>% ml #SA yang diencerkan dengan ,&% ml akuades. Setiap larutan tersebut dihomogenkan dengan (orteB kemudian dipindahkan sebanyak + ml ke dalam masing-masing tabung berlabel sesuai dengan konsentrasinya. 9alu ml reagen / ditambahkan ke dalamnya dan diinkuba diinkubasi si selama selama +% menit, menit, ditamb ditambahk ahkan an %, ml reagen reagen 7 ke dalamn dalamnya ya dan diinkubasi kembali selama :% menit. Kemudian nilai a bsorbansi tiap tabung dibaca pada panjang gelombang %% nm nm dan dicatat hasil pembacaannya. P""%*" K'""%&+ P&'%+" S,/$
Sebanyak : buah tabung bersih dan kering disiapkan dan diberi label +, $, :. Cabung + diisi dengan + ml protein sampel, sedangkan tabung $ dan : diisi dengan protein sampel yang diencerkan terlebih dahulu. Sebanyak ml protein sampel dien diencer cerka kan n deng dengan an ml air, air, diho dihomo moge genk nkan an deng dengan an meng menggu guna naka kan n (orteB rteB dan dan dipindahkan ke dalam tabung $ sebanyak + ml. Kemudian sebanyak $,% ml protein sampel diencerkan dengan 4,% ml air, dihomogenkan dengan menggunakan Vortex dan Vortex dan
dipindahkan ke dalam tabung : sebanyak + ml. 7isediakan juga tabung berisi + ml akuades sebagai blangko. 9alu larutan pada setiap tabung ditambah ml reagen /, diinkubasi selama +% menit, ditambah %,% ml reagen 7 dan diinkubasi kembali selama :% menit. Kemudian Kemudian nilai absorbansi absorbansi tiap tabung tabung dibaca dibaca pada panjang gelombang gelombang %% nm dan dicatat hasil pembacaannya. ": enter'
HASIL DAN PEMBAHASAN Cabel Cabel + 2asil pengukuran pengukuran absorbansi deret standar standar protein protein "#SA' metode 9owry pada panjang gelombang %% nm nm No. Nama sampel Konsentrasi Abso Ab sorba rbans nsii Abso Ab sorba rbans nsii (µg/mL) terkoreksi 1 Standar 1 (blangko) 0 0 .0 3 5 0 2 Standar 2 20 0 .0 3 3 0!002 3 Standar 3 "0 0 .0 " # 0!013 " Standar " $0 0 .0 5 2 0!01% 5 Standar 5 10 0 0 .0 5 # 0!023 $ Standar $ 12 0 0 .1 0 & 0!0%" % Standar % 1" 0 0 .0 $ $ 0!031 /ontoh Perhitungan D Absorbansi terkoreksi
Absorbansi sampel Absorbansi blangko %.%:: %.%: - %.%%$
Pengenceran E#SAF ?g@ml E#SAF stok + g@ml +%%% ?g@ml 1+ +%%% ?g@ml 1$ $% ?g@ml ($ +% ml (+ B 1+ ($ B 1$ V2 x N2
(+
N1
10 ml x 20 µg/ml 1000 µg/ml
%.$% ml *adi, %.$% ml +%%% ?g@ml ditera dengan akuades ".% ml' sampai total +%.%% ml.
0.0# 0.0% 0.0$ 0.05 Absorbansi
'() 0 0 *+ 0.$1
0.0" 0.03 0.02 0.01 0 0.01
0
20
"0
$0
#0
100
12 120
1" 1"0
1$ 1$0
Konsentrasi (µg / mL)
Gambar + 2ubungan antara konsentrasi protein dalam dalam ?g@m9 dengan absorbansinya absorbansinya pada spektrofotometer H(-(!S H(-(!S Genesys +% H( dengan panjang gelombang nm.
Cabel Cabel $ 2asil pengukuran pengukuran absorbansi absorbansi protein protein sampel metode #radford #radford pada panjang gelombang %% nm *atarata Absorban Absorban Konsentra No Nama ,langa Absorban si si si rotein . Sampel n si -erkoreks -erkoreks -erkoreks -erkoreks (µg/ml) i i 1 lanko 1 0 .0 5 0 0 0 0 2 0 .0 5 0 0 2 Sampel 1 0 .1 0 1 0.051 1 2 0 .1 2 " 0.0%" 0 .0 $ 25 1$5.5 (1 ml) 3 Sampel 1 0 .0 $ " 0.01" 2 2 0 .0 % 5 0.025 0 .0 1 &5 11$.0 (0.50 ml) " Sampel 1 0 .0 5 3 0.003 3 (0.25 2 0 .0 5 3 0.003 0.003 $%.0 ml) /ontoh Perhitungan Absorbansi terkoreksi
Absorbansi sampel Absorbansi blangko %.+%+ %.%% %.%+ 5ata-rata Absorbansi terkoreksi Absorbansi terkoreksi U1 – Absorbansi terkoreksi U2 2
0.051 – 0.074
2
%.%&$ y a ; bB I B Konsentrasi protein, y 5ata-rata absorbansi terkoreksi y %,%%%>B - %,%%:4 5ata-rata A terkoreksi intersep ; slope . Konsentrasi protein Rata-rata A terkoreksi terkoreksi - interse Konsentrasi protein sloe
(−0.00"7 )
0.0!25 –
0.0004
+&. ?g@ml Kons Konsen entr trasi asi prot protein ein sebe sebena narn rnya ya
Konse Konsent ntras rasii pro prote tein in B
Prinsip kerja metode 9owry adalah reduksi /u $; "reagen 9owry #' menjadi /u ; oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. !on /u ; bersama dengan fosfot fosfotung ungstat stat dan fosfom fosfomoli olibda bdatt "reagen "reagen 9owry 9owry J' memben membentuk tuk warna warna biru biru karena karena mengha menghasil silkan kan hetero heteropol poly-m y-moly olybde bdenum num blue blue akibat akibat reaksi reaksi oksida oksidasi si gugus gugus aromati aromatik k terkatalis /u, sehingga dapat menyerap cahaya "9owry dkk ++'. Panjang gelombang %% nm merupakan panjang gelombang maksimal dimana serapan optimal sehingga absorbansi dapat dibaca pada spektrofotometer H(-(!S H(-(!S "!rwan -'. 7alam percobaan ini, dilakukan dua macam perlakuan, yaitu membuat larutan standar dan protein sampel. 7ua macam larutan ini sama-sama diberikan reagen /, diinkubasi +% menit, diberikan reagen 7, dan diinkubasi :% menit. B - %,%%:4 dengan nilai 5 hanya sebesar %.&%&>. #erdasarkan teori, semakin besar konsentrasi larutan uji, maka semakin besar pula nilai absorba absorbansi nsiny nyaa "Khopk "Khopkar ar $%%4'. $%%4'. 2asil 2asil penguk pengukura uran n absorb absorbansi ansi deret deret standar standar protein protein meto metode de 9owry 9owry pada pada panj panjan ang g gelo gelomb mban ang g %% %% nm dapa dapatt dili dilihat hat di Cabel abel +. 1ila 1ilaii absorbansi yang didapatkan tidak selalu berbanding lurus dengan konsentrasi larutan sehingga dapat dikatakan percobaan kurang sesuai dengan teori. 2al ini berpengaruh
pada koefisien korelasi "r' yang didapatkan. 1ilai regresi standar "r' yang didapatkan cukup kecil, yaitu %.444 L berada jauh di luar standar minimal yang besarnya %. L. 1ilai ini menunjukkan rendahnya ketepatan percobaan atau adanya penyimpangan selama percobaan yang mungkin disebabkan oleh kesalahan yang berasal dari praktikan. Kesalahan yang mungkin terjadi adalah kesalahan dalam pengenceran protein #SA, biasanya dalam hal 6olume #SA yang digunakan. Selain itu, praktikan kurang cermat dala dalam m meng menggu guna naka kan n kada kadarr reag reagen en / dan dan kada kadarr reag reagen en 7, sert sertaa laru laruta tan n yang yang terkontaminasi. 2asil 2asil penguk pengukura uran n absorb absorbans ansii protei protein n sampel sampel metode metode 9owry 9owry pada pada panjang panjang gelombang gelombang %% nm dapat dilihat dilihat di Cabel Cabel $. 7ata yang diperoleh diperoleh menunjukkan menunjukkan bahwa nilai absorbansi semakin meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi protein sampel sampel pada pada setiap setiap tabung tabung.. 7engan 7engan demiki demikian, an, dapat dapat disimp disimpulk ulkan an bahwa bahwa semakin semakin banyak 6olume protein sampel dalam campuran, jumlah protein yang terlarut akan semakin sedikit, sehingga nilai absorbansinya semakin besar. Cabung + berisi % ml protein sampel berfungsi sebagai blangko dan memiliki nilai absorbansi terukur % dan konsentrasi protein % ?g@ml, tabung $ berisi Sampel + dengan kadar protein +%% L dalam dalam campu campuran ran memi memili liki ki ratarata-rat rataa nila nilaii abso absorb rban ansi si terko terkorek reksi siny nyaa %.%& %.%&$ $ dan dan konsentrasi protein +&. ?g@ml, tabung : berisi Sampel $ dengan kadar protein % L dalam dalam campu campuran ran memi memili liki ki ratarata-rat rataa nila nilaii abso absorb rban ansi si terko terkorek reksi siny nyaa %.%+ %.%+ dan dan konsentrasi konsentrasi protein ++&.% ++&.% ?g@ml, tabung > berisi Sampel : dengan dengan kadar protein protein $ L dalam dalam campur campuran an memilik memilikii rata-rat rata-rataa nilai nilai absorb absorbans ansii terkor terkoreks eksiny inyaa %.%%: %.%%: dan dan konsentrasi protein &4.% ?g@ml. 2asil percobaan sesuai dengan teori bahwa semakin sedikit kadar protein yang terlarut, semakin kecil nilai absorbansinya "Khopkar $%%4'.
SIMPULAN DAN SARAN S+,/*$"
Kadar protein dari suatu sampel bisa ditentukan dengan beberapa metode, salah satunya satunya metode metode 9owry. 9owry. 8etode 8etode 9owry menggunakan menggunakan prinsip prinsip spektrofotom spektrofotometri etri untuk untuk meli meliha hatt nila nilaii abso absorb rban ansi si dan dan hubu hubung ngan anny nyaa deng dengan an kada kadarr prot protei ein n hete hetero ropo poly ly-molybdenum blue yang dihasilkan. Konsentrasi protein sampel dapat ditentukan setelah membuat kur6a standar dari percobaan. #erdasarkan data dan hasil percobaan, dapat disimpulkan bahwa semakin besar konsentrasi protein dalam sampel, semakin tinggi nilai absorbansinya. S&"
Sebaiknya alat spektrofotometer disediakan lebih dari satu sehingga praktikan tidak menunggu lama untuk menggunakannya setelah menyiapkan sampel yang akan diukur absorbansinya.
DAFTAR PUSTAKA #erg, *.8., *.9. CymocMko, CymocMko, and 9. Stryer. $%%&. Biochemistry $%%&. Biochemistry 5th ! . 1ew Nork "HSA'D =.2. 5ahayu A, Suranto, Purwoko C. $%%. Analisis karbohidrat, protein, dan lemak pada pembuatan kecap lamtoro gung " e"caena le"cocephala/ terfermentasi sperill"s oryae. oryae. Biote$noloi. $"+'D +>-$%. 5ohman. $%%4. 'imia $%%4. 'imia Farmasi nalisis nalisis.. Nogyakarta Nogyakarta "!7'D Pustaka Pelajar (oet 7. ) *udith G. (oet. +. #iochemistry $nd edition. 1ew Nork "HSA'D *ohn =iley ) Sons, !nc. p. 4-$$
9ampiran + 5ancangan kerja Penentuan Protein 8etode 9owry
